全 文 ：第２０卷　第１期
　Ｖｏｌ．２０　 Ｎｏ．１
草　地　学　报
ＡＣＴＡ　ＡＧＲＥＳＴＩＡ　ＳＩＮＩＣＡ
　　　２０１２年　 １月
　 Ｊａｎ．　　２０１２
扁穗冰草脱水素基因的克隆和表达特性分析
张　楠，张林生＊，邢　媛，刘　兰，李嘉宏
（西北农林科技大学生命科学学院 旱区作物逆境生物学国家重点实验室，陕西 杨陵　７１２１００）
摘要：扁穗冰草（Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ　ｃｒｉｓｔａｔｕｍ （Ｌ．）Ｇａｅｒｔｎ）生长于干旱、半干旱地区，具有耐旱、耐寒、抗病等特性。采用
ＲＴ－ＰＣＲ技术从扁穗冰草叶片中克隆３个脱水素基因（Ａｃｗｃｏｒ４１０，Ａｃｗｚｙ２和Ａｃｗｃｓ１２０）和１个肌动蛋白β－ａｃｔｉｎ
基因（Ａｃβ－ａｃｔｉｎ）。半定量ＲＴ－ＰＣＲ分析表明，Ａｃｗｃｏｒ４１０基因对温度敏感，对干旱胁迫不敏感；Ａｃｗｚｙ２基因对温
度不敏感，而对干旱胁迫敏感；Ａｃｗｃｓ１２０基因则对冷胁迫及干旱胁迫均有响应。Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ表明，扁穗冰草含有
４０ｋＤ脱水素，该蛋白的表达随冷胁迫和干旱胁迫程度的变化而变化，对干旱胁迫的响应比冷胁迫更为明显，推测
该脱水素属于干旱敏感型。
关键词：扁穗冰草；脱水素；半定量ＲＴ－ＰＣＲ；蛋白质印迹
中图分类号：Ｓ５４３．９；Ｑ９４３．２　　　　文献标识码：Ａ　　　　　文章编号：１００７－０４３５（２０１２）０１－０１３９－０７
Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｄｅｈｙｄｒｉｎ　Ｇｅｎｅ　ｆｒｏｍ
Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ　ｃｒｉｓｔａｔｕｍ （Ｌ．）Ｇａｅｒｔｎ
ＺＨＡＮＧ　Ｎａｎ，ＺＨＡＮＧ　Ｌｉｎ－ｓｈｅｎｇ＊，ＸＩＮＧ　Ｙｕａｎ，ＬＩＵ　Ｌａｎ，ＬＩ　Ｊｉａ－ｈｏｎｇ
（Ｓｔａｔｅ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｃｒｏｐ　Ｓｔｒｅｓｓ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｉｎ　Ａｒｉｄ　Ａｒｅａｓ，Ｃｏｌｅｄｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ　Ａ＆Ｆ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，
Ｙａｎｇｌｉｎｇ，Ｓｈａａｎｘｉ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ　７１２１００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ　ｃｒｉｓｔａｔｕｍ （Ｌ．）Ｇａｅｒｔｎ　ｇｒｏｗｓ　ｉｎ　ａｒｉｄ，ｓｅｍｉ－ａｒｉｄ　ａｎｄ　ａｌｐｉｎｅ　ｒｅｇｉｏｎｓ　ｐｏｓｓｅｓｓｉｎｇ　ａ　ｓｔｒｏｎｇ
ｃａｐａｃｉｔｙ　ｏｆ　ｃｏｌｄ　ａｎｄ　ｄｒｏｕｇｈｔ　ａｎｄ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　ｏｆ　３ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｄｅｈｙｄｒｉｎ　ｇｅｎｅｓ（Ａｃｗｃｏｒ４１０，
Ａｃｗｚｙ２ａｎｄ　Ａｃｗｃｓ１２０）ａｎｄ　ａβ－ａｃｔｉｎ　ｇｅｎｅ（Ａｃβ－ａｃｔｉｎ）ｗｅｒｅ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｆｒｏｍ　Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ　ｃｒｉｓｔａｔｕｍ （Ｌ．）
Ｇａｅｒｔｎ　ｌｅａｆ　ｗｉｔｈ　ＲＴ－ＰＣＲ．Ｓｅｍｉ－ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ＲＴ－ＰＣＲ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　Ａｃｗｃｏｒ４１０ｗａｓ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｔｏ　ｃｏｌｄ
ｓｔｒｅｓｓ，ｂｕｔ　ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｔｏ　ｄｒｏｕｇｈｔ；Ａｃｗｚｙ２ｗａｓ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｔｏ　ｄｒｏｕｇｈｔ　ｂｕｔ　ｎｏｔ　ｔｏ　ｃｏｌｄ；Ａｃｗｃｓ１２０ｈａｄ　ｒｅ－
ｓｐｏｎｓｅ　ｔｏ　ｂｏｔｈ　ｃｏｌｄ　ａｎｄ　ｄｒｏｕｇｈｔ　ｓｔｒｅｓｓ．Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅｒｅ　ｗａｓ　ａ　ｄｅｈｙｄｒｉｎ　ｏｆ　４０ｋＤ　ｉｎ
Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ　ｃｒｉｓｔａｔｕｍ （Ｌ．）Ｇａｅｒｔｎ　ｌｅａｆ．Ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｖａｒｉｅｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｓｔｒｅｓｓ　ｄｅｇｒｅｅ　ｃｈａｎｇｅ　ｕｎｄｅｒ
ｂｏｔｈ　ｃｏｌｄ　ａｎｄ　ｄｒｏｕｇｈｔ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｉｔ　ｗａｓ　ｄｅｄｕｃｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｉｓ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｓ　ａ　ｄｒｏｕｇｈｔ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｄｅｈｙｄｒｉｎ　ｄｕｅ　ｔｏ　ｉｔｓ
ｍｏｒｅ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｔｏ　ｄｒｏｕｇｈｔ　ｔｈａｎ　ｔｏ　ｃｏｌｄ　ｓｔｒｅｓｓ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ　ｃｒｉｓｔａｔｕｍ （Ｌ．）Ｇａｅｒｔｎ；Ｄｅｈｙｄｒｉｎ；Ｓｅｍｉ－ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ＲＴ－ＰＣＲ；Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ
　　脱水素（ｄｅｈｙｄｒｉｎ）属于ＬＥＡ（ｌａｔｅ　ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ
ａｂｕｎｄａｎｔ）Ⅱ家族，也称为ＲＡＢ（ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ　ｔｏ　ＡＢＡ）蛋
白。在种子胚胎发育晚期大量积累，该基因也在逆境
胁迫下被诱导表达［１］，如干旱、霜冻、盐碱等。研究认
为，植物脱水素在逆境下表达，对细胞大分子在脱水
过程中免受伤害起着重要作用［２，３］。脱水素最早由
Ｍｕｎｄｙ在水稻（Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ）中发现，并被命名为
ＲＡＢ２１［４］，随着研究的深入，已经从多种植物中克隆
到脱水素基因，如白杨脱水素基因ｐｅｕｄｈｎ１［５］、油菜
ＢｊＤＨＮ１／ＢｊＤＨＮ２［６］、羊乳ＣｌＤｈｎ［７］、青稞ｄｈｎ４［８］、
小麦ｗｚｙ２［９］等。
脱水素由８２～５７５个氨基酸组成，富含甘氨酸
和赖氨酸，缺少半胱氨酸和色氨酸［１０］，质量为９～
２００ｋＤ。脱水素序列具有高度保守性，含有３个保
守片段，即 Ｋ，Ｓ，Ｙ片段。Ｋ片段位于蛋白质的Ｃ
端，由１５个氨基酸组成（ＥＫＫＧＩＭＤＫＩＫＥＫＬＰＧ），
富含赖氨酸，在肽链中有１～１２个拷贝［１０，１１］，脱水
素均含Ｋ片段，但不一定含有Ｓ和Ｙ片段。脱水素
的Ｓ片段，主要由丝氨酸残基组成，该片段的磷酸化
与脱水素在信号肽的引导下进入细胞核有关［１２］。
收稿日期：２０１１－０８－１３；修回日期：２０１１－１０－２０
基金项目：国家自然科学基金项目（３０６７１２５３）（３１０７１３４９）资助
作者简介：张楠（１９８６－），男，陕西杨凌人，硕士，主要从事分子生物学研究，Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｐｔｏｎｇ１７９０＠１２６．ｃｏｍ；＊通信作者 Ａｕｔｈｏｒ　ｆｏｒ　ｃｏｒｒｅ－
ｓｐｏｎｄｅｎｃｅ，Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉｎｓｚｈａｎｇ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
草　地　学　报 第２０卷
Ｙ片段［（Ｖ／Ｔ）ＤＥＹＧＮＰ］位于蛋白质的Ｎ末端，有１～３个
串联拷贝，该片段序列与细菌及植物分子伴侣的核
苷酸结合位点有一定的相似度。Ｋ，Ｓ，Ｙ片段在肽
链中通常以ＹＳＫ的顺序组合，可以利用共存的Ｙ，
Ｓ，Ｋ片段进行多肽链的识别，此方法亦称为“ＹＳＫ
速记”［１３］。根据脱水素保守序列特点，将其分为５
个亚类：ＹｎＳＫ２，Ｋｎ，ＫｎＳ，ＳＫｎ和Ｙ２Ｋｎ，其中 Ｙｎ－
ＳＫ２型脱水素在自然界中较多［１２］。
扁穗冰草（Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ　ｃｒｉｓｔａｔｕｍ （Ｌ．）Ｇａｅｒｔｎ）
是多年生禾本科牧草，分布于干旱、半干旱及高寒地
