全 文 ：第20卷 第4期
Vol.20 No.4
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2012年 7月
Jul. 2012
多年生黑麦草高频再生体系的建立
及农杆菌介导PEPC基因的转化
李 蔚,张 娜,李 仁,赵 冰,郭仰东*
(中国农业大学农学与生物技术学院,北京 100193)
摘要:以多年生黑麦草(LoliumperenneL.)成熟种子作为外植体,建立其高频再生体系,通过农杆菌介导法将磷酸
烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因转入,为多年生黑麦草的抗逆转基因工作奠定基础。结果表明:种子充分灭菌后
在附加6.0mg·L-12,4-D的培养基中诱导愈伤组织,诱导率可达61.33%。愈伤组织在2,4-D浓度减半的培养
基上继代培养长势良好,分化培养基为 MS培养基附加1.0mg·L-16-BA,分化率最高达到61.33%,在1/2MS+
0.5mg·L-1NAA培养基中进行生根培养,生根率达100%。以该再生体系为基础,将获得的愈伤组织作为外植
体进行遗传转化,经筛选培养后得到再生植株,通过PCR及实时荧光定量(Real-Time)PCR验证表明PEPC基因
已成功转入,转化率为8.67%。试验结果将为多年生黑麦草抗性品种的研究奠定基础。
关键词:多年生黑麦草;胚性愈伤组织;植株再生;磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因;遗传转化
中图分类号:Q943.2 文献标识码:A 文章编号:1007-0435(2012)04-0747-06
EstablishmentofHighEfficientRegenerationSystemofPerennialRyegrassand
PEPCGeneTransformationMediatedbyAgrobacteriumtumefaciens
LIWei,ZHANGNa,LIRen,ZHAOBing,GUOYang-dong*
(ColegeofAgricultureandBiotechnology,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100193,China)
Abstract:Inordertoestablishahighlyefficientregenerationandtransformationsystemofperennial
ryegrass(LoliumperenneL.),itsmatureseedswereusedasexplants.Resultshowedthatthebestinduc-
tionratewas61.33%.Calusdifferentiatedafter2~3generation.Theoptimummediumforcalusdiffer-
entiationwasMS+6-BAat1.0mg·L-1with61.33%regenerationrate.Thebestmediumforrooting
was1/2MS+NAAat0.5mg·L-1andtheratioofrootingwas100%.Basedonthisregenerationsys-
tem,theembryoniccaluscelswereusedforAgrobacterium-mediatedtransformation.Transformedtis-
sueswereregeneratedwithmediacontaininghygasaselectivesolvent.PCRandReal-TimePCRanalysis
oftransformantsshowedthatPEPCgenewassuccessfulyintegratedintothegenomeofperennialryegrass
andtransformationratewas8.67%.
Keywords:Perennialryegrass(LoliumperenneL.);Embryogeniccalus;Plantregeneration;PEPC
gene;Transformation
多年生黑麦草(LoliumperenneL.)又名宿根
