全 文 ：文章编号: 1007-0435( 2002) 04-0274-05
抗褐斑病苜蓿 RAPD多态性研究
桂 枝1, 袁庆华2*
( 1. 天津农学院农学系, 天津 300384; 2.中国农业科学院畜牧研究所, 北京 100094)
摘要: 运用 RAPD 技术,采用集群分离分析法对 5个苜蓿品种进行抗褐斑病基因连锁的分子标记研究。结果表明,
在 160 个随机引物中有 107个有扩增产物,其中 54 个扩增出的产物的电泳图谱较稳定、清晰,再从中筛选出8 个能
够同时在 3 个以上苜蓿品种内的抗、感材料间显示多态性的随机引物, 其 RAPD 标记的大小为 600～1400bp。
关键词: 苜蓿; 褐斑病; RAPD 标记
中图分类号: Q943; S541 文献标识码: A
Studies on RAPD Polymorphic in Alfalfa Resistant to Brown Blot
GUI Zhi
1
, YUA N Qing-hua
2
(1. T ianjin Agricu ltural College, Tianjin 300384, China; 2. Inst itute of Anim al S cien ce, CAAS , Beijing 100094, Ch ina)
Abstract: Randomly ampl if ied po lymo rphic DNA ( RAPD) w as employed to detect mo lecular marker s
linked to the gene resistant of br ow n blo t in 5 alfalfa variet ies. T he r esults show that , 54 of 107 arbitr ar y
pr imer s could amplify clear and repeat ing bands; polymorphic bands w er e found betw een resistant and
suscept ible plants of more than 3 variet ies of alfalfa, that were RA PD linked to the gene resistant of brow n
blot ; the length o f the bands w as 600～1400bp.
Key words : Alfal fa; Brow n blot ; RAPD markers
目前,我国苜蓿种植规模正在迅速扩大,虽然采
取了一些耕作栽培措施以减轻褐斑病所造成的损
失,但效果并不明显,关键的原因就在于抗病苜蓿品
种极其缺乏, 因此只有培育出抗褐斑病苜蓿品种才
能从根本上解决上述问题。在美国,育种家已从常见
的中等抗褐斑病的苜蓿栽培品系中选育出一些高抗
品系,并结合提前收割、去掉保护行中的早发病株等
栽培措施,取得较好的抗褐斑病效果[ 1]。国内学者则
主要通过田间调查对不同苜蓿品种的抗性做了一些
比较研究[ 2～4] ,同时在对其他病害的研究中发现苜
蓿品种不同个体间在抗病性上存在遗传差异[ 5, 6] ,但
对褐斑病的抗性遗传资源尚缺乏系统深入的研究。
自从Will iams等[ 7]首次建立 RAPD技术后,由
于其独特的检测 DNA 多态性的方式以及快速、简
便、成本低以及易推广普及等优点,故得到了普遍的
应用[ 8]。在苜蓿方面, RAPD技术多用于不同品种间
遗传图谱的构建、品种的分类和鉴别 [ 9, 10] , 对同一品
种,特别是同一品种的不同抗、感植株遗传结构变化
的研究尚不多见。本研究以筛选出的 5个苜蓿品种
的不同个体为试材, 利用 RA PD 分子标记技术[ 7] ,
采用集群分离分析法( Bulked Seg regant Analysis,
BSA)
[ 11]对抗褐斑病基因进行分子标记, 并在较短
的时间内选出一些抗病种质资源,为抗病分子标记
辅助选择( MAS)、抗病基因的定位与克隆以及导入
提供分子依据。
1 材料与方法
1. 1 供试材料
1. 1. 1 供试的 5个苜蓿品种,即伊鲁瑰斯(M edica-
收稿日期: 2002-02-28; 修回日期: 2002-05-16
基金项目:国家自然科学基金(编号: 39870559)资助项目
* 通讯作者
作者简介: 桂枝( 1973-) ,女,山西人,助教, 1997年本科毕业于山西师范大学生物系, 2001年于甘肃农业大学获得硕士学位, 现在天津农
学院从事教学与科研工作
第 10卷 第 4期
Vo l. 10 No. 4
草 地 学 报
ACT A AGRESTIA SIN ICA
2002 年 12 月
Dec. 2002
go sativa L. cv . Iroquois)、沙湾(M edicago sat iva L.
cv . Shaw an )、萨 兰 斯 ( Medicago sativ a L. cv.