区，具有较强的抗旱、抗寒性［１４］、抗小麦白粉病、黄
矮病、锈病等特性［１５］和丰产的特点［１６］。该物种可作
为干旱地区水土保持和绿化植物，由于拥有较多优
良基因而对于小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ａｅｓｔｉｖｕｍ）的遗传改良
具有重要的利用价值［１７］。目前脱水素在冰草属的
研究尚未见报道，本研究旨在克隆其脱水素基因，通
过ＲＴ－ＰＣＲ技术、半定量ＰＣＲ技术和 Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ
研究扁穗冰草脱水素基因在干旱及低温胁迫下的表
达，为深入研究脱水素的表达机理奠定基础。
１　材料与方法
１．１　供试材料
扁穗冰草草籽由西北农林科技大学生命科学学
院中心实验室提供。试验使用的试剂，ＲＮＡ提取试
剂Ｔｒｉｚｏｌ，逆转录试剂盒均购自大连宝生物（ＴａＫａＲａ）
公司；ｐＧＥＭ－Ｔ　Ｅａｓｙ　Ｖｅｃｔｏｒ购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司；Ｔａｑ
ＤＮＡ聚合酶（２×Ｔａｑｍｉｘ）购自沃尔森公司；脱水素单
克隆抗体购自瑞典Ａｇｒｉｓｅｒａ公司；碱性磷酸酶（ＡＰ）
标记的羊抗兔抗体购自北京中杉金桥生物技术有限
公司；碱性磷酸酶显色试剂盒购自武汉博士德生物工
程有限公司，其他试剂均为分析纯。
１．２　干旱胁迫处理和冷胁迫处理
扁穗冰草种植于蛭石中，并置于恒温培养箱
（２５℃），用称重法控制含水量。当苗长至约２０ｃｍ
时，自然干旱至蛭石含水量为２０％时开始采样，１组
用于干旱胁迫分析，按照干旱１，３，５，７ｄ采集其叶
片，然后复水，并在复水１ｄ时采集冰草叶片。另１
组用于冷胁迫分析，即置于４℃条件下，分别于１２，
２４，３６，６０ｈ采集叶片，然后回复至室温（２５℃），培
养１２ｈ后采集叶片。
１．３　ＲＴ－ＰＣＲ克隆和半定量ＲＴ－ＰＣＲ分析
１．３．１　基因克隆　参照 Ｔｒｉｚｏｌ试剂的操作方法，
提取各胁迫处理时期的冰草叶片ＲＮＡ，使用逆转录
试剂盒（Ｔａｋａｒａ）反转录合成ｃＤＮＡ第１链，ＲＴ产
物保存于－８０℃冰箱。利用ＤＮＡｍａｎ对ＧｅｎＢａｎｋ
中禾本科植物脱水素基因ｗｃｏｒ４１０，ｗｚｙ２，ｗｃｓ１２０
和肌动蛋白基因β－ａｃｔｉｎ进行比对，针对其保守区，
使用Ｐｒｉｍｅｒ　５．０设计４对引物（引物由上海生工合
成），扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析，回收纯化后
的目的产物与ｐＧＥＭ－Ｔ　Ｅａｓｙ　Ｖｅｃｔｏｒ连接，转化至
大肠杆菌感受态细胞ＪＭ１０９中，经菌落筛选及ＰＣＲ
鉴定后，送至上海桑尼公司测序。将目的片段在
ＮＣＢＩ上进行ｎＢｌａｓｔ并分析。
１．３．２　半定量ＲＴ－ＰＣＲ分析　选用本试验中得到
的扁穗冰草肌动蛋白基因ＡＣβ－ａｃｔｉｎ（ＧｅｎＢａｎｋ登
录号：ＪＮ００７０３１）作为内标基因。通过预试验探索
确定半定量试验条件（表１），并进行半定量 ＰＴ－
ＰＣＲ分析。
表１　半定量ＲＴ－ＰＣＲ条件
Ｔａｂｌｅ　１　Ｇｅｎｅ　ｎａｍｅ，ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，ＰＣＲ　ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ａｎｄ　ｓｉｚｅｓ　ｏｆ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ
基因名称
Ｇｅｎｅ　ｎａｍｅ
引物序列
Ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ＰＣＲ程序
ＰＣＲ　ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
扩增片段长度／ｂｐ
Ｓｉｚｅｓ　ｏｆ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ
Ａｃｗｃｏｒ４１０
Ｆｏｒｗａｒｄ：５′－ＣＧＡＴＣＴＣＧＡＴＣＡＴＧＧＡＧＧＡＴＧＡＧＡＧ－３′
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５′－ＣＣＧＧＧＣＡＧＣＴＴＣＴＣＣＴＴＧＡＴＣＴ－３′
９４℃４ｍｉｎ；９４℃３０ｓ；５８℃３０ｓ；７２℃
１ｍｉｎ；２５ｃｙｃｌｅｓ　７２℃７ｍｉｎ
５６２
Ａｃｗｚｙ２
Ｆｏｒｗａｒｄ：５′－ＧＡＡＡＡＡＣＣＡＣＡＡＧＴＴＧＣＡＧＣＣＡＡＧＴ－３′
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５′－ＧＣＣＧＧＴＧＣＣＧＴＣＧＧＴＧＣＣＡＴＧＣＧＴＣ－３′
９４℃４ｍｉｎ；９４℃３０ｓ；５７℃３０ｓ；７２℃
１ｍｉｎ；２７ｃｙｃｌｅｓ　７２℃７ｍｉｎ
５３２
Ａｃｗｃｓ１２０
Ｆｏｒｗａｒｄ：５′－ＡＣＡＴＣＧＣＣＧＧＣＧＡＧＡＡＧＡＡＧ－３′