黑麦草,属禾本科黑麦草属(LoliumL.)。原产于
南欧、北非和亚洲西南部,是欧洲、新西兰、澳大利
亚、北美的优良草种[1]。上世纪50年代作为优质牧
草被引进我国,具有叶片光滑柔软、色泽美丽和绿期
长等优点,是我国长江以北温带地区最重要的草种
之一,因为其建植速度快,分蘖能力强,在城市绿化
和运动场建设中被广泛应用[2]。我国草坪业近年来
发展迅速,但是目前引种仍然是解决我国草坪业对
新品种需求问题的主要途径,选育开发出适应各地
自然栽培条件的高抗品种是提高草坪草抗性的根本
措施。通过基因工程手段对草坪草的抗性进行改良
是较快捷且有效的方式,基因枪法一直以来都
是广泛应用于禾本科作物基因转化的重要方法,国
收稿日期:2012-02-14;修回日期:2012-03-27
基金项目:“十二五”国家科技支撑计划“优质多抗牧草新品种选育与良种繁育关键技术研究与示范”(2011BAD17B01);国家自然科学基
金项目(31171989);中央高校基本科研业务专项(2009-2-06)资助
作者简介:李蔚(1987-),女,吉林白山人,硕士研究生,研究方向为植物遗传育种与生物技术,E-mail:liwei2010cau@sina.cn;*通信作者
Authorforcorrespondence,E-mail:yaguo@cau.edu.cn
草 地 学 报 第20卷
内外均已建立起高效的多年生黑麦草基因枪遗传转
化体系[3-6]。与基因枪法相比,农杆菌介导法有利于
低拷贝数目整合到植物基因组,近年来关于农杆菌
介导法转化多年生黑麦草的研究也已经开展[7-11],
但大部分多年生黑麦草的再生频率及农杆菌介导转
化频率均不高[12-13]。如在研究旋风和百尼牡2个品
种的再生及转化试验中,愈伤组织诱导率和分化率
分别为16.3%和38.8%,转化甜菜碱醛脱氢酶
(BADH)基因时,转化率为5.65%[14]。高频的再生
体系是遗传转化成功的关键因素,且基因型可影响多
年生黑麦草的愈伤诱导率和转化植株的再生能
力[15-16]。因此本文以多年生黑麦草种子为起始材料
建立高效的再生途径,愈伤组织诱导率及分化率均达
到60%以上,并以此为基础将磷酸烯醇式丙酮酸羧
化酶(PEPC)基因成功转入,磷酸烯醇式丙酮酸羧化
酶是C4植物光合作用关健酶,在干旱、高温、衰老、强
光等逆境胁迫下有改善光合作用的效果,将其转入可
为多年生黑麦草的抗逆转基因工作奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
本研究所用植物材料为多年生黑麦草“11-18”
的成熟种子,购自北京百绿公司。质粒 pCAM-
BIA1301由中国农业科学院赵明研究员惠赠,携带
由Ubiquitin 启动子启动的稗草(Echinochloacrus-
galliL.)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因,
以抗潮霉素(hyg)基因作为筛选标记基因。
1.2 愈伤组织诱导和继代培养
黑麦草种子置于50%硫酸中震荡20min后,
用流水冲洗至无硫酸残留,此过程可将种子去颖。
于超净工作台中将去颖后的种子置于75%的酒精
中30s,弃去酒精后用无菌水冲洗种子表面1~2
次,然后用0.1%的HgCl2 消毒90s,期间不断震荡
以确保HgCl2 与种子充分接触,用无菌水冲洗5~7
次,吸干水分用解剖刀在种子表面划一伤口后用于
接种。
将处理好的黑麦草种子接种到含有不同激素处
理的诱导培养基上,以 MS培养基为基础培养基,添
加0.05mg·L-16-BA,300mg·L-1水解酪蛋白,
30g·L-1蔗糖,并附加不同浓度2,4-D (分别为
2.0,4.0,6.0,8.0,10.0mg·L-1),pH 值调至6.0。
每个处理30个外植体,设5个重复。一周后,将部
分种子萌发长出的叶片用剪刀全部剪掉,以防止其
消耗培养基养分。30d后统计诱导率。愈伤组织
诱导率=(出愈数/接种种子数)×100%,愈伤组织
诱导的培养条件为白天温度 (25±2)℃,夜晚温度
(20±2)℃,黑暗培养。
将诱导出来的愈伤组织转接到继代培养基,继代
培养基附加不同浓度的2,4-D(分别为1.0,3.0,6.0
mg·L-1),其他条件不变。每30d继代1次,连续继
代2次后,比较继代前后愈伤组织的大小和形态变
化。愈伤组织的继代培养环境与诱导环境相同。
