全 文 ：文章编号: 1007-0435( 2005) 01-0079-03
苜蓿子叶体细胞胚的诱导和植株再生(简报)
王玉民,刘艳芝,夏彤,李望丰,李俊波,董英山
(吉林省农业科学院生物技术研究中心, 公主岭 136100)
Somatic Embryogenesis and Plant Regeneration from Alfalfa Cotyledon
WANG Yu-min, LIU Yan-zhi, XIA Tong , LI W ang-feng , LI Jun-bo, DONG Ying-shan
( Biotech nology Research C enter, J ilin Academ y of Agr i. S ci. , Gongzhulin g, J ilin Province 136100 China)
　　关键词: 苜蓿;子叶; 体细胞胚发生;再生植株
　　Key words : Alfalfa; Cotyledon; Somat ic emdr-yogenesis; Regenerat ing plang
　　紫花苜蓿(Med icago sativa L. )是重要的豆科牧
草, 全世界种植面积约 3300 万 hm2 , 我国约 133 万
hm2。苜蓿营养丰富,含粗蛋白质 17%～20%, 是多种
畜禽喜食的优质蛋白饲料。苜蓿组织培养始于 20世纪
70年代, 30年来, 国内外采用的外植体种类繁多,如茎
尖、叶片、茎段、幼芽、子叶、下胚轴、上胚轴、花药、花
粉、种子、胚珠、根、叶柄[ 1～3]等。李聪等( 1989) [ 4]以苜
蓿子叶为外植体,使 14个苜蓿品种分化出苗,再生率
为 10%～74%。李望丰等( 2002) [ 5]以实生苗根为外植
体,通过不同 2, 4-D浓度对苜蓿诱导的研究, 筛选对
2, 4-D敏感,体细胞胚发生能力高和分化率也高的苜
蓿品种,而品种间的胚性愈伤诱导率也存在较大的差
异。本文采用 18个国内外苜蓿品种,通过实生苗子叶
诱导体细胞胚,再生率2. 0%～78%, 品种间差异较大,
但诱导产生的胚状体均可大量增殖, 增殖能力可持续
一年以上,且增殖得到的正常胚状体可完全萌发,这一
特征在苜蓿遗传转化过程中具有极大的优越性。
1　材料与方法
1. 1　供试材料为草原 1、2号、公农 1、2号、敖汉、罗佐
马、中山 1号、武功、润布勒、熊岳、塞塔申、超产、前郭、莫
泊、格拉切克、龙牧801、803、肇东苜蓿等18份(表1)。种
子由吉林省农业科学院畜牧分院草地研究所提供。
1. 2　建立无菌苗
选取饱满种子,在 75%乙醇浸泡 2 min 后, 0. 1%
升汞浸泡 30 m in, 用无菌水清洗 4 次, 用无菌水浸泡
放置在培养室 24 h, 膨胀后接种于 MS0培养基。
1. 3　胚性愈伤组织诱导
1. 3. 1　种子萌发 6～7 d,待子叶展开时,切取子叶, 近
轴面向上斜插入培养基 LM 1( M S 基本培养基+ 2. 4-D
2. 0 mg / L+ KT 0. 25 mg / L+ CH 2000 mg/ L+ 3%蔗
糖, pH 5. 8)和LS1( MS+ 2. 4-D 2. 0 mg / L+ 6%蔗糖,
pH 5. 8) , 24±1℃, 16光照/ d 培养。
1. 3. 2　观察方法　从接种至 30、40 d 各观察一次, 最
后统计胚状体和类胚性愈伤的总数, 计算百分率。
1. 4　胚状体增殖
诱导形成的类胚性愈伤组织用 LM 1、MS0 ( MS +
3%蔗糖, pH 5. 8)和 LM 2 ( M S+ NAA0. 05 mg / L+ 6-
BA 0. 5 mg/ L+ 3%蔗糖, pH 5. 8) 2次继代增殖后, 每
2周用原培养基继代增殖 1次。
1. 5　干燥处理与植株再生
取单个子叶胚, 置于直径为 9 cm 的无菌培养皿
内,每皿放 20个大小均匀一致的子叶胚, 培养皿中间
放 MS0固体培养基 1 cm2 ,以防止胚状体过度失水。经
过干燥处理的胚状体置于 MSO 培养基上萌发。
1. 6　再生植株移栽
将根系发育良好的 5～8 cm 的再生植株连同培养
瓶在培养室内开瓶盖锻炼 1周后,洗净植株根部琼脂,
移到装有营养土的花盆中, 1个月后移栽到大田。
2　结果与分析
2. 1　苜蓿品种和培养基对胚性愈伤组织诱导的影响
2. 1. 1　供试外植体都能在 LM 1培养基上诱导并形成
愈伤组织。愈伤组织大致分为2种类型,一种为黄白色
收稿日期: 2004-01-15; 修回日期: 2004-06-14
作者简介:王玉民( 1968-) ,男,黑龙江省呼兰县人,东北师范大学在职博士生,从事大豆分子生物学和苜蓿遗传转化研究