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５′－ＧＧＧＡＧＣＴＴＧＴＣＣＴＴＧＡＴＧＴＴＣＴＣＣＡＴ－３′
９４℃４ｍｉｎ；９４℃３０ｓ；６０℃３０ｓ；７２℃
１ｍｉｎ；２５ｃｙｃｌｅｓ　７２℃７ｍｉｎ
２５２
Ａｃβ－ａｃｔｉｎ
Ｆｏｒｗａｒｄ：５′－ＴＴＣＧＴＴＴＧＧＡＣＣＴＴＧＣＴＧＧＣ－３′
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５′－ＣＡＣＡＣＡＡＴＧＴＣＧＣＴＴＡＧＧＣＡ－３′
９４℃４ｍｉｎ；９４℃３０ｓ；６０℃３０ｓ；７２℃
１ｍｉｎ；２５ｃｙｃｌｅｓ　７２℃７ｍｉｎ
７９７
０４１
第１期 张楠等：扁穗冰草脱水素基因的克隆和表达特性分析
１．４　扁穗冰草脱水素的 Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ
扁穗冰草叶片总蛋白提取：称取扁穗冰草叶片
０．３ｇ，用液氮研磨，加蛋白质提取液５ｍＬ·ｇ－１，研
磨为匀浆，置于５ｍＬ离心管中涡旋２ｍｉｎ，４℃
１００００ｒ·ｍｉｎ－１离心１５ｍｉｎ，上清液于８０℃水浴１０
ｍｉｎ，再离心，上清液加４倍体积丙酮于－２０℃沉淀
过夜，按一定比例加上样缓冲液，存放于－２０℃。
蛋白质的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析：聚丙烯酰胺凝胶
（５％的浓缩胶，１２％的分离胶）采用浓缩胶１５ｍＡ
恒流，分离胶２０ｍＡ恒流，电泳２～４ｈ，考马斯亮蓝
法染色２ｈ后脱色，凝胶成像系统照相。
Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ分析：采用半干式转移槽，将凝胶
中蛋白质转移到 ＰＶＤＦ膜上。电流按凝胶面积
０．６５～１．０ｍＡ·ｃｍ－２计，转移０．５～２ｈ。一抗为
脱水素单克隆抗体，二抗为碱性磷酸酶标记的羊抗
兔抗体，利用碱性磷酸酶显色试剂盒进行免疫检测。
２　结果与分析
２．１　扁穗冰草脱水素基因ｃＤＮＡ的克隆与测序
使用ＤＮＡｍａｎ将Ｇｅｎｂａｎｋ上报道的禾本科植
物的脱水素基因ｗｃｏｒ４１０，ｗｚｙ２，ｗｃｓ１２０序列和肌
动蛋白序列β－ａｃｔｉｎ分别进行比对，针对其保守序列
设计引物。将从培养的扁穗冰草叶片中提取的总
ＲＮＡ反转录后进行ＰＣＲ扩增，结果如图１所示。
由图１可知，扩增获得４个相关基因序列，回收产
物，并连接转化，测序结果表明其大小分别为５６２，
５３２，２５２及７９７ｂｐ，将其分别命名为Ａｃｗｃｏｒ４１０，
Ａｃｗｚｙ２，Ａｃｗｃｓ１２０和Ａｃβ－ａｃｔｉｎ。
将４个基因片段分别在ＮＣＢＩ上进行ｎＢｌａｓｔ分
析，其相似度分析如表２～表５所示。
图１　扁穗冰草目的基因片段扩增琼脂糖凝胶电泳图
Ｆｉｇ．１　Ａｇａｒｏｓｅ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｏｆ　ｔａｒｇｅｔ　ｇｅｎｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ
注：Ｍ．ＤＬ２０００，１．目的基因，Ａ．Ａｃｗｃｏｒ４１０，Ｂ．Ａｃｗｚｙ２，Ｃ．Ａｃｗｃｓ１２０，Ｄ．Ａｃβ－ａｃｔｉｎ
Ｎｏｔｅ：Ｍ．ＤＬ２０００，１．Ｔａｒｇｅｔ　ｇｅｎｅ，Ａ．Ａｃｗｃｏｒ４１０，Ｂ．Ａｃｗｚｙ２，Ｃ．Ａｃｗｃｓ１２０，Ｄ．Ａｃβ－ａｃｔｉｎ
表２　Ａｃｗｃｏｒ４１０与其他植物中脱水素ｗｃｏｒ４１０基因的相似度比对
Ｔａｂｌｅ　２　Ｉｄｅｎｔｉｔｙ　ｏｆ　Ａｃｗｃｏｒ４１０ｗｉｔｈ　ｄｅｈｙｄｒｉｎ　ｇｅｎｅ　ｗｃｏｒ４１０ｉｎ　ｏｔｈｅｒ　ｐｌａｎｔｓ
Ｇｅｎｂａｎｋ登录号
Ｇｅｎｂａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．
物种
Ｏｒｇａｎｉｓｍ
Ｅ值
Ｅ－Ｖａｌｕｅ
与Ａｃｗｃｏｒ４１０相似度
Ｉｄｅｎｔｉｔｙ　ｗｉｔｈ　Ａｃｗｃｏｒ４１０
Ｌ２９１５２．１　 Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ａｅｓｔｉｖｕｍ　 ０．０　 ９４％
ＥＵ１２４６５８．１　 Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ａｅｓｔｉｖｕｍ　 ０．０　 ９３％
Ｕ７３２１１．１　 Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ａｅｓｔｉｖｕｍ　 ０．０　 ９２％
ＡＪ８９０１４０．１　 Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ｔｕｒｇｉｄｕｍｓｕｂｓｐ．ｄｕｒｕｍ　 ０．０　 ９２％
ＡＦ１８１４５８．１　 Ｈｏｒｄｅｕｍ　ｖｕｌｇａｒｅ　 ０．０　 ８８％
Ｘ８４０５６．１　 Ｈｏｒｄｅｕｍ　ｖｕｌｇａｒｅ　 ０．０　 ８９％
表３　Ａｃｗｚｙ２与其他植物中脱水素ｗｚｙ２基因的相似度