1.3 愈伤组织分化培养和生根培养
将继代生长良好的胚性愈伤组织转移到不同激
素处理的分化培养基中,以 MS培养基为基础培养
基,添加不同浓度的6-BA (分别为0.5,1.0,2.0
mg·L-1),pH 值调节至6.0,每个处理15块愈伤
组织,且每个处理至少设4个重复。继代培养周期
为20d,连续继代2次后统计芽的分化率。愈伤组
织分化率=(有芽点形成的愈伤组织数/接种的愈伤
组织总数)×100%,愈伤组织的分化培养条件为白
天温度(25±2)℃,夜晚温度(20±2)℃,光照强度
2000~2500lx,光周期为16h·d-1。
当再生不定芽长至2~3cm时,接种到1/2MS
+0.5mg·L-1NAA培养基中,20d后统计根的
诱导情况。生根率=(有根形成的不定芽/接种的不
定芽总数)×100%。待生根的试管苗长至7~8cm
左右时,打开瓶口炼苗2~3d,洗净根部琼脂,移栽
至草炭∶蛭石=1∶1的基质中,温室培养。生根培
养及移栽后环境同分化环境。
1.4 农杆菌介导的遗传转化
选择颜色鲜黄、生长旺盛且结构密实的胚性愈伤
组织,于含有稗草PEPC基因的农杆菌菌液中(OD600
=0.2-0.5)浸染10~15min,用灭菌滤纸吸干愈伤
组织表面的菌液,转移干燥愈伤组织于共培养基(MS
+0.05mg·L-16-BA+3.0mg·L-12,4-D+300
mg·L-1水解酪蛋白+100μmol·L-1乙酰丁香酮,
pH6.0)上,暗培养48h后,将共培养的愈伤组织用
含有羧苄青霉素(Carbenicilin,400mg·L-1)的无菌
水漂洗2~3次,吸干水分,转移到选择诱导培养基
(MS+0.05mg·L-16-BA+3.0mg·L-12,4-D+
300mg·L-1水解酪蛋白+40mg·L-1潮霉素+400
mg·L-1羧苄青霉素,pH6.0)上,暗培养30d。挑选
新生的愈伤组织接种于抗性愈伤分化培养基(MS+
847
第4期 李蔚等:多年生黑麦草高频再生体系的建立及农杆菌介导PEPC基因的转化
1.0mg·L-16-BA+40mg·L-1潮霉素+400mg·L-1
羧苄青霉素,pH6.0)上,白天温度(25±2)℃,夜晚温度
(20±2)℃,光照强度2000~2500lx,光周期为16h·
d-1。培养30~40d后,再生的小苗转移到抗性苗生根
培养基(1/2MS+0.5mg·L-1NAA+40mg·L-1潮霉
素,pH6.0)上进行生根培养,20d后将再生苗移栽至草
炭∶蛭石=1∶1的基质中,温室培养。
1.5 转化植株PCR检测
用CTAB法提取转化株叶片 DNA,用引物S
hyg(5′-AAAAAGCCTGAACTCACCGC-3′)和A
hyg (5′-ACTTCTACACAGCCATCGGT-3′)扩增
潮霉素抗性基因标记基因hyg的PCR检测,扩增
程序为:94℃ 3min,94℃ 40s,55℃ 50s,72℃
1min,扩增30个循环,72℃延伸10min。产物经
1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测。
1.6 转化植株目的基因表达的Real-TimePCR检测
随机抽取PCR验证呈阳性的6个转基因株系,
进行实时荧光定量PCR测定。植物RNA提取、反
转录试剂盒以及荧光染料均购自康为世纪公司(北
京)。根据PEPC基因的序列,设计引物Fppc(5′-
TATGCTGAGTGGTCGGAGGAGAAACG-3′),Rppc
(5′-TTGGGAGCTCTGCGAGGACATGAAA-3′)。
试验操作按产品说明书进行,用ROCHE480Ⅱ型
荧光定量PCR仪,采用2-△△CT法进行数据的相对
定量分析。
1.7 数据处理
使用 Excel2010 软件进行数据处理,使用
SPSS17.0软件进行方差分析和相关性分析。
2 结果与分析
2.1 2,4-D浓度对黑麦草愈伤组织诱导和培养
效果的影响
约有50%的种子在接种2d后开始有芽及毛状
根出现,7d左右种子划伤处开始出现愈伤组织,10
d后大部分种子开始在盾片处长出白色水浸状的愈
伤组织,说明划伤种子对愈伤组织的诱导有促进作
用,及时剪掉芽和毛状根,防止培养基养分流失。
试验结果表明,2,4-D浓度对愈伤组织诱导影
响较大,当2,4-D浓度为2.0mg·L-1时,愈伤组织
诱导率只有10.67%,随着2,4-D浓度的增加,出愈
