全 文 ：第 15 卷 第 6 期
Vol. 15 No. 6
草地学报
ACTA AGRESTIA SINICA
2007 年 11 月
Nov. 2007
文章编号: 1007-0435( 2007) 06-0561-05
紫花苜蓿抗褐斑病 ISSR分子标记研究
孟芳1, 2 , 袁庆华1* , 苏德荣2, 高建明3
( 1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所, 北京 100094;
2.北京林业大学资源与环境学院, 北京 100083; 3.天津农学院, 天津 300384)
摘要: 运用 ISSR 分子标记技术,采用集群分离分析法, 对四倍体紫花苜蓿( Medicago sativa) F1 代进行抗褐斑病基
因连锁的分子标记筛选,进而建立苜蓿褐斑病抗性遗传资源筛选和分子标记辅助选择( M AS)育种技术体系。结果
表明:在 93 个随机引物中, 有 32 个能够产生清晰稳定的扩增条带, 其中 6个在中抗杂交F 1 代高抗、高感各12 个单
株所组成的抗、感 DNA 池间产生差异性条带; 在抗、感 DNA 池的各 12 个单株中,挑选出高抗 高抗杂交 F1 代 3
个组合中各 25 个单株,高感 高感杂交 F1 代 2 个组合各 25 个单株进行验证, 结果 9-R920、20-R750、21- R430、818-
R680 均与 F1 代苜蓿褐斑病抗病基因紧密连锁, 866-S800 与 F1 代苜蓿褐斑病感病基因紧密连锁。
关键词: 苜蓿; 褐斑病; ISSR标记
中图分类号: S432. 21; Q943 文献标识码: A
Study on ISSR Markers Linked to Common Leaf Spot Disease Resistance
Gene of Tetraploid Alfalfa
MENG Fang1, 2 , YU AN Qing-hua1* , SU De-rong2 , GAO Jian-m ing3
( 1. Institute of Animal Sciences, CAAS, Beijing 100094, China;
2. Co llege of Resour ces and Environment, Beijing Fo restry Univer sity, Beijing 100083, China;
3. T ianjin Ag ricultura l Colleg e, T ianjin 300384, China)
Abstract: In o rder to establish breeding technique system of mar ker- assisted selection, inter-simple se-
quence repeat ( ISSR) w as employed and accompanied w ith bulked- segregant analysis ( BSA) to detect mo-
lecular markers linked to the resistant gene of Common leaf spot in the F 1 of alfalfa (Medicago sativa L. ) .
The results show that 32 of 93 ISSR primers could amplify clear and steady bands , and there is 6 ISSR
primers in the F1 of moderately resistant could amplify polymorphic bands w ith length of 430-900 bp be-
tw een resistant and susceptible DNA pools composed of 12 highly resistant plants and 12 highly suscept ible
plants. The 6 ISSR markers w er e further verified by 12 plants apiece fr om resistant and susceptible DNA
poo ls, 25 plants apiece fr om 3 combinat ions of highly resistant highly resistant, and 25 plants apiece
from 2 combinat ions of highly suscept ible highly suscept ible. In F1 pr ogeny, 9-R920、20-R750、21-R430、
818-R680 w ere found to be signif icant ly associated w ith resistance and 866-S800 significant ly associated
w ith susceptibility .