Ｔａｂｌｅ　３　Ｉｄｅｎｔｉｔｙ　ｏｆ　Ａｃｗｚｙ２ｗｉｔｈ　ｄｅｈｙｄｒｉｎ　ｇｅｎｅ　ｗｚｙ２ｉｎ　ｏｔｈｅｒ　ｐｌａｎｔｓ
Ｇｅｎｂａｎｋ登录号
Ｇｅｎｂａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．
物种
Ｏｒｇａｎｉｓｍ
Ｅ值
Ｅ－Ｖａｌｕｅ
与Ａｃｗｚｙ２相似度
Ｉｄｅｎｔｉｔｙ　ｗｉｔｈ　Ａｃｗｚｙ２
Ｘ１５２８６．１　 Ｈｏｒｄｅｕｍ　ｖｕｌｇａｒｅ　 １ｅ－１７４　 ９２％
ＡＦ０３１２４８．１　 Ｌｏｐｈｏｐｙｒｕｍ　ｅｌｏｎｇａｔｕｍ　 ４ｅ－１５５　 ９３％
ＡＹ８９５９２８．１　 Ｈｏｒｄｅｕｍ　ｖｕｌｇａｒｅ　ｓｕｂｓｐ．ｓｐｏｎｔａｎｅｕｍ　 ７ｅ－１０８　 ９１％
ＡＦ０４３０９２．１　 Ｈｏｒｄｅｕｍ　ｖｕｌｇａｒｅ　 ７ｅ－１０８　 ９１％
ＥＵ３９５８４４．２　 Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ａｅｓｔｉｖｕｍ　 ２ｅ－９９　 ９４％
ＡＭ１８０９２６．１　 Ａｅｇｉｌｏｐｓ　ｕｍｂｅｌｌｕｌａｔａ　 ３ｅ－９６　 ９４％
１４１
草　地　学　报 第２０卷
表４　Ａｃｗｃｓ１２０与其他植物中脱水素ｗｃｓ１２０基因的相似度
Ｔａｂｌｅ　４　Ｉｄｅｎｔｉｔｙ　ｏｆ　Ａｃｗｃｓ１２０ｗｉｔｈ　ｄｅｈｙｄｒｉｎ　ｇｅｎｅ　ｗｃｓ１２０ｉｎ　ｏｔｈｅｒ　ｐｌａｎｔｓ
Ｇｅｎｂａｎｋ登录号
Ｇｅｎｂａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．
物种
Ｏｒｇａｎｉｓｍ
Ｅ值
Ｅ－Ｖａｌｕｅ
与Ａｃｗｃｓ１２０相似度
Ｉｄｅｎｔｉｔｙ　ｗｉｔｈ　Ａｃｗｃｓ１２０
Ｌ２７５１６．１　 Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ａｅｓｔｉｖｕｍ　 ６ｅ－３６　 １００％
Ｍ９３３４２．２　 Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ａｅｓｔｉｖｕｍ　 ３ｅ－３４　 ９６％
ＡＦ０３１２４７．１　 Ｌｏｐｈｏｐｙｒｕｍ　ｅｌｏｎｇａｔｕｍ　 ３ｅ－３４　 ９３％
ＡＹ３４９２３１．１　 Ｈｏｒｄｅｕｍ　ｖｕｌｇａｒｅ　 ７ｅ－３０　 ９０％
ＡＭ１８０９２８．１　 Ａｅｇｉｌｏｐｓ　ｕｍｂｅｌｌｕｌａｔａ　 ２ｅ－１６　 ９５％
ＤＱ４８７１１０．１　 Ｐａｎａｘ　ｇｉｎｓｅｎｇ　 １ｅ－０７　 ９３％
ＡＹ５８７１０９．１　 Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ　 １ｅ－０７　 ９３％
表５　Ａｃβ－ａｃｔｉｎ与其他植物中肌动蛋白ａｃｔｉｎ基因的相似度
Ｔａｂｌｅ　５　Ｉｄｅｎｔｉｔｙ　ｏｆ　Ａｃβ－ａｃｔｉｎ　ｗｉｔｈ　ａｃｔｉｎｇｅｎｅ　ｉｎ　ｏｔｈｅｒ　ｐｌａｎｔｓ
Ｇｅｎｂａｎｋ登录号
Ｇｅｎｂａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．
物种
Ｏｒｇａｎｉｓｍ
Ｅ值
Ｅ－Ｖａｌｕｅ
与Ａｃβ－ａｃｔｉｎ相似度
Ｉｄｅｎｔｉｔｙ　ｗｉｔｈ　Ａｃβ－ａｃｔｉｎ
ＡＢ１８１９９１．１　 Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ａｅｓｔｉｖｕｍ　 ０．０　 ９５％
ＦＪ５５７２４０．１　 Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ　ｍｏｎｇｏｌｉｃｕｍ　 ０．０　 ９６％
ＡＫ２４８７１０．１　 Ｈｏｒｄｅｕｍ　ｖｕｌｇａｒｅ　ｓｕｂｓｐ．ｖｕｌｇａｒｅ　 ０．０　 ９４％
ＧＵ９９２３８６．１　 Ｌｅｙｍｕｓ　ｍｕｌｔｉｃａｕｌｉｓ　 ０．０　 ９７％
ＧＵ１３８７５７．１　 Ｓｏｒｇｈｕｍ　ｂｉｃｏｌｏｒ　 ０．０　 ９７％
ＮＭ＿００１１５５１７９．１　 Ｚｅａ　ｍａｙｓ ０．０　 ８８％
ＡＹ０１４２７９．１　 Ｌｏｌｉｕｍ　ｐｅｒｅｎｎｅ　 ０．０　 ９３％
　　Ｂｌａｓｔ结果表明，各基因与相应同源基因序列的相
似度均达到９０％以上，将序列上传至Ｇｅｎｂａｎｋ，序列号
分别为：Ａｃｗｃｏｒ４１０：ＪＮ００７０２９，Ａｃｗｚｙ２：ＪＮ００７０３０，Ａｃ－
ｗｃｓ１２０：ＪＮ００７０３２，Ａｃβ－ａｃｔｉｎ：ＪＮ００７０３１。
使用Ｇｅｎｂａｎｋ在线软件ＯＲＦ－Ｆｉｎｄｅｒ研究各序列
编码区域，得到基因片段的推衍氨基酸序列如下：
　　Ａｃｗｃｏｒ４１０推衍氨基酸序列：
ＭＥＤＥＲＳＴＱＳＹＱＧＧＥＡＤＱＶＥＶＴＤＲＧＬＬＧＮＬＬＧＫＫＫＡＥＥＤＫＱＫＥＥＥＬＶＴＧＭＥＫＶＳＶＥＥＰＥＶＫＫＥＥＨ
ＥＧＧＥＫＫＥＴＬＦＳＫＬＨＲＳＳＳＳＳＳＳＳＳＤＥＥＥＥＥＶＩＧＤＮＧＥＶＩＫＲＫＫＫＫＧＬＲＡＫＬＡＧＨＫＧＴＥＧＥＨＡＴＧＬＰＡ
ＰＡＡＰＰＳＶＱＴＨＧＧＨＨＤＴＤＶＶＶＥＫＩＤＧＤＶＫＴＥＡＴＰＡＶＰＥＥＥＫＫＧＦＭＥＫＩＫＥＫＬＰＧ
Ａｃｗｚｙ２推衍氨基酸序列：
