全 文 ：第20卷 第3期
Vol.20 No.3
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2012年 5月
May. 2012
陕西省本氏针茅自然种群遗传多样性的ISSR分析
俞 靓1,井赵斌2,程积民1,2,3*
(1.西北农林科技大学资源环境学院,陕西 杨凌 712100;
2.西北农林科技大学动物科技学院,陕西 杨凌 712100;3.中国科学院水利部水土保持研究所,陕西 杨凌 712100)
摘要:利用ISSR分子标记,对采自陕西省不同地区的5个本氏针茅(Stipabungeana)自然种群进行遗传变异及群
体遗传结构分析,旨在探讨本氏针茅遗传变异产生的分子生态机理,为其资源保护提供理论依据。在100个供试
单株中,采用15条ISSR引物共扩增出223条可统计条带,其中多态性带182条,多态性位点比率为81.61%,Nei’s基
因多样性(H)为0.1887,Shannon信息指数(I)为0.2975,各种群之间存在较高的多态性。种群间的遗传变异为
63.01%,种群内的遗传变异为36.99%,遗传分化系数φst为0.6300,种群间的基因流(Nm)为0.1468,表明本氏针
茅遗传分化程度较高,遗传变异主要分布在种群间,而种群内变异相对较小,且各种群间的基因交流非常有限。
关键词:本氏针茅;ISSR;遗传多样性;遗传结构
中图分类号:Q943 文献标识码:A 文章编号:1007-0435(2012)03-0512-06
GeneticDiversityofStipabungeanaTrin.Populations
inShaanxiAnalyzedbyISSRMarkers
YUJing1,JINGZhao-bin2,CHENGJi-min1,2,3*
(1.ColegeofResourcesandEnvironment,NorthwestA&FUniversity,Yangling,ShaanxiProvince712100,China;
2.ColegeofAnimalScienceandTechnology,NorthwestA&FUniversity,Yangling,ShaanxiProvince712100,China;3.Institute
ofSoilandWaterConservation,ChineseAcademyofSciencesandMinistryofWaterResources,Yangling,ShaanxiProvince712100,China)
Abstract:Inter-simplesequencerepeat(ISSR)markerswereusedtodeterminethegeneticdiversityand
geneticdifferentiationoffiveStipabungeananaturalpopulationsinShaanxiprovince.Objectivesofthis
studyweretoexplorethemolecularandecologymechanismsofgeneticdiversityofStipabungeana.Fif-
teenprimersscreenedfrom96primersamplifiedstablebands.Amongatotalof223amplifiedbands,182
(81.61%)bandswerepolymorphicloci.Nei’sgenediversityindexandShannon’sinformationindexwere
0.1887and0.2975,respectively,whichindicatedhighgeneticdiversityexistingamongpopulation.Analy-
sisofmolecularvariance(AMOVA)demonstratedgeneticvariationmainlyamongpopulations.Genetic
variationratewas63.01%amongpopulations,but36.99% withinpopulation.Moreover,thelevelof
geneflow(Nm)wasmeasuredtobe0.1139individualpergenerationamongpopulationsthatindicatedSti-
pabungeanahadahighergeneticdifferentiation.