Key words: Alfalfa; Common leaf spo t; ISSR markers
由苜蓿( Med icago sat iva)假盘菌( P seud op ez-
iz a medicag inis )引起的苜蓿褐斑病是苜蓿最常见
和破坏性很大的病害之一, 此病几乎遍布世界所有
苜蓿种植区。选育和使用抗病品种是近年来公认的
防治苜蓿褐斑病最经济、有效的办法 [ 1]。四倍体紫
花苜蓿,因其群体高度杂合, 抗病选育较困难,传统
的田间病情调查筛选工作量大, 耗时长,难以高效率
地筛选出大量抗性种质, 而分子标记辅助选择可以
对苜蓿褐斑病抗性进行高效准确的鉴定和筛选, 加
快育种进程。
收稿日期: 2007-06-27; 修回日期: 2007-08-31
基金项目:国家自然科学基金( 30471230)、国家奶业项目( 2006BAD04A04-03- 07)资助
作者简介:孟芳( 1983- ) ,女,汉族,安徽人,硕士研究生,研究方向为牧草资源, E-mail: men gfang1021@ 126. com; * 通讯作者 Author for
cor respond ence , Email : yuan qin ghua@ hotmail . com
草地学报 第 15卷
20世纪 90年代以后, DNA 标记技术的出现为
在分子水平上进行遗传多样性分析、品系鉴定、遗传
作图等提供了有力的工具。桂枝等 [ 2]曾采用 RA PD
技术对褐斑病抗性基因进行分子标记研究。ISSR
分析方法是 Zietkiew icz等[ 3] 在 SSR 即微卫星标记
基础上发展起来的一种新技术。ISSR 除了具有
RAPD的大多数优点外,多态性比例、重复性和稳定
性都比 RAPD好 [ 4] ,现已应用于很多抗性基因的分
子标记研究,如:甜菜( B eta vulg ar is )抗根腐病( Fu-
sarium culmorum )
[ 5]
,大豆抗孢囊线虫( H eteroderag-
lycineI chinoh)
[ 6]
, 小麦( Triti cum aestivum )抗叶锈病
( Pussinia recondite f . sp . tri tici)
[ 7]等。
本研究采用 ISSR 分子标记技术, 结合集群分
离分析法( Bulked Seg regant Analy sis, BSA) [ 8] 对
褐斑病抗性基因进行分子标记研究,初步确定了几
个与褐斑病抗性基因连锁的分子标记, 为建立苜蓿
褐斑病的分子标记辅助选择( MAS)育种技术体系、
抗病基因的定位、克隆以及更深入的研究奠定基础。
1 材料与方法
1. 1供试材料
根据袁庆华等[ 9] 对伊鲁瑰斯( Medicago sativa
cv. Iroquois)、萨兰斯 ( Med icago sativa cv. Sara-
nac)、沙湾 ( Medicago sativa cv. Shaw an)、沙河
(M edicago sativa cv. Shahe)和泾阳( Medicago sa-
tiva cv. Jingyang) 5 个苜蓿品种的离体叶筛选研
究,每品种筛选出最抗和最感各 5株,通过无性扦插
扩繁单独收种, 本试验在此基础上将 5个品种的抗、
感单株育苗,进一步通过田间病情调查筛选出以下
16株:
高抗材料 6株,分别为伊鲁瑰斯 2株( YL0601R,
YL0602R) ,泾阳 2株( JY0601R, JY0602R) , 沙湾 2
株( SW0601R, SW0602R) , 依次将其编号为 1, 2, 3,
4, 5, 6。
高感材料 6 株, 分别为沙河 3 株 ( SH0601S,
SH0602S, SH0603S) , 萨兰斯 3株( SL0601S, SL0602S,
SL0603S) ,依次编号为7, 8, 9, 10, 11, 12。
中抗材料 4株,分别为伊鲁瑰斯 2株( YL0601M,
YL0602M) ,沙河 2株( SH0601M, SH0601M) ,依次编
号为 A, B, C, D。
上述 16 株材料中, 高抗 高抗组合 6 个, 分别
为 1 3、2 6、3 2、4 5、6 4; 高感 高感组合 6
个,分别为 7 9、7 11、8 11、9 11、10 11、11
12;中抗中抗组合4个,分别为A B、BD、C A、
D C,并通过人工授粉套袋单独收种。在此基础上
将各杂交组合F1 代育苗,中抗中抗每组合育苗 200
株,高抗 高抗、高感 高感每组合育苗 60株。
苜蓿假盘菌 ( P seudop ez iz a medicagini s )菌种
采自中国农业科学院北京畜牧兽医研究所生长 6年
的苜蓿试验地,经室内分离纯化扩繁后,接种于保定
苜蓿上,活体保存备用。
ISSR随机引物为上海生物工程公司合成, Taq