ＭＣＫＭＥＹＱＧＱＱＱＨＧＱＡＴＮＲＶＤＥＹＧＮＰＶＡＧＨＧＡＧＴＧＭＧＡＨＧＧＶＧＴＧＶＡＴＧＧＨＦＱＰＳＲＥＥＨＫＡＧ
ＧＩＬＱＲＳＧＳＳＳＳＳＳＳＳＥＤＤＧＭＧＧＲＲＫＫＧＩＫＤＫＩＫＥＫＬＰＧＧＨＧＤＱＱＱＴＡＤＴＹＧＱＱＧＨＴＧＭＡＧＴＧＡＨＧ
ＴＴＡＴＧＧＴＹＧＱＱＧＨＡＧＭＴＧＴＧＴＨＧＴＤＧＴＧ
Ａｃｗｃｓ１２０推衍氨基酸序列：
ＬＡＰＴＧＳＲＤＴＰＧＶＴＳＡＧＴＨＧＴＧＥＫＫＧＩＭＥＫＩＫＥＫＬＰＧＧＴＧＴＨＧＴＧＥＫＫＧＶＭＥＮＩＫＤＫＬ
Ａｃβ－ａｃｔｉｎ推衍氨基酸序列：
ＭＰＤＧＱＶＩＴＩＧＳＥＲＦＲＣＰＥＶＬＦＱＰＳＨＶＧＭＥＶＰＧＩＨＥＡＴＹＮＳＩＭＫＣＤＶＤＩＲＫＤＬＹＧＮＶＶＬＳＧＧＳＴＭＦＰＧ
ＩＡＤＲＭＮＫＥＩＴＡＬＡＰＳＳＭＫＶＫＶＩＡＰＰＥＲＫＹＳＶＷＩＧＧＳＩＬＡＳＬＳＴＦＱＱＭＷＩＳＫＡＥＹＤＥＳＧＰＧＩＶＨＭＫＣＦ
　　将４个蛋白片段分别在 ＮＣＢＩ网站上进行 ｎＢｌａｓｔ分析，其相似度分析如表６～表９所示。
表６　Ａｃｗｃｏｒ４１０推衍氨基酸与其他植物中脱水素 ＷＣＯＲ４１０的相似度比对
Ｔａｂｌｅ　６　Ｉｄｅｎｔｉｔｙ　ｏｆ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｄｅｄｕｃｅｄ　ｆｒｏｍ　Ａｃｗｃｏｒ４１０ｗｉｔｈ　ｄｅｈｙｄｒｉｎ　ＷＣＯＲ４１０ｉｎ　ｏｔｈｅｒ　ｐｌａｎｔｓ
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物种
Ｏｒｇａｎｉｓｍ
Ｅ值
Ｅ－Ｖａｌｕｅ
与Ａｃｗｃｏｒ４１０相似度
Ｉｄｅｎｔｉｔｙ　ｗｉｔｈ　Ａｃｗｃｏｒ４１０
Ｐ４６５２４．１　 Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ａｅｓｔｉｖｕｍ　 ３ｅ－７３　 ８８％
ＡＡＢ１８２０２．１　 Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ａｅｓｔｉｖｕｍ　 ３ｅ－６５　 ８９％
ＡＡＤ０２２５９．１　 Ｈｏｒｄｅｕｍ　ｖｕｌｇａｒｅ　ｓｕｂｓｐ．ｖｕｌｇａｒｅ　 １ｅ－６７　 ８４％
ＣＡＩ６５４０４．１　 Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ｄｕｒｕｍ　 ３ｅ－６２　 ８５％
２４１
第１期 张楠等：扁穗冰草脱水素基因的克隆和表达特性分析
表７　Ａｃｗｚｙ２推衍氨基酸与其他植物中脱水素 ＷＺＹ２的相似度比对
Ｔａｂｌｅ　７　Ｉｄｅｎｔｉｔｙ　ｏｆ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｄｅｄｕｃｅｄ　ｆｒｏｍ　Ａｃｗｚｙ２ｗｉｔｈ　ｄｅｈｙｄｒｉｎ　ＷＺＹ２ｉｎ　ｏｔｈｅｒ　ｐｌａｎｔｓ
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Ｏｒｇａｎｉｓｍ
Ｅ值
Ｅ－Ｖａｌｕｅ
与Ａｃｗｚｙ２相似度
Ｉｄｅｎｔｉｔｙ　ｗｉｔｈ　Ａｃｗｚｙ２
Ｐ１２９４８．１　 Ｈｏｒｄｅｕｍ　ｖｕｌｇａｒｅ　ｓｕｂｓｐ．ｖｕｌｇａｒｅ　 ３ｅ－６３　 ８８％
ＡＡＦ０１６９１．１　 Ｈｏｒｄｅｕｍ　ｖｕｌｇａｒｅ　ｓｕｂｓｐ．ｖｕｌｇａｒｅ　 １ｅ－５８　 ８３％
ＡＡＣ０５９２２．１　 Ｌｏｐｈｏｐｙｒｕｍ　ｅｌｏｎｇａｔｕｍ　 ４ｅ－５８　 ８４％
ＡＡＬ５０７９１．１　 Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ａｅｓｔｉｖｕｍ　 ５ｅ－５３　 ８７％
表８　Ａｃｗｃｓ１２０推衍氨基酸与其他植物中脱水素 ＷＣＳ１２０的相似度比对
Ｔａｂｌｅ　８　Ｉｄｅｎｔｉｔｙ　ｏｆ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｄｅｄｕｃｅｄ　ｆｒｏｍ　Ａｃｗｃｓ１２０ｗｉｔｈ　ｄｅｈｙｄｒｉｎ　ＷＣＳ１２０ｉｎ　ｏｔｈｅｒ　ｐｌａｎｔｓ
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与Ａｃｗｃｓ１２０相似度
Ｉｄｅｎｔｉｔｙ　ｗｉｔｈ　Ａｃｗｃｓ１２０
ＡＡＣ０５９２１．１　 Ｌｏｐｈｏｐｙｒｕｍ　ｅｌｏｎｇａｔｕｍ　 ４ｅ－０４　 ８８％
ＣＡＡ５５１９３．１　 Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ｄｕｒｕｍ　 １ｅ－０４　 ８８％
ＡＡＢ０５９２７．１　 Ｓｏｒｇｈｕｍ　ｂｉｃｏｌｏｒ　 ２ｅ－０４　 ６３％
ＡＡＢ１８２０３．１　 Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ａｅｓｔｉｖｕｍ　 ７ｅ－０４　 ７９％
Ｐ４６５２５．２　 Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ａｅｓｔｉｖｕｍ　 ６ｅ－０５　 ７４％