第 13卷　第 1期
　Vo l. 13　　No. 1
草　地　学　报
ACT A AGRESTIA SIN ICA
　　2005年　 3 月
　M arch 　2005
质地较硬,呈块状结构的非胚性愈伤组织; 另一类为黄
绿色质地疏松胚性愈伤组织, 这类愈伤组织可分化出
胚状体。结果与李望丰 [ 3]所描述的幼根诱导的愈伤组
织有明显不同,该试验结果是呈浆糊状、粘稠的胚性愈
伤组织可分化出胚状体。本试验同时采用的 LS1培养
基诱导产生的愈伤组织多为非胚性愈伤组织,胚性愈
伤组织较少, 因而导致胚状体诱导率也很低。
2. 1. 2　苜蓿叶片等外植体可以直接形成体细胞胚, 也
可以通过愈伤组织或悬浮细胞培养形成。目前, 诱导苜
蓿体细胞胚发生的培养基成分已较完善。苜蓿是第一
个用于从遗传学角度研究胚胎发生的植物种,现已普
遍认为其形成体胚的能力是由其基因型决定的 [ 6, 7] , 这
一点在本实验中也得到相同的结论。在所选用的 18个
苜蓿品种诱导产生的愈伤组织类型区别不大,但是胚
性愈伤组织的诱导率差别很大。品种间在不同培养基
上的体细胞胚胎发生率见表 1。从表中可以看出, LM 1
培养基适合于大部分基因型, 胚性愈伤组织诱导率为
0～78%。而对于草原2号、中山 1号、武功苜蓿和超产
苜蓿, LS1的诱导效果好于 LM1。
表 1　供试苜蓿品种体细胞胚胎发生能力
Table 1　T he embryogenesis r ate of differ ent alfalfa v arieties
品种名称
Variety
培养基
M edium
接种数(块)
No. of explants
胚胎发生数( 30 d )
No. of embryogenes is
( 30 days)
胚胎发生数( 40 d)
No. of em bryogenesis
( 40 days )
胚胎发生率( % )
Em bryogen esis r ate
　
草原 1号苜蓿 LM 1 175 18 28 26. 3
M . varia Mart in. cv. Caoyuan No. 1 LS1 125 1 28 23. 2
草原 2号苜蓿 LM 1 50 0 10 20. 0
M . varia Mart in. cv. Caoyuan No. 2 LS1 50 3 18 42. 2
公农 1号苜蓿 LM 1 75 0 22 29. 3
M . sati va L. cv. Gongnong No. 1 LS1 75 0 5 6. 7
公农 2号苜蓿 LM 1 50 3 9 24. 0
M . sati va L. cv. Gongnong No. 2 LS1 50 0 6 12. 0
敖汉苜蓿 LM 1 125 2 30 25. 6
M . sati va L. cv. Aoh an LS1 200 0 14 7. 0
罗佐马苜蓿 LM 1 100 0 7 7. 0
M . sati va L. cv. L uozuoma LS1 100 0 7 7. 0
中山 1号 LM 1 100 2 8 10. 0
M . sati va L. cv. Zhongshan No. 1 LS1 150 0 31 20. 7
武功苜蓿 LM 1 50 1 3 8. 0
M . sati va L. cv. Wugong LS1 50 2 7 18. 0
润布勒苜蓿 LM 1 50 6 9 30. 0
M . sati va L. cv. Runbu le LS1 50 1 3 8. 0
熊岳苜蓿 LM 1 50 3 4 14. 0
M . sati va L. cv. Xiongyue LS1 50 1 5 12. 0
塞塔申苜蓿 LM 1 50 0 7 14. 0
M . sati va L. cv. S aitashen LS1 39 0 5 12. 8
超产苜蓿 LM 1 25 0 0 0
M . sati va L. cv. C haochan LS1 50 0 12 24. 0
前郭苜蓿 LM 1 25 1 5 24. 0
M . sati va L. cv. Qianguo LS1 25 0 3 12. 0
莫泊苜蓿 LM 1 25 0 6 24. 0
M . sati va L. cv. M obo LS1 25 0 4 16. 0
格拉切克苜蓿 LM 1 25 0 1 4. 0
M . sati va L. cv. Gelaqieke LS1 50 0 1 2. 0
龙牧 801 LM 1 45 32 35 78
Mel ilotoid es ruthenicus ( L ) Sojak × M .