DNA 聚合酶购自 T aKaRa公司, dNTP 购自北京汇
天东方公司,去离子甲酰胺购自上海生物工程公司。
1. 2试验方法
1. 2. 1 育苗 先将苜蓿种子经 0. 1%升汞消毒 3
m in,然后用无菌水冲洗 4 次, 放入消毒培养皿的滤
纸上, 加适量灭菌水以保持种子吸水膨胀, 放入
25 生长箱,发芽 2 d, 待幼根长到 1 cm 长时,移植
到装有蛭石和草炭(比例为 1 2)的育苗盘( 60 cm
30 cm 5 cm )中。中抗 中抗每组合育苗 200
株,高抗 高抗、高感高感每组合育苗 60株, 接种
根瘤菌后,放入温室, 温度控制在 15~ 25。待幼
苗生长 40 d后进行病菌接种。
1. 2. 2接种鉴定 采用活体整株接种法, 取分离
纯化扩繁后的苜蓿病叶,选择发病较严重的叶片,将
其放在铺有滤纸的白瓷盘上, 4保湿 24 h 后, 将白
瓷盘倒扣在为需要接种的材料搭的架子 (高度
40 cm)上,盖上塑料布, 喷水保湿 72 h, 温度 25 ,
湿度 100% ,然后将接种的苜蓿叶片移去, 接种幼苗
进行正常管理。20 d后, 进行病情调查, 将每单株
的所有叶片根据以下分级标准进行分级, 并计算单
株病情指数。
0级: 无病斑;
1级: 小叶病斑数 1~ 3个;
2级: 小叶病斑数 4~ 6个;
3级: 小叶病斑数 7~ 10个;
4级: 小叶病斑数 11~ 15个;
5级: 小叶病斑数 16个以上;
根据病情分级标准,单株的病情指数计算公式为:
病情指数( % ) = (各级病叶数 该级代表数值)调查总叶数 发病最高级的代表数值 100
高抗 高抗组合, 选择长势良好、发病程度最
低、综合性状差异大的 3个组合中的单株进行 DNA
提取。
高感高感组合,选择长势良好、发病程度高,综
合性状差异大的 2个组合中的单株进行 DNA提取。
中抗中抗组合, 选择长势良好,单株间发病程
度差异最大,综合性状差异大的 1个组合中出现抗
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第 6期 孟芳等:紫花苜蓿抗褐斑病的 ISSR 分子标记研究
病性分离的高抗和高感单株各 12 株, 大量提取
DNA,用来构建抗、感病 DNA池。
1. 2. 3DNA提取及定量苜蓿基因组 DNA 提取
采用改进 CTA B 法 [ 10]。用 0. 8% 琼脂糖凝胶对
DNA质量进行电泳检测,并以一定浓度 DNA作为
参照标准, 将各单株 DNA 浓度定为 10 ng/ L, -
20保存备用。
1. 2. 4 抗、感病 DNA池的建立对中抗中抗组
合中选出抗病性分离的 12个高抗单株,将其 DNA
等量混合,建立 F 1 代抗病 DNA 池, 从中挑选出现
抗病性分离的 12个高感单株,建立感病 DNA池。
1. 2. 5 ISSR-PCR扩增与产物检测 ISSR扩增反
应体系和反应程序参照王瑜等[ 11] 的方法。扩增结
束后,取 7. 5 L PCR扩增产物与 1. 5 L 6 Load-
ing Buf fer( T aKaRa)混匀, 点入含 0. 5 g/ mL EB
的 2% 琼脂糖凝胶中, 在 5 V/ cm 电场强度下电泳
1~ 2 h,取出凝胶,紫外灯下观察照相。
1. 2. 6 ISSR标记的筛选和验证 采用 BSA 法, 首
先用抗、感病 DNA 池对 ISSR引物进行筛选, 挑选
能够产生特异性条带的引物, 再用建成抗、感 DNA
池的各 12个单株以及高抗高抗杂交 F 1代 3个组
合中病情指数小、高感高感杂交 F 1代 2个组合中
病情指数高的单株对筛选出的引物进行验证, 每组
合挑选 25个单株。
2 结果与分析
2. 1接种鉴定筛选
根据对 F1 代田间接种鉴定筛选的结果,高抗
高抗最终保留的 3个组合分别为 4 5、2 6、1 3,
从 3个组合中各挑选出病情指数小于 8. 57的 25个
单株用于验证。高感 高感保留的 2个组合分别为
10 7和 11 12,从 2个组合中各挑选出病情指数
大于 15. 55的 25个单株用于验证。中抗 中抗保
留的组合为 A B。从 A B 组合中挑选出病情指
数小于 6. 67 的 12个单株建立抗病 DNA 池, 病情
指数大于 28. 57的 12个单株建立感病 DNA 池。
2. 2 ISSR标记的筛选
对 93个 ISSR 引物进行扩增, 结果表明, 有 32
个引物有扩增产物(占 34. 41% ) , 约在 300~ 2000
bp之间, 其中 6个引物能在混合抗、感 DNA 池间产
生特异性条带(占 18. 75%) , 依次为 9、11、20、21、
818、866号引物。6个引物的碱基序列以及退火温
度见表 1, 它们在抗、感 DNA 池间扩增的特异性条
带大小见表 2。图 1为 6个引物的 ISSR电泳图谱。