表９　Ａｃβ－ａｃｔｉｎ推衍氨基酸与其他植物中肌动蛋白ＡＣＴＩＮ的相似度
Ｔａｂｌｅ　９　Ｉｄｅｎｔｉｔｙ　ｏｆ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｄｅｄｕｃｅｄ　ｆｒｏｍ　Ａｃβ－ａｃｔｉｎ　ｗｉｔｈ　ＡＣＴＩＮ　ｉｎ　ｏｔｈｅｒ　ｐｌａｎｔｓ
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与Ａｃβ－ａｃｔｉｎ相似度
Ｉｄｅｎｔｉｔｙ　ｗｉｔｈ　Ａｃβ－ａｃｔｉｎ
ＡＣＭ１８１０８．１　 Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ　ｍｏｎｇｏｌｉｃｕｍ　 ８ｅ－９６　 ９９％
ＢＡＤ２３８９７．１　 Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ａｅｓｔｉｖｕｍ　 １ｅ－９４　 ９９％
ＡＣＹ７８６７０．１　 Ｓｏｒｇｈｕｍ　ｂｉｃｏｌｏｒ　 ４ｅ－９２　 ９５％
ＢＡＪ９９００７．１　 Ｈｏｒｄｅｕｍ　ｖｕｌｇａｒｅ　ｓｕｂｓｐ．ｖｕｌｇａｒｅ　 ５ｅ－９１　 ９３％
　　氨基酸序列比对结果表明，各序列与同源蛋白
序列具有较高的相似度，因此基于核苷酸和氨基酸
序列的比对结果，初步判断获得的４个新基因序列
为目的序列。
２．２　冷胁迫下扁穗冰草脱水素基因的半定量ＲＴ－
ＰＣＲ分析
冷胁迫下各基因的半定量ＲＴ－ＰＣＲ结果如图２
所示。由图２－ａ可以看出，扁穗冰草在正常温度培
养下（ＣＫ）未表达Ａｃｗｃｏｒ４１０基因。将幼苗在４℃
胁迫下生长，可以诱导Ａｃｗｃｏｒ４１０基因表达，随着
生长时间的延长，该基因的表达量逐渐增加，６０ｈ
达到高峰。当幼苗移植到室温（２５℃）后，该基因的
表达量减少。
Ａｃｗｚｙ２基因与Ａｃｗｃｏｒ４１０基因相比，其表达
变化甚微，而且整体表达量较低（图２－ｂ），说明该基
因的表达对温度的响应不甚敏感。
Ａｃｗｃｓ１２０基因表达结果如图２－ｃ所示，该基因
在正常温度（ＣＫ）下有少量表达，随着冷胁迫时间的
延长，表达量迅速增加，在６０ｈ达到峰值，当移植到
室温后，表达量减少，但是仍然高于对照表达量。
图２　冷胁迫下扁穗冰草叶片脱水素基因
半定量ＲＴ－ＰＣＲ结果
Ｆｉｇ．２　Ｓｅｍｉ－ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ＲＴ－ＰＣＲ　ｏｆ　ｄｅｈｙｄｒｉｎ　ｇｅｎｅｓ　ｆｒｏｍ
ｔｈｅ　ｌｅａｆ　ｏｆ　Ａ．ｃｒｉｓｔａｔｕｍｕｎｄｅｒ　ｄｉｆｆｅｒｅｒｎｔ　ｃｏｌｄ　ｓｔｒｅｓｓ
注：ａ．Ａｃｗｃｏｒ４１０基因半定量ＲＴ－ＰＣＲ，ｂ．Ａｃｗｚｙ２基因半定量
ＲＴ－ＰＣＲ，ｃ．Ａｃｗｃｓ１２０基因半定量ＲＴ－ＰＣＲ，ｄ．内参基因Ａｃβ－ａｃｔｉｎ；
泳道１为对照，泳道２～５分别为４℃胁迫１２，２４，３６，６０ｈ，泳道６为
室温（２５℃）培养１２ｈ；图４、图５同
Ｎｏｔｅ：ａ．Ｓｅｍｉ－ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ＲＴ－ＰＣＲ　ｏｆ　Ａｃｗｃｏｒ４１０，ｂ．Ｓｅｍｉ－
ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ＲＴ－ＰＣＲ　ｏｆ　Ａｃｗｚｙ２，ｃ．Ｓｅｍｉ－ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ＲＴ－ＰＣＲ　ｏｆ
Ａｃｗｃｓ１２０，ｄ．Ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｅｎｅ　Ａｃβ－ａｃｔｉｎ；１：ＣＫ；２：４℃，１２ｈ；
３：４℃，２４ｈ；４：４℃，３６ｈ；５：４℃，６０ｈ；６：２５℃，１２ｈ；ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ａｓ
Ｆｉｇ．４ａｎｄ　Ｆｉｇ．５
３４１
草　地　学　报 第２０卷
２．３　干旱胁迫下扁穗冰草脱水素基因的半定量
ＲＴ－ＰＣＲ分析
不同干旱胁迫下各基因的半定量 ＲＴ－ＰＣＲ结
果如图３所示。由图３－ａ可知，随干旱胁迫程度的
增加Ａｃｗｃｏｒ４１０基因表达量变化甚微，表明该基因
对干旱不敏感。
Ａｃｗｚｙ２和Ａｃｗｃｓ１２０基因的表达量与干旱胁
迫程度成正相关（图３－ｂ，３－ｃ），复水后表达量降低，
说明这２个基因为干旱敏感基因。
图３　不同干旱胁迫程度下扁穗冰草叶片
脱水素基因半定量ＲＴ－ＰＣＲ
Ｆｉｇ．３　Ｓｅｍｉ－ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ＲＴ－ＰＣＲ　ｏｆ　ｄｅｈｙｄｒｉｎ　ｇｅｎｅｓ　ｆｒｏｍ
ｔｈｅ　ｌｅａｆ　ｏｆ　Ａ．ｃｒｉｓｔａｔｕｍｕｎｄｅｒ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｄｒｏｕｇｈｔ　ｓｔｒｅｓｓ
注：ａ．Ａｃｗｃｏｒ４１０基因半定量ＲＴ－ＰＣＲ，ｂ．Ａｃｗｚｙ２基因半定量