率也提高,当2,4-D浓度为6.0mg·L-1时,61.33%
的种子形成愈伤组织,而此时再加大2,4-D浓度,出
愈率开始下降,如表1所示,所以适合该品种的愈伤
组织诱导的2,4-D浓度为6.0mg·L-1。
表1 2,4-D浓度对愈伤组织诱导影响
Table1 Effectsofdifferentconcentrations
of2,4-Doncalusinduction
2,4-D浓度/mg·L-1
2,4-Dconcentration
接种数
Numberof
inoculatedexplants
出愈数
Number
ofcalus
出愈率
Rateof
calus/%
2.0 150 16 10.67±2.59dD
4.0 150 42 39.33±3.65cC
6.0 150 110 61.33±3.80aA
8.0 150 74 49.33±2.79bB
10.0 150 59 39.33±2.79cC
注:每个处理设置5个重复,表中不同小写字母表示α=0.05水平上差异
显著,不同大写字母表示α=0.01水平上差异极显著。下同
Note:Fivereplicationspertreatmentwereused,differentsmallettersineach
rowindicatesignificantdifferenceatthe0.05level,anddifferentcapitallettersin
eachrowindicatesignificantdifferenceatthe0.01level.Thesameasfolows
在黑麦草继代培养过程中,刚诱导出的愈伤组
织松软,需要进行继代培养,表2列出了通过不同继
代培养基进行培养后愈伤组织的状态。在愈伤组织
的继代培养中,应该适当降低2,4-D的浓度,如果仍
以诱导愈伤组织时的浓度来继代,愈伤组织会出现
褐化现象,其表面开始形成毛状根,不利于胚性愈伤
组织的形成,当2,4-D的浓度降低至1.0mg·L-1
时,愈伤组织稀疏不紧实且呈现水渍状,试验结果标
明,当2,4-D的浓度为3.0mg·L-1时,有利于形成
淡黄色、结构致密、干燥或较湿润、生长较快的Ⅱ型
愈伤组织(图1-A)[17]。
表2 继代培养基中不同2,4-D浓度对对愈伤组织状态的影响
Table2 Effectsofdifferentconcentrationof2,4-Dto
subculturemediumoninductionofembryogeniccalus
2,4-D浓度/mg·L-1
2,4-Dconcentration
愈伤组织状态
Thestateofcalus
1.0 乳白色或浅黄色水渍状愈伤,生长膨大较快,不紧实
3.0 淡黄色,结构致密,湿润或较干燥颗粒状,易碎
6.0 淡黄色,结构致密,有毛状根产生,局部开始褐化
2.2 6-BA浓度对愈伤组织分化的影响
将继代数次后直径为5mm左右的胚性愈伤组
织接种到分化培养基上,培养7~15d后愈伤组织
块上出现绿色小芽点(图1-B)。但在不同6-BA浓
度下,愈伤组织分化的结果不同(表3):当6-BA浓
度为0.5mg·L-1时,分化率只有26.67%,而6-BA
浓度增加到1.0mg·L-1时,分化率增至61.33%,
947
草 地 学 报 第20卷
继续加大浓度时,分化效率开始降低。高浓度的6-BA
会抑制分化,所以本试验中适合该品种黑麦草愈伤组
织分化的培养基中6-BA的浓度为1.0mg·L-1。
此外,在分化过程中发现,一些带有毛状根的愈伤组
织分化能力明显低于表面光洁的愈伤组织,大部分此
类愈伤组织在生长一段时间后会褐化变黑,直至失去
活性死亡。所以胚性愈伤组织的状态对分化影响很
大,Ⅱ型愈伤组织分化效果较好。
表3 不同浓度6-BA对愈伤组织分化的影响
Table3 Effectsofdifferent6-BAconcentrationsoncalusdifferentiation
处理
Treatments
6-BA浓度/mg·L-1
6-BAconcentration
接种愈伤组织个数
Totalnumberofinoculatedcalus
有芽点形成的愈伤组织数
Numberofcaluswithshoots
分化率/%
Differentiationrate
1 0.5 60 16 26.67±5.44dC
2 1.0 75 46 61.33±5.58aA
