全 文 ：文章编号: 1007-0435( 2006) 03-0214-05
胡枝子属植物野生居群遗传多样性RAPD分析
张吉宇1, 2 , 袁庆华2* , 王彦荣1 , 张文淑2
( 1.兰州大学草地农业科技学院 甘肃草原生态研究所,兰州　730020; 2.中国农业科学院畜牧研究所,北京　100094)
摘要: 利用RAPD标记分析胡枝子属14个野生居群遗传多样性,对其60个10碱基随机引物进行筛选,选择能产生多态
性谱带的20 个引物,共获得209个RAPD 标记, 182 个显多态性, 占总谱带数的87. 08%。居群间观测等位基因数Aa 和有
效等位基因数Ae 分别为1. 8708 和1. 5868, Nei′s 基因多样性指数H 和Shannon′s 信息指数I 分别为0. 3344和0. 4921,揭
示了居群间存在较高的遗传多样性。遗传距离介于0. 1006～0. 651 之间, 14 个材料的聚类结果与形态学分类结果有相同
的趋势。本研究对胡枝子属植物种质资源的保存和育种利用有一定参考价值。
关键词: 胡枝子属; 野生居群; 遗传多样性; RAPD
中图分类号: S 812; Q943　　　　文献标识码: A
RAPD Analysis on Genetic Diversity of Wild Population of Lespedeza Michx.
ZHANG Ji-yu
1, 2
, YU AN Q ing-hua
2*
, WANG Yan-r ong
1
, ZHANG Wen-shu