sativ a L. cv. Longm u 801
LS1 45 11 15 33
龙牧 803 LM 1 45 26 27 60
Mel ilotoid es ruthenicus ( L ) Sojak × M .
sativ a L. cv. Longm u 803
LS1 30 5 5 16
肇东苜蓿 LM 1 75 22 31 44
M . sati va L. cv. Zhaodong LS1 30 4 1 16
2. 2　胚状体分化及增殖
4周时挑取胚性愈伤组织用原培养基继代, 1周左
右愈伤组织表面出现黄色球形胚状体,再过 1周,有大
量的胚状体出现, 颜色由黄变绿。胚状体增殖有两种方
式:一种是黄色球状体阶段增殖, 从形态上观察, 这种
增殖是胚性愈伤组织细胞不断分化的胚状体(图 1) ,
通过继代培养可保持其长期分化潜力, 胚状体也具有
良好的萌发能力;另一种增殖方式是在正常或畸形的
胚状体表面直接再生出绿色的胚状体(图 2) , 生长到
80 草　地　学　报 第 13卷
一定程度时可自行脱落,正常萌发获得再生植株,这种
增殖方式也同样可保持其长期分化潜力。宫相忠等
( 1997) [ 8]的研究结果表明,体细胞胚起源于单个的胚
性细胞,经过球形、心形、鱼雷形及子叶胚各阶段可形
成再生植株, 在这一点与本实验结果相同, 但是对于正
常或畸形胚表面直接分化胚状体方式, 似乎又不能用
体细胞胚起源于单个的胚性细胞来解释, 这种方式与
外植体直接产生体细胞胚的方式类似。
图 1　胚性愈伤组织胚状体增殖
Fig. 1　Embryo id pr olifer ation fr om embryogenic callus
图 2　胚状体表面增殖新的胚状体
F ig . 2　Embryo id pr olifer ation from former embryo ids
2. 3　干燥处理对胚状体萌发的影响
苜蓿体细胞胚胎发生获得的子叶胚不经干燥处理
萌发率为 70. 3% ,经 1周干燥处理,除畸形胚外,正常
胚状体萌发率可达到 100%。干燥处理方法对胚状体
影响很大,培养皿内如果不加一小块培养基,则子叶胚
的干燥速度过快,到第 3 d 就失去全部水分,萌发率也
由不经干燥处理的 70. 3%下降为 0。培养皿内加一小
块培养基,胚状体颜色逐渐由绿转黄, 最后为白色, 这
种类型的胚状体萌发率为 100%。于晓红等( 1999
年) [ 9]对小麦愈伤组织干燥处理也使再生频率提高了
22. 5% ,并分析该处理除使含水量降低外, 还造成了细
胞的饥饿,引起细胞发生一些生理、生化的变化, 而这
些变化可能正是植物再生所需要的。
参考文献
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学报, 2003, 11( 1) : 63-66
(上接 78页)
足 300个[ 4～6] , 其中育成品种仅占 40%左右,优良品种
的缺乏依然是我国草地建设过程中面临的关键问题。
因此,吸收借鉴先进经验,不断完善我国牧草品种或种
质材料审定的标准和要求, 可使符合一定要求的牧草
种质材料能够尽早在生态建设中发挥作用,以缓解品
种单一的被动局面, 实现草地植物种质资源的充分利
用,促进我国草地建设的持续稳定发展。
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81第 1期 王玉民等:苜蓿子叶体细胞胚的诱导和植株再生(简报)