Keywords:StipabungeanaTrin.;ISSR;Geneticdiversity;Geneticstructure
基于DNA分子水平上的植物遗传多样性和遗
传分化研究在物种多样性保护中的作用已得到公
认。目前,对林草的遗传多样性研究由以濒危稀有
物种为主逐渐向以优势种和建群种并重发展,优势
种和建群种遗传多样性的研究不但对物种的保护和
利用具有重要意义,同时可以为生态系统遗传健康
的评估提供理论基础[1]。
本氏针茅(Stipabungeana Trin.)为禾本科
(Gramineae)针茅属(Stipa)多年生草本植物,又名
长芒草,俗称蓑草,其根系发达,须根较多,草质柔
软,营养丰富,适口性较好,是一种牲畜较喜食的天
然牧草,同时又是优良的水土保持牧草。该种生态
收稿日期:2011-11-10;修回日期:2012-01-28
基金项目:国家现代农业产业技术体系建设-咸阳牧草试验站;中国科学院院地合作专项“宁夏南部山区生态保育型集约化养殖技术模式
转化与示范”资助
作者简介:俞靓(1982-),女,宁夏银川人,博士研究生,研究方向为植被生态学,E-mail:yujing82-2008@163.com;*通信作者 Authorfor
correspondence,E-mail:gyzcjm@ms.iswc.ac.cn
第3期 俞靓等:陕西省本氏针茅自然种群遗传多样性的ISSR分析
幅度极其广泛,在我国西北、华北、西南和东北各地,
亚洲中部及北部均有分布,是黄土高原典型草原的
代表性植物和优势物种[2-3]。目前,对本氏针茅的研
究在国内仅有少数报道,且均为基础生物学和生态
学方面[4-8],而对本氏针茅自然种群分布的遗传多样
性和遗传分化研究较少。ISSR(intersimplese-
quencerepeat)分子标记技术,以其重复性好、多态
性丰富、显性遗传,特别是不具有物种特异性的特点
而被广泛的用于结缕草属(Zoysia)[9]、披碱草属
(Elymus)[10]、早熟禾属(Poa)[11]、苜蓿属(Medica-
go)[12]、鸭茅属(Dactylis)[13]和雀麦属(Bromus)[14]
等牧草资源的遗传多样性研究。
本研究利用ISSR分子标记技术,对来自陕西省
5个不同自然种群的本氏针茅进行遗传多样性研究,
并分析其遗传多样性与气候因子的相关性,旨在探讨
本氏针茅遗传变异产生的分子生态机理,为本氏针茅
种群遗传多样性保护提供科学合理的理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
本氏针茅材料于2010年9月中旬采自陕西省
境内,共5个种群,各种群生境状况如表1所示。各
种群内,随机收集20个单株,每个单株之间的距离
保持在10m以上,每株选取幼嫩无病斑的健康叶
片,采集编号后装塑封袋,置冰盒中带回实验室,保
存于-80℃冰箱备用。
1.2 方法
1.2.1 DNA提取及检测 采用改良的CTAB法
提取基因组DNA,紫外分光光度计检测其浓度和纯
度,用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测其质量。稀释
工作液浓度至20ng·μL-1,保存母液和工作液于
-20℃冰箱中备用。
表1 本氏针茅5种群的地理位置和环境因子特征
Table1 GeographiclocationandenvironmentalfactoroffiveStipabungeanapopulations
采样位置
Location
编号
Code
海拔/m
Altitude
经度
Longitude
纬度
Latitude
年均降雨量/mm
Annualmeanprecipitation
年均温/℃
Annualmeantemperature
生境
Habitat
陕西铜川金华山 TC 1200 108°34′ 35°10′ 540.0 12.0 森林草原Foreststeppe
陕西靖边罗大滩 JB 1390 108°56′ 37°32′ 395.4 7.8 荒漠草原Desertsteppe
陕西户县苗正山寨 HX 450 108°44′ 33°48′ 627.0 13.5 森林草原Foreststeppe
陕西蒲城县曼泉河 PC 530 109°45′ 34°54′ 533.2 13.3 森林草原Foreststeppe