3 2.0 75 38 50.67±7.60bAB
4 3.0 60 23 38.33±8.39cBC
注:处理1和4设置4个重复;处理2和3设置5个重复
Note:Treatments1and4with4replications;Treatments2and3with5replications
多年生黑麦草组培苗根的诱导较容易,试验过
程中,在不定芽分化中就会有少量不定根的生成。
将长至2~3cm时的不定芽接种到1/2MS+0.5
mg·L-1NAA培养基中,20d后生根(图1-C),生
根率达到100%。待生根的组培苗长至7~8cm左
右时,打开瓶口炼苗2~3d,洗净根部琼脂,移栽至
草炭∶蛭石=1∶1的基质中(图1-D),温室培养,移
栽成活率可以达到95%。
图1 多年生黑麦草再生过程
Fig.1 RegenerationofPerennialryegrass
注:A继代后的愈伤组织;B愈伤组织上分化出不定芽;C生根培养;D移栽苗
Note:A.Calusaftersubculture;B.Adventitiousbudsdiferentiatedfromcalus;C.Rootedplantlets;E.Perennialryegrasspottedinthesoil
2.3 转基因植株的获得及PCR检测
本试验以600个愈伤组织进行遗传转化,共获
抗性愈伤组织87个,经筛选分化培养后,得到52株
具潮霉素抗性的再生株,转化率为8.67%。随机取
8株生根成活的植株提取其基因组DNA,用引物S
hyg (5′-AAAAAGCCTGAACTCACCGC-3′)和 A
hyg (5′-ACTTCTACACAGCCATCGGT-3′)扩增
潮霉素抗性基因,PCR产物经1.0%的琼脂糖凝胶
电泳检测。8株植株均可以扩增出明显的目的基因
条带(图2),而对照植株则无目的基因条带出现,这
表明外源基因已经整合进入多年生黑麦草基因
组中。
图2 转基因植株PCR检测
Fig.2 PCRanalysisoftransgenicplants
注:M:maker;1~8:转基因植株;CK:非转基因植株
Note:M:maker;1~8:transgenicplants;CK:nontransgenicplants
057
第4期 李蔚等:多年生黑麦草高频再生体系的建立及农杆菌介导PEPC基因的转化
2.4 转化植株中目的基的Real-TimePCR检测
将提取的总RNA 取相同的量反转录后,进行
Real-TimePCR。根据 Real-TimePCR原始检测结
果,按照2-△△Ct[△△Ct=(待测样本目的基因平均
Ct值-待测样本内参基因平均Ct)-(对照样本目的
基因平均Ct值-对照样本内参基因平均Ct值)]相
对定量计算公式,计算出各样品的目的基因相对定量
结果,反应出目的基因mRNA转录水平的差异,试验
结果如图3所示,表明目的基因在6个转化株系中均
有表达,其中株系2表达量较高,表达量为7.447。6
个株系PEPC基因表达量差异显著(图3)。
图3 PEPC基因在不同株系中的表达量
Fig.3 PEPCgeneexpressionlevelindifferentlines
3 讨论与结论
3.1 影响愈伤组织诱导及分化的因素
在试验过程中发现,在愈伤组织诱导初期,愈伤
组织生长较慢,且大多伴随着根毛和芽的发生,如不
及时将根毛及芽去除,部分养分会被其吸收,这些愈
伤组织在继代后仍会出现毛状物及芽的生长,难以
形成淡黄色、颗粒状的胚性愈伤组织状态,不能用作
遗传转化的受体材料。此外,种子表面划伤处产生
愈伤组织的时间短于盾片处愈伤组织产生的时间,
种子被划破后,使胚受损,愈伤组织形成增多[18]。
在禾本科植物愈伤组织诱导中,2,4-D通常是起决
定作用的植物生长调节物质。本试验在愈伤组织诱
导阶段用较高浓度的2,4-D诱导愈伤组织,但在继
代过程中,如果继续使用高浓度的2,4-D,则会导致
所形成的愈伤组织产生毛状根且褐化,以致其失去
活性,所以在继代过程中,降低2,4-D浓度对胚性愈
伤组织形成有促进作用,这与Linaoer等[19]指出,过
高或过低的2,4-D浓度都不利于胚性愈伤组织的形
成一致。长势良好的愈伤组织在激素浓度合适的培
养基上7~10d就可以形成芽点,继而分化成苗,而
带有毛状根或水渍状的愈伤组织在分化过程中很快
就会褐化变黑,在转化筛选过程中则更快褐化死亡。