Saranac)、泾阳(M edicago sativ a L. cv . Jingyang )和
沙河(M edicago sativ a L. cv. Shahe) ,由中国农业科
学院畜牧研究所提供。
1. 1. 2 苜蓿假盘菌[ P . medicaginis]菌种采自中国
农业科学院畜牧所生长 6年的苜蓿试验地。
1. 1. 3 10碱基随机引物为 OPERON 公司提供,
dNT P 由上海生工公司提供, T aqDNA 聚合酶 (含
Buf fer 和 Mg 2+ )由中国科学院遗传研究所提供。
1. 2 筛选褐斑病抗性及感性苜蓿幼苗
1. 2. 1 于 1999年 11月至 2000年 4 月进行该试
验。先将苜蓿种子经 0. 1%升汞消毒 3min 后, 用无
菌水冲洗 4次,放入消毒培养皿的滤纸上, 加适量灭
菌水以保持种子吸水膨胀, 然后放入 20℃的生长
箱,发芽 2d,待幼根长到 1cm 长时,移植到装有蛭石
和草炭 (比例为 1∶2) 的塑料盆中, 花盆体积为
300mL( 5cm×7cm)。每盆栽 1株,接种根瘤菌后, 放
入温室,温度控制在 10～30℃。待幼苗生长4周后,从
5个品种中分别选出生长健壮的幼苗各 600 株,分别
取各单株的第1片真叶及第2、3、4、5、6片复叶的中间
小叶,对离体叶采用孢子弹射法接种病菌[ 12, 13]。
1. 2. 2 2周后, 进行病害严重度评价。病害严重度
分为 6级: 0级—无病斑; 1级—1～3个病斑; 2级—
4～6个病斑; 3级—7～10个病斑; 4级—11～15个
病斑; 5级—16个以上病斑。
1. 2. 3 按上述方法经 6次接种筛选后,从各供试苜
蓿品种中分别选出最抗和最感的单株各 10株, 分别
作为抗病组和感病组。再从各品种剩余的材料中随
机选出 5株, 作为随机组。
1. 3 RAPD多态性标记筛选
1. 3. 1 采用 M ichelmore[ 11]的 BSA 方法进行。从选
出的个体中,各取等量抗、感 5个植株的 DNA 混合
构成一对抗病和感病的 DNA 池。
1. 3. 2 苜蓿基因组 DNA 的提取参考袁庆华等[ 14]
的方法进行。先用 160个随机引物进行初步 PCR扩
增,淘汰那些没有扩增产物或扩增结果不稳定的引
物,再以 5个品种抗、感共 10个 DNA 池为模板,对
所选引物进行 PCR 扩增以筛选多态性稳定的
RAPD标记,重复 3～5次。
1. 4 PCR扩增与产物检测
RAPD 扩增的反应体系和反应程序见袁庆华
等[ 14]的方法。扩增结束后,取 10L 的 PCR扩增产
物与 2L 溴酚蓝( 0. 25%溴酚蓝, 0. 25%二甲苯氰
蓝, 40%蔗糖)混匀,点入含有 0. 5g / mL 溴化乙锭
的 1. 2%琼脂糖凝胶中,在 5V/ cm 电场强度下电泳
1～2h, 取出凝胶, 在紫外灯下观察照相。
2 结果与分析
2. 1 引物的筛选
对 160个随机引物进行扩增, 结果表明, 其中
53个引物没有产物(占 33. 13%) , 107 个引物有扩
增产物, 其中 54 个引物有特异性扩增产物 (占
33. 75%)。经过多次重复,从中筛选出 14个扩增结
果比较稳定的随机引物(占 8. 75% ) , 依次是 C02、
C11、C13、D02、D07、E01、E19、F01、G03、G05、G06、
G13、N05、N15。
2. 2 RAPD标记筛选
2. 2. 1 对筛选出的 14个随机引物进行 3～5次的
重复扩增,其中 8个引物与基因组 DNA 有比较稳
定的特异性结合位点(占 5%) ,不仅扩增结果的重
复性高,且能够同时在 3个以上苜蓿品种内抗、感材
料间显示多态性。8个引物的碱基序列(见表 1) , 它
们在这 5个苜蓿品种内抗、感材料间的特异性扩增
结果见表 2, 引物 C13和 D07的 RAPD电泳图谱见
图 1、2。
表 1 RAPD引物及其 PCR扩增结果
T able 1 T he prim es of RAPD and the ampl ificat ion of PCR
引 物
Primer
序 列
Sequ ence5′-3′
扩增位点
Total
s ites
多态性位点
Polymorphic
sites