陕西彬县白村乡 BX 1350 108°30′ 35°12′ 602.3 9.2 森林草原Foreststeppe
1.2.2 引物筛选 引物选用加拿大哥伦比亚大学
(UniversityofBritish ColumbiaBiotechnology,
UBC)公布的96个ISSR引物,由北京奥科生物工
程公司合成。选取4个田间性状表现差异较大的种
群,每个种群内随机选取一个单株,共计4个单株进
行引物筛选,最终选取15个扩增产物条带清晰、多
态性高的引物用于种群遗传多样性的分析,引物序
列如表2所示。TaqDNA酶、dNTPs、Mg2+和10
×Buffer购自宝生物工程(大连)有限公司。
1.2.3 PCR扩增及产物的检测 PCR扩增反应体
系为:20μL总体积中,DNA(20ng·μL-1)3μL、
TaqDNA 酶(5U·μL-1)0.2μL、dNTPs(2.5
mmol·L-1)1.4μL、引物(10μmol·L-1)3μL、
Mg2+(25mmol·L-1)1.4μL、10×Buffer2.5μL、
ddH2O8.3μL。PCR扩增在EppendorfPCR仪上
进行,PCR反应程序:94℃预变性5min,94℃变性
45s,退火45s(温度因不同引物而定,如表2所
示),72℃延伸90s,35个循环;72℃延伸5min,4℃
保存。
扩增产物用6%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分
离,银染显色、统计结果并拍照保存。
1.3 数据处理与分析
选择清晰可辨的扩增条带进行统计。按同一迁
移位置上扩增产物的有无进行统计,扩增产物在相
同迁移位置有带赋值为“1”,无带赋值为“0”,建立原
始二元数据矩阵。根据二元矩阵,统计扩增产物的
条带总数和多态性条带数量,计算多态性比率
(PPB)。利用软件DCFA1.1[15]建立数据分析的
原始文件。用POPGENE1.32[16]软件计算群体间
多态位点数、多态位点比率(PPB)、等位变异数
(na),有效等位基因数(ne),Shannon信息指数(I),
Nei’s基因多样性(H)、基因流(Nm)、遗传距离(D)
和遗传一致度(I)。利用软件 AMOVA1.55[17]进
行分子变异方差分析(AMOVA),计算种群内、种群
间的变异方差分布和种群间的遗传分化系数(φst)。
315
草 地 学 报 第20卷
利用SPSS16.0中的Pearson相关分析,计算ISSR
分析所得的本氏针茅种群遗传多样性指数与生态因
子间的相关系数。用POPGENE软件计算种群间
Nei无偏遗传距离,用非加权配对算术平均法(UP-
GMA)进行聚类。利用 Mantel检验[18]对 POP-
GENE计算所得的Nei’s无偏差遗传距离矩阵与地
理距离矩阵之间的相关关系进行检验。
2 结果与分析
2.1 ISSR标记的扩增多态性
筛选出的15条ISSR引物在5个本氏针茅种
群的100个单株中共扩增出223条清晰的条带,扩
增的DNA片段主要集中在100~2000bp之间(图
1),其中多态性条带182条,多态性位点比率为
81.61%;平均每个引物产生14.87条带,平均多态
性位点比率为81.7%。表明ISSR标记对本氏针茅
具有良好的扩增效果和较高的多态性。
图1 引物UBC834对部分本氏针茅材料的ISSR扩增图谱
Fig.1 ISSRfingerprintsofsomeStipabungeana
amplifiedwithPrimerUBC834
ISSR扩增条带统计结果表明(表2),不同的
ISSR引物对本氏针茅的扩增效果差别较大,15个
引物中,有9个二核苷酸重复序列,2个三核苷酸重
复序列,1个四核苷酸重复序列,3个5’锚定的重复
序列。
表2 ISSR分析的引物序列及其扩增结果
Table2 PrimersequencesusedinISSRanalysesandamplifiedresults
引物
Primer
引物序列
Sequence(5′-3′)
最佳退火温度
Optimalannealingtemperature/℃
扩增条带数
Totalbands
多态性条带
Polymorphicbands
多态性比率
Percentageofpolymorphicbands/%
UBC806 (TA)8G 41.5 18 16 88.89