因此,良好的愈伤组织诱导及继代培养对黑麦草的
分化至关重要。
3.2 农杆菌介导的PEPC基因的转化
与其他转基因技术相比,农杆菌介导的基因转
化技术能转化较大的DNA片段,转化频率高,转基
因拷贝数低,而且价格便宜,操作简单。所以近年来
我国在牧草和草坪草遗传转化研究方面,较多使用
农杆菌介导法进行试验[20-21]。然而单子叶植物不是
农杆菌的天然寄主,因而阻碍了农杆菌介导法在单
子叶牧草和草坪草中的应用。在已报道的多年生黑
麦草遗传转化研究中,也存在着抗性植株的再生率
较低的情况,本研究以600个愈伤组织作为外植体
进行农杆菌侵染,最终得到52株再生植株,转化率
为8.67%,经PCR及Real-TimePCR验证,PEPC
基因已成功转入。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶在C4
和景天酸代谢植物中,起着捕获CO2 及作为CO2泵
以提高光合效率的作用,且有报道指出过表达
PEPC基因的玉米(Zeamays)株系,在适度的干旱
条件下内在水分利用率增长30%[22]。丁在松等[23]
通过对大量的转PEPC水稻(Oryzasativa)后代进
行研究发现,在干旱、高温、衰老、强光等逆境胁迫下
有助于发挥转基因水稻改善光合作用的效果。所以
PEPC基因是一个较为理想的提高植物抗性的基
因,本试验得到的转PEPC基因黑麦草可进行多种
后续的生理检测,为多年生黑麦草抗性品种的研究
奠定基础。
参考文献
[1] 孙吉雄.冷季型足球场草坪混播组合多年生黑麦草最佳含量的
研究[J].草业学报,1995,4(4):60-70
[2] 焉燕,张新全,张新跃.黑麦草种子生产研究现状及发展对策
[J].草业科学,2003,20(2):16-19
[3] 杨凤萍,梁荣奇,孙振元,等.抗逆调节转录因子DREB1B基
因转化多年生黑麦草的研究[J].西北植物学报,2006,26(7):
1309-1315
[4] HanL,LiX,ZengH,etal.Drought-toleranttransgenicpe-
rennialryegrass (Loliumperenne L.)obtainedviaparticle
bombardmentgenetransformationofCBF3/DREB1A gene
[J].ActaHorticulturae,2008,783:273-282
[5] 贾炜珑,胡鸢雷,张彦芹,等.海藻糖合酶基因转化黑麦草及耐
旱性研究[J].分子植物育种2007,5(1):27-31
157
草 地 学 报 第20卷
[6] 杨成民,王宏芝,魏建华.利用基因枪共转化法获得转bar与
P5CS基因黑麦草[J].草地学报,2005,13(1):34-38
[7] SatoH,TakamizoT.Agrobacteriumtumefaciens-mediated
transformationofforage-typeperennialryegrass(Loliumpe-
renneL.)[J].GrasslandScience,2006,52(2):95-98
[8] BajajS,RanY,PhilipsJ,etal.AhighthroughputAgrobac-
teriumtumefaciens-mediatedtransformationmethodforfunc-
tionalgenomicsofperennialryegrass(Loliumperenne L.)
[J].PlantCelReporter,2006,25(7):651-659
[9] 魏强,宋贺玲,蒯本科,等.过量表达拟南芥 HD-START 转
录因子AtHDG11提高黑麦草(Loliumperenne)抗旱性的初
步研究[J].植物生理学通讯,2011,46(11):1140-1146
[10]张小芸,何近刚,吴金霞.转果聚糖合成关键酶基因多年生黑
麦草的获得及抗旱性的提高[J].草业学报,2011,20(1):111-
118
[11]GuoYD,HisanoH,YamadaT,etal.Transformationofan-
drogenic-derivedFestulolium plants (Loliumperenne L.×
FestucapratensisHuds.)byAgrobacteriumtumefaciens[J].