多态百分率
( % )
Poly( % )
OPC02 GTGAGGCGT C 5 2 40. 00
OPC13 AAGCCT CGT C 6 4 66. 67
OPD07 T TGGCACGGG 7 6 85. 71
OPE19 ACGGCGT AT G 6 4 66. 67
OPF01 ACGGATCCTG 7 5 71. 43
OPG06 GT GCCTAACC 5 3 60. 00
OPG13 CT CT CCGCCA 6 5 83. 33
OPN15 CAGCGACT GT 4 3 75. 00
合 计
T otal
46 32 69. 57
275第 4期 桂枝等:抗褐斑病苜蓿 RAPD 多态性研究
表 2 褐斑病抗性连锁的 RAPD 标记
T able 2 RAPD markers linked t o r esist ance gene of common blo t
品种
C ult ivar s
引物( bp) Primer( bp)
OPC02 OPC13 OPD07 OPE19 OPF01 OPG06 OPG13 OPN15
沙湾抗性
Res istant m ater ial s of Med icag o sat iv a L. cv. Sh aw an
- - 650 1300 - 1000 1000 -
沙湾感性
S en sit ive materials of Med icag o sati va L. cv. S hawan
1200 1000 - - 1000 - - -
萨兰斯抗性
Res istant m ater ial s of Med icag o sat iv a L. cv. Saranac
1200 - 650 - 1000 1100 - 800
萨兰斯感性
S en sit ive materials of Med icag o sati va L. cv. S aranac
- 1000 - 1300 - - - -
伊鲁瑰斯抗性
Res istant m ater ial s of Med icag o sat iv a L. cv. Iroquois
- - 650 1300 - - - -
伊鲁瑰斯感性
S en sit ive materials of Med icag o sati va L. cv. Iroquois
1200 1000 - - 1000 - - 800
沙河抗性
Res istant m ater ial s of Med icag o sat iv a L. cv. Sh ahe
- - 650 - - 1000 1100 -
沙河感性
S en sit ive materials of Med icag o sati va L. cv. S hahe
- 900 - 1300 900 - - 800
泾阳抗性
Res istant m ater ial s of Med icag o sat iv a L. cv. Jing yang
- - - 1300 1000 1100 - -
泾阳感性
S en sit ive materials of Med icag o sati va L. cv. J ingyang
- - 650 - - - - -
图 1 引物 OPC13扩增的 RAPD 谱带
F ig . 1 Profile o f the amplified pr oducts w it h pr imer OPC13
1.沙湾抗 2.沙湾感 3.萨兰斯抗 4.萨兰斯感 5.伊鲁瑰斯抗
6.伊鲁瑰斯感 7.沙河抗 8.沙河感 9.泾阳抗 10.泾阳感 M:标准分子量
1. R Shaw an 2. S Shaw an 3. R S aranac 4. S Saranac 5. R Iroquois
6. S Iroquois 7.R Shahe 8. S Shahe 9.R Jingyang 10. S Jingyang M :M ark er
2. 2. 2 8 个引物扩增谱带的总数为 46条,其中多
态带为 32条, 占总扩增片段的 69. 57%。每个引物
扩增所得的条带数平均为 5. 75条, 变动范围在 4～
7条之间,多态频率为 40. 00%～85. 71%。多态性位