UBC813 (CT)8T 48.4 9 7 77.78
UBC814 (CT)8A 50.0 7 7 100.00
UBC820 (GT)8C 57.7 7 7 100.00
UBC822 (TC)8A 55.7 11 8 72.73
UBC823 (TC)8C 57.7 7 4 57.14
UBC827 (AC)8G 56.4 17 14 82.35
UBC834 (AG)8CT 56.0 20 17 85.00
UBC840 (GA)8CT 54.1 19 14 73.68
UBC864 (ATG)5 46.7 17 17 100.00
UBC868 (GAA)5 42.6 9 6 66.7
UBC880 (GGAGA)3 51.0 25 21 84.00
UBC886 AGA(CT)7 57.7 20 15 75.00
UBC887 AGA(TC)7 54.5 16 13 81.25
UBC891 AGA(TG)7 47.1 21 17 80.95
总计 Total 223 182 81.61
平均 Mean 14.87 12.2 81.70
2.2 遗传多样性
用POPGENE软件对ISSR扩增结果进行分
析,各种群的多态性位点比率范围在21.52%~
41.70%之间(表3),均低于总多态性位点比率
(81.61%)。在5个种群中,彬县种群(BX)多态性
位点比率最高(41.70%),靖边(JB)和蒲城(PC)种
群多态性位点百分率较低,分别为 22.87% 和
21.52%。根据多态性位点比率,各种群遗传变异由
高到低依次为:彬县种群(BX)> 铜川种群(TC)>
户县种群(HX)> 靖边种群(JB)> 蒲城种群(PC)。
假设等位基因频率符合哈迪-温伯格(Hardy-
Weinberg)平衡时,估算本氏针茅各种群的遗传多
样性(表3),其中,Nei’s基因多样性为0.1887,
Shannon信息指数为0.2975,在5个种群中,就遗
传多样性指数而言,彬县种群(BX)表现出显著高于
其他种群的估算结果,遗传多样性最高。
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第3期 俞靓等:陕西省本氏针茅自然种群遗传多样性的ISSR分析
表3 5个本氏针茅种群的遗传多样性指数
Table3 GeneticdiversityindexesoffiveStipabungeanapopulations
类群
Groups
多态性位点
Polymorphicloci
多态性位点
比率PPB
观测等位
基因数na
期望等位
基因数ne
Nei’s基因
多样性H
Shannon
信息指数I
TC 87 39.01 1.3901 1.1859 0.1122 0.1716
JB 51 22.87 1.2287 1.1141 0.0692 0.1058
HX 70 31.39 1.3139 1.1873 0.1039 0.1536
PC 48 21.52 1.2152 1.1324 0.0759 0.1123
BX 93 41.70 1.4170 1.2322 0.1314 0.1965
平均 Mean 69.8 31.30 1.3130 1.9506 0.0985 0.1480
总计 Total 182 81.61 1.8162 1.3010 0.1887 0.2975
注(Note):PPB=percentageofpolymorphicbands;na=Observednumberofaleles;ne=Effectivenumberofaleles;H = Nei’sgene
diversity;I=Shannon’sinformationindex
2.3 群体遗传结构
分子变异方差分析结果表明(表4),种群间的
变异方差分量为15.8732,占总变异的63.01%,种
群内不同个体间的方差分量为9.3168,占总变异的
36.99%。由分子变异分析计算出的种群间遗传变
异系数φst=0.6300,种群间的基因流Nm=0.1468。
使用1000次随机模拟检测,种群间与种群内不同个
体间均存在着极显著差异(P<0.001)。
表4 种群的分子变异方差分析(AMOVA)
Table4 Analysisofmolecularvariance(AMOVA)ofpopulations
变异来源
Sourceofvariation
自由度
d.f.