PlantCelTissueandOrganCulture,2009,96(2):219-227
[12]MaX,SunZ,ZhangY,etal.TransferDREBintoLolium
perenneL.toimproveitsdroughttolerance[J].HighTech-
nologyLetters,2006,12(4):427-433
[13]孔政,赵德刚.苦瓜几丁质酶基因-益母草抗菌肽基因遗传转
化黑麦草[J].分子植物育种,2008,6(2):281-285
[14]刘萍,张振霞,杨中艺,等.应用农杆菌介导法的多年生黑麦草
遗传转化研究[J].中山大学学报:自然科学版,2005,44(3):
126-128
[15]张振霞,储成才,陈平,等.多年生黑麦草种子愈伤组织诱导和
植株再生[J].草地学报,2004,12(4):289-293
[16]王艳丽,叶兴国,许兴,等.高羊茅和黑麦草农杆菌介导转化体
系的研究[J].中国生物工程杂志,2007,27(1):22-27
[17]ArmstrongCL,GreenCE.Establishmentandmaintenance
offriable,embryogenicmaizecalusandtheinvolvementof
L-proline[J].Planta,1985,164(2):207-214
[18]WangZY,HopkinsA,MianR.Forageandturfgrassbio-
technology[J].CriticalReviewsinPlantSciences,2001,20
(6):573-619
[19]LinaceroR,VazquezA M.Somaticembryogenesisfromim-
matureinflorescencesofrye[J].PlantScience,1990,72(2):
253-258
[20]张丽君,程林梅,孙毅,等.导入APX 基因提高了普那菊苣植
株的抗逆性[J].草地学报,2012,20(1):152-158
[21]郝凤,刘晓静,毛娟,等.抗冻蛋白基因AFP 表达载体构建及
转化紫花苜蓿初报[J].草地学报,2009,17(6):779-783
[22]JeanneauM,GerentesD,FoueilassarX,etal.Improvement
ofdroughttoleranceinmaize:towardsthefunctionalvalida-
tionoftheZm-Asr1geneandincreaseofwateruseefficiency
byover-expressingC4-PEPC[J].Biochimie,2002,84(11):
1127-1135
[23]丁在松,赵明,荆玉祥,等.玉米PEPC基因过表达对转基因水
稻光合速率的影响[J].作物学报,2007,33(5):717-722
(责任编辑 李美娟
췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍
췍
췍
췍
췍
췍
췍
췍
췍
췍
췍
췍
췍
췍
췍
췍
췍
췍
췍
췍
췍
췍
췍
췍
췍
췍
췍
췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍
췍
췍
췍
췍
췍
췍
췍
췍
췍
췍
췍
췍
췍
췍
췍
췍
췍
췍
췍
췍
췍
췍
췍
췍
췍
췍
췍
췍
)
欢迎订阅《植物病理学报》
《植物病理学报》是中国植物病理学会主办的全国性学术刊物,“中国科技核心期刊”。主要刊登
植物病理学各分支未经发表的专题评述、研究论文和研究简报等,以反映中国植物病理学的研究水平
和发展方向,推动学术交流,促进研究成果的推广和应用。
本刊现已被英国农业与生物技术文摘(CAB)、联合国粮农组织AGRIS等收录。据《中国科技期
刊引证报告》(2011年版)统计结果,《植物病理学报》影响因子0.778。荣获首届《中国学术期刊检索
与评价数据规范》(CAJ-CD)执行优秀期刊奖。
本刊为双月刊,每期定价30元,全年6期共180元。
邮发代号:82-214。欢迎投稿,欢迎订阅。
编辑部地址:北京市海淀区圆明园西路2号 中国农业大学植保楼406室
邮编:100193
电话:(010)62732364
传真:(010)62813785
E-mail:zwblxb@cau.edu.cn。
257