表 1 ISSR引物序列和退火温度
Table 1 Sequence and annealing t emperatur e
of ISSR primers
引物
Prim er
序列
S equen ce 5-3
退火温度( )
Annealing tem perature
9 AGAGAGAGAGAGAGAGAA 52
11 ACGACGACGACGACGACG 50
20 AGAGAGAGAGAGAGAGCT 52
21 AGAGAGAGAGAGAGAGCG 52
818 CACACACACACACACAG 52
866 CTCCTCCT CCT CCTCCTC 50
表 2 与苜蓿褐斑病抗性基因连锁的 ISSR 标记
Table 2 ISSR Markers linked to r esistance gene
of common leaf spo t
引物
Prim er
抗性
Resis tance
感性
S ens iti vity
9 920 bp -
11 - 750 bp
20 750 bp -
21 430 bp -
818 680 bp -
866 - 800 bp
图 1 6 个引物在抗、感 DNA池间的扩增结果
Fig . 1 Amplify results of 6 ISSR primer s betw een resistant
and susceptible DNA poo ls
9R: 9号引物抗 No. 9 primer res istant ; 9S : 9号引物感 No. 9
prim er sus cept ible; 21R: 21号引物抗 No. 21 primer resis tant ; 21S :
21号引物感 No. 21 p rimer sus cept ible; 818R: 818 号引物抗 No.
818 primer resistant ; 818S: 818号引物感 No. 818 primer su scept-i
ble; 20R: 20号引物抗 No. 20 primer res istan t; 20S: 20 号引物感
No. 20 prim er sus cept ible; 11R: 11号引物抗 No. 11 primer resis t-
an t; 11S : 11号引物感 No. 11 primer suscept ible; 866R: 866号引物
抗 No. 866 primer resistant ; 866S : 866 号引物感 No. 866 primer
su sceptible; M : Marker
2. 3单株验证
上述筛选出的引物标记根据其扩增出特异性条
带的大小, 分别命名为 9-R920、11-S750、20-R750、
21-R430、818-R680、866-S800。对从抗、感 DNA 池
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草地学报 第 15卷
中筛选出来的 6个 ISSR 引物, 用建成抗、感 DNA
池的各 12个单株, 高抗 高抗杂交 F 1 代 3个组合
中各 25个单株,高感高感杂交 F1 代 2个组合中各
25个单株进行验证,结果见表 3 。9-R920、20-R750、
21-R430、818-R680均与苜蓿褐斑病抗病基因紧密连
锁, 866- S800( X2 = 5. 68, P< 0. 05)与苜蓿褐斑病感
病基因紧密连锁, 其中 20-R750、21-R430 的卡方值
最大,表明其与苜蓿褐斑病抗病基因连锁最紧密。
而 11-S750在抗病单株和感病单株中出现的比例分
别为 63%、73% ,差异不显著, 表明此标记与苜蓿褐
斑病感病基因连锁不是很紧密。图 2为 21号引物
在组成抗、感 DNA 池的 12个单株中的检验结果。
图 3为 20号引物在高抗 高抗、高感 高感杂交
F 1代部分单株中的检验结果。
表 3 抗、感单株检验结果
Table 3 Validation o f ISSR markers in r esist ant and susceptible plants
单株来源
Plant origin
抗:感
Res istant :
Su scept ible
9-R920 11-S750 20-R750 21-R430 818-R680 866-S800
NR N S NR N S NR N S NR N S NR N S NR N S
抗性 DNA池:感性 DNA 池
Resistant DNA pool
Su scept ible DNA pool
12: 12 7 3 1 7 7 1 9 3 6 3 2 10
高抗 高抗:高感 高感
Resistant Resistant
Su scept ible Suscept ible