点分布在 40. 00%～85. 71%之间,扩增所得 DNA
片段的分子量在 600～1400bp 之间, 且在特定位点
276 草 地 学 报 第 10卷
所表现出的 DNA 多态性的稳定程度较好。
2. 2. 3 出现上述现象的原因主要是由于苜蓿属于
异花授粉植物,在长期的人工栽培和选育过程中发
生了遗传物质交流,品种混杂程度大、遗传组成的变
异性也较大, 品种内选择潜力相对较大,用同一引物
对品种内的抗病和感病植株进行扩增时, 得到的共
有片段较少, 片段共享度较低,产物间表现出很大的
差异, 降低了筛选 RAPD标记的难度。用同一引物
对品种内抗性和感性的 DNA 池扩增出不同的特异
条带,表现出一定的随机扩增多态性。扩增出的相同
条带表明供试苜蓿品种的遗传物质间具有较大共
性, 107个引物的大部分扩增产物在品种内抗、感材
料间是相同的,品种内特异性条带的出现或消失则
体现了不同抗性材料间遗传物质的差异, 但品种内
差异毕竟远小于品种间,故能够在品种内扩增出特
异条带的引物数比较少。
3 讨论
3. 1 尽管本试验所用材料是在个体水平上通过人
工接种病原菌经过多次筛选得到的,但采用 RAPD
分析技术在 DNA 水平上进行检测后,确实在不同
品种内出现特异性扩增条带, 可以区分抗性和感病
个体,即两个水平的筛选结果基本一致。为进一步验
证二者的吻合程度, 对田间病情指数及产量进行了
方差分析。供试品种的抗病、感病及随机组之间病情
指数差异极显著( P< 0. 01) ,病害严重度最高的是
感病组,范围在 3. 5～4. 3之间, 最低的是抗病组,范
围在 0. 83～1. 625之间, 随机组介于两者之间。干物
质产量间差异极显著( P< 0. 01)或显著( P< 0. 05)。
结果表明, 尽管 RAPD技术有一定的局限性, 但只
要针对不同研究对象、不同反应仪器和不同型号试
剂系统建立最佳反应条件和反应体系,就能在亲缘
关系极近的样品中放大出稳定、可靠的特异性条带,
本研究的结果验证了上述观点。
3. 2 试验中存在着大量的不稳定带和弱带,说明尽
管这些条带的遗传物质已经发生了变异, 但是基因
的表达仍将受到细胞内酶、pH 值和环境温度等多
种因素的极大影响,无法很好地在 RAPD扩增后体
现出个体间的差异。此外,基因组中某些序列拷贝数
的多少也可能导致试验结果出现一定的差异。如果
序列的拷贝数少, RAPD技术本身的缺点和其它外
界因素都能强烈地削弱扩增结果,难以在紫外灯下
用肉眼鉴别。但是为保证扩增结果的可靠性则必须
在试验条件一致的前提下进行多次的重复,同时排
除一些弱带和不稳定带以使试验结果更趋合理。
图 2 引物 OPD07 扩增的 RAPD 谱带
F ig . 2 P ro file of t he am plified products w ith primer OPD07
1.沙湾抗 2.沙湾感 3.萨兰斯抗 4.萨兰斯感 5.伊鲁瑰斯抗
6.伊鲁瑰斯感 7.沙河抗 8.沙河感 9.泾阳抗 10.泾阳感 M:
标准分子量
1. R Shaw an 2. S S haw an 3. R Saran ac 4. S Saranac 5. R
Iroquois 6. S Ir oqu ois 7. R Sh ah e 8. S Sh ah e 9. R J ingyan g
10. S J ingyan g M: Marker
3. 3 在筛选出较理想的与目的基因连锁的 RAPD
标记后,首先应该建立 F 2分离群体, 采用同样的引
物对子代植株进行随机扩增以验证 RAPD 标记的
连锁程度和稳定程度。其次, 回收多态性 RAPD 产
物, 进行克隆、自动化测序, 并根据两端序列设计更
长的寡核苷酸引物对, 将其转换成 SCAR 标记或
RFLP 标记, 以提高试验的重复性和稳定性。如果用
RAPD 特异带做为遗传标记进行基因定位,为降低
F 2 代材料中显性遮盖作用对位点间遗传距离的影
响, 应该将 F 2代继续自交若干代后得到纯系, 再用
自交纯系做为材料进行遗传连锁分析。
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2002. 12
278 草 地 学 报 第 10卷