方差和
Sumofvariance
变异组分
Variancecomponent
变异百分率/%
Percentageofvariation
P值
Pvalue
种群间 Amonggroups 4 1307.1200 15.8732 63.01 <0.001
种群内 Withingroups 95 885.1000 9.3168 36.99 <0.001
总计 Total 99 2192.2200 25.1900 100.00
注:P:1000次随机置换后进行显著性检验
Note:P-valueswereestimatedbyapermutationprocedurebasedon1000replicate
2.4 种群间遗传关系及聚类分析
基因分化系数只能对种源分化的程度进行评
价,不能判定种源间相互关系的远近,而遗传一致度
(I)和遗传距离(D)的度量可以说明每个种源间彼
此关系的远近,可以进一步分析种源间的遗传分化
程度[19]。因此,采用POPGENE软件计算出本氏针
茅各种群间的遗传一致度和遗传距离,结果如表5
所示。
遗传一致度越大,关系越近,遗传距离越大,关
系越远。在本研究的本氏针茅5个种群中,靖边种
群(JB)与户县种群(HX)间遗传一致度最低(I=
0.7259),相应的遗传距离最远(D=0.3204);而靖
边种群(JB)与铜川种群(TC)间遗传一致度最高
(I=0.9678),遗传距离最小(D=0.0328)。
根据Nei氏遗传距离利用 UPGMA法构建了
本氏针茅种群遗传关系聚类图(图1)。从图中可看
出,5个自然种群聚成3类:铜川(TC)和靖边(JB)
种群聚成一类;蒲城(PC)和彬县(BX)种群聚成一
类;户县种群(HX)单独聚为一类。
用R语言对5个种群间的遗传距离和地理距
离进行 Mantel检测(图2),结果表明各种群间的遗
传距离和地理距离之间没有明显相关性(r=
0.2139,P=0.226>0.05),说明地理距离不是本氏
针茅种群遗传分化产生的主要原因。
表5 种群遗传一致度(对角线以上)和遗传距离(对角线以下)
Table5 Geneticsimilaritycoefficient(abovediagonal)andgeneticdistance(belowdiagonal)
类群 Groups TC JB HX PC BX
TC 0 0.9678 0.7790 0.9526 0.9601
JB 0.0328 0 0.7259 0.9375 0.9300
HX 0.2497 0.3204 0 0.7467 0.8123
PC 0.0486 0.0645 0.2921 0 0.9645
BX 0.0408 0.0726 0.2079 0.0361 0
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草 地 学 报 第20卷
图1 基于群间Nei’s无偏差遗传距离
构建的UPGMA聚类图
Fig.1 DendrogramgeneratedbyUPGMAbasedon
Nei’sunbiasedgeneticdistances
图2 5个种群间遗传距离与地理距离的相关关系
Fig.2 Correlationbetweengeneticdistanceand
geographicdistanceoffivepopulations
2.5 Nei’s基因多样性与生态因子之间相关性分析
对本氏针茅种群ISSR标记的Nei’s基因多样
性与其所在生境的生态因子(经度、纬度、海拔、年平
均温度和年降雨量)进行Pearson相关分析的结果
表明,ISSR标记的Nei’s基因多样性与其所处生境
的生态因子均未达到显著水平(表6),表明陕西地
区本氏针茅生境环境因子对本氏针茅的遗传多样性
变化没有显著影响。
3 讨论与结论
3.1 遗传多样性
遗传多样性一般是指种内的遗传差异水平,它
反映一个物种适应环境的能力及其被改造和利用的
潜力[19]。本研究对陕西省5个本氏针茅自然种群
的遗传多样性分析表明,各种群的多态性位点比率
范围在21.52%~41.70%之间,Nei’s基因多样性
指数在0.0692~0.1314之间,Shannon信息指数在
0.1058~0.1965之间,Nybom[20]对种子植物遗传
多样性的研究结果表明:单子叶植物Nei’s基因多
样性平均为0.190;地理广布种 Nei’s基因多样
性平均为0.202,多态性位点比率平均为58.90%;温
表6 种群Nei’s基因多样性指数与生态因子之间的Pearson相关
Table6 PearsoncorrelationbetweenNei’sgenediversityandecologicalfactors