75: 50 51 28 54 38 72 26 57 12 18 24 57 20
合计 Total 87: 62 58 31 55 45 79 27 66 15 24 27 59 30
所占百分率% Percentage 67 51 63 73 91 44 76 24 28 44 67. 8 48
X 2 检验 X2-test X 2= 4. 18
P< 0. 05
X2 = 1. 44
P 0. 05
X 2 = 39. 38
P < 0. 05
X 2= 38. 95
P< 0. 05
X2 = 4. 10
P< 0. 05
X2 = 5. 68
P< 0. 05
注: NR、N S 表示检测到相关标记在抗病、感病单株上出现的植株数 Note: NR and N S repres ent th e number of the marker foun d in th e re-
s istan t or suscept ible plan t, respect ively
图 2 21号引物在抗、感各 12 株中的检验结果
Fig . 2 Validation of 21 primer s in 12 resistant and suscept ible plants
1~ 12:抗病单株 res istant plants; ~ :感病单株 suscept ible plants; R:抗病DNA 池 res istan t DN A pool;
S:感病 DNA池 suscept ible DNA pool ; M : Mark er
图 3 20 号引物在高抗 高抗、高感 高感杂交 F1 代部分单株中的检验结果
Fig . 3 Validation of 20 primer s in t he r esist ant r esistant and susceptible suscept ible plants
1~ 9:抗性单株 resi stant plants; 10- 18:感性单株 suscept ible plants; R:抗病 DNA 池 res istan t DNA pool;
S:感病 DNA 池 su scept ible DNA pool; M : Marker
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第 6期 孟芳等:紫花苜蓿抗褐斑病的 ISSR 分子标记研究
3 讨论与结论
3. 1应用 ISSR技术,对 93个随机引物进行筛选,
有 32个能够产生清晰稳定的扩增条带,其中 6个在
中抗杂交 F 1 代, 高抗、高感各 12 个单株所组成的
抗、感 DNA 池间产生差异性条带。随后, 用建成
抗、感 DNA 池的各 12个单株, 高抗 高抗杂交 F 1
代 3个组合中各 25个单株, 高感 高感杂交 F1 代
2个组合各 25 个单株进行验证, 9-R920、20-R750、
21-R430、818-R680均与 F 1 代苜蓿褐斑病抗病基因
紧密连锁, 866- S800与 F 1 代苜蓿褐斑病感病基因
紧密连锁。
3. 2表 2显示抗性标记出现在 F1 代感病单株的比
例也很高,感性标记在 F1 代抗病单株中也占有一定
比例,结果并不矛盾。D. E. Obert [ 12] 等在用 AFLP
标记对同源四倍体苜蓿的抗三叶草霜霉菌( P. t ri-
f ol ior um de Bary)基因进行研究时, 出现了相似的
结果,其结果显示 ACACT C208标记与 F 1 代感病
基因紧密连锁, 而在 F1 抗、感病单株中出现的比例
分别为 88. 8%和94. 2%。这主要是因为褐斑病抗性
基因在其杂交后代的遗传中可能会发生重组。
Skinner 和 Stutenille[ 13~ 15] 研究表明二倍体苜蓿的
三叶草霜霉菌抗病基因的遗传至少包含 3 个主效
基因和一些微效基因。本试验所用的紫花苜蓿为异
花授粉、自交不亲和的同源四倍体植物,群体高度杂
合,其遗传将会更加复杂。另外, 在对 F 1 代进行田
间抗病性鉴定评价时,也存在一定的误差。
3. 3 在筛选出较理想的与目的基因连锁的 ISSR
标记后,一方面,应该建立 F 2 分离群体,采用同样的
引物对 F2 代植株进行扩增, 进一步验证各 ISSR 标
记的可靠程度, 以及与目的基因间的遗传距离;另一
方面,应该回收 ISSR 标记的特异性条带, 进行挖
带、克隆、测序, 并根据测序结果设计更长的寡核苷
酸引物对, 将其转化为 SCAR 标记,以提高试验的
重复性和稳定性。
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(责任编辑 梁艳萍)
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