ＲＴ－ＰＣＲ，ｃ．Ａｃｗｃｓ１２０基因半定量ＲＴ－ＰＣＲ，ｄ．内参基因Ａｃβ－ａｃｔｉｎ；
１．对照组，２．干旱１ｄ，３．干旱３ｄ，４．干旱５ｄ，５．干旱７ｄ，６复水１
ｄ；图６、图７同
Ｎｏｔｅ：ａ．Ｓｅｍｉ－ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ＲＴ－ＰＣＲ　ｏｆ　Ａｃｗｃｏｒ４１０，ｂ．Ｓｅｍｉ－
ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ＲＴ－ＰＣＲ　ｏｆ　Ａｃｗｚｙ２，ｃ．Ｓｅｍｉ－ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ＲＴ－ＰＣＲ　ｏｆ
Ａｃｗｃｓ１２０，ｄ．Ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｅｎｅ　Ａｃβ－ａｃｔｉｎ；１：ＣＫ，２：ｄｒｏｕｇｈｔ　ｆｏｒ
１ｄ，３：ｄｒｏｕｇｈｔ　ｆｏｒ　３ｄ，４：ｄｒｏｕｇｈｔ　ｆｏｒ　５ｄ，５：ｄｒｏｕｇｈｔ　ｆｏｒ　７ｄ，６：
ｒｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　１ｄ；ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ａｓ　Ｆｉｇ．６ａｎｄ　Ｆｉｇ．７
２．４　冷胁迫和干旱胁迫下扁穗冰草脱水素的
Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ分析
提取干旱和冷胁迫下扁穗冰草叶片的可溶性蛋
白质，进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测和脱水素 Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ
分析，结果如图４～图７所示。
　　由图５可知，在４０ｋＤ处有一 Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ信
号，随冷胁迫时间的延长该蛋白条带逐渐变深，表明
该脱水素与冷胁迫相关，但是整体杂交信号较弱。
说明该蛋白对冷胁迫的响应不甚敏感。
Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ结果表明（图７），干旱胁迫可以诱
导扁穗冰草４０ｋＤ脱水素表达，随着干旱胁迫程度
的增强，该蛋白有增强趋势，从杂交信号的强弱可以
看出，干旱胁迫较冷胁迫更为明显。说明该蛋白的
表达可能对于干旱的响应更为敏感。由图７还可以
看出，扁穗冰草在复水后该蛋白并未出现表达量减
少迹象，推测这是因为蛋白表达滞后于核酸表达。
３　讨论与结论
扁穗冰草具有较强的抗旱及抗寒性，同时是小
麦的野生近缘种，与小麦的基因信息较为相似，因此
该物种对小麦的基因改良具有重要的应用价值，目
前已有冰草和小麦杂交品种小冰麦应用于农业生
产。研究扁穗冰草优良抗逆基因，为农作物及其他
禾本科植物的基因改良提供基因资源。脱水素为
ＬＥＡⅡ家族成员，其基因序列具有高度的保守性，
且保守片段在序列内部具有若干个拷贝，基于这一
特性，本研究设计同源引物，从扁穗冰草中克隆了３
个脱水素基因（Ａｃｗｃｏｒ４１０，Ａｃｗｚｙ２，Ａｃｗｃｓ１２０），序
４４１
第１期 张楠等：扁穗冰草脱水素基因的克隆和表达特性分析
列同源性比对证明这３个基因片段与其他物种已报
道的基因具有较高的相似度。半定量 ＲＴ－ＰＣＲ分
析表明，这３个基因受冷胁迫和干旱胁迫的响应而
表达，随着胁迫程度的不同，其表达量各有差异，表
达趋势与已经报道的同源基因的表达相似。大量研
究表明，脱水素的表达与逆境胁迫尤其是干旱胁迫
程度成正相关，在胁迫条件下，脱水素在植物细胞中
起保护作用且逆境胁迫下植物体内脱水素的累积量
与获得的抗性成正相关［１８～２１］。
扁穗冰草在冷胁迫和干旱胁迫下均可以诱导一
个４０ｋＤ脱水素的表达，干旱胁迫对该蛋白的响应
较冷胁迫更为明显，推测该蛋白是一种干旱敏感蛋
白。从本研究中脱水素基因表达和脱水素表达可以
看出，基因与蛋白的表达并不具有同步性，表现为去
胁迫后ＲＮＡ表达量迅速减少而蛋白表达量并非迅
速减少，甚至进一步积累，体现了蛋白表达的滞后
性。由于各逆境之间的交叉效应和植物抗逆信号转
导的复杂性，不能简单地判断某一基因对于特定逆
境胁迫产生特异的响应，例如，干旱、寒冷、盐碱都能
导致植物的脱水，因此，在冷胁迫和干旱胁迫下出现
同样的表达趋势是正常的，这为试验结果的分析带
来难度，由于目前整个冰草属中脱水素的研究较少，
而脱水素是一个大的基因家族，因此该蛋白与克隆
得到的基因（Ａｃｗｃｏｒ４１０，Ａｃｗｚｙ２及Ａｃｗｃｓ１２０）是否
有对应关系需进一步研究。
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（责任编辑　刘云霞）
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