多样性指数
Diversityindex
海拔/m
Altitude
经度
Longitude
纬度
Latitude
年均降雨量/mm
Annualmeanprecipitation
年均温/℃
Annualmeantemperature
Pearsoncorrelation 0.222 -0.743 -0.495 0.743 0.037
Sig.(2-tailed) 0.720 0.150 0.397 0.150 0.953
带物种Nei’s基因多样性平均为0.146,多态性位
点比率平均为48.50%,由此说明本氏针茅各种群
内存在相对较低的遗传多样性。在野外调查和取样
的过程中发现,位于农牧民居住点附近的蒲城种群
和交通要道旁的户县种群,由于大量人畜活动的干
扰,生境破坏较为严重,导致本氏针茅种群数目和种
群规模变小,遗传多样性水平相对较低;位于人迹罕
至的彬县种群和铜川种群,生境保护相对完好,种群
也相对较大,遗传多样性相对较高。Sun[21]的研究
表明,种群规模和其遗传多样性有显著的相关性。
本研究中陕西地区本氏针茅种群规模的减小可能是
导致各种群内遗传多样性偏低的主要原因。
3.2 遗传分化
群体遗传结构是指一个物种或群体的遗传变异
在空间的非随机分布式样,即群体内、群体间的分布
格局以及在时间上的变化,在很大程度上代表了其
进化潜力[22]。一个物种群体遗传结构的确定,对其
生物学特性的了解,物种进化过程和机制的探讨具
有重要作用,而遗传分化是研究群体遗传结构的重
要参数[23]。对本氏针茅种群的遗传结构进行分子
方差变异分析,其遗传分化系数φst为0.6300,大于
单子叶植物的平均分化系数Gst=0.231,多年生草
本植物的平均分化系数Gst=0.233[24]。Wright[25]
指出,遗传分化系数介于0~0.05之间,种群间的分
化很弱;0.05~0.15之间分化中等;0.15~0.25之
间分化大;大于0.25则分化极大,说明本氏针茅种
群间发生了较大程度的遗传分化。Harmrick等[24]
认为异交传粉植物的遗传分化系数平均为0.20,而
自交物种为0.51,相对于异交植物而言,自交植物
具有较高的群体间遗传变异和较低的群体内遗传变
615
第3期 俞靓等:陕西省本氏针茅自然种群遗传多样性的ISSR分析
异。本氏针茅为自交物种,其遗传变异主要存在于
种群间,种群内的遗传变异相对较小。
Hamarick等[24]的研究表明,植物的繁育系统、
基因流和种子扩散机制、繁殖方式及自然选择等因
素对植物的遗传结构有明显的影响。基因流被认为
是种群遗传结构均质化的主要因素之一[26],一般认
为,具有有限基因流的物种比具有广泛基因流的物
种有较大的遗传分化[23]。Wright[25]指出,如果基
因流估计值Nm>1时,则种群间存在一定的基因流
动;当Nm<1时,则遗传漂变导致种群间明显的遗
传分化。本研究得出的Nm=0.1468,远小于1,说
明本氏针茅种群间的基因交流非常有限。本氏针茅
虽为风媒传粉植物,但本研究中野外调查和取样生
境较多为森林草原,复杂的地形、乔灌木的密布减弱
了风的驱动力,阻碍了种子和花粉的远距离传播。
此外,由于本氏针茅是牲畜喜食的优良牧草,在动物
取食的巨大压力下,其种群内很难形成一个强有力
的种子库,也很难进行远距离传播,影响了种群间的
基因交流。同时,由于人类的过度放牧和滥砍滥挖,
导致适宜本氏针茅生存的生境不断出现萎缩和退
化,使得各种群的分布不连续,且野外调查发现本氏
针茅种子能萌发成实生苗的比例较小,种群的维持
多靠珠芽进行营养繁殖,导致自我更新缓慢,限制了
种群内个体数量,增加了相近个体间的交配机会,缺
少与其他种群间有效的基因流动。因此,以自交为
主的繁育系统、较低的基因流、种子与花粉传播受阻
以及有限的种群规模均可能是导致本氏针茅种群间
产生较大遗传分化的原因。
3.3 种群保护措施
本氏针茅是黄土高原典型草原主要建群种和优
势种植物,在森林草原和荒漠草原也有较大的分布,
因此,对黄土高原植被恢复和水土流失具有其独特
的作用。本研究表明,本氏针茅的遗传变异主要存
在于种群间,种群间的遗传分化极其显著,因此,今
后应加强本氏针茅的原生境保护,采取相应的措施,
抑制种群衰败趋势;同时可考虑对本氏针茅的种子
繁殖特性进行深入研究,提高其在自然生境的自我
繁殖能力。
参考文献
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(责任编辑 刘云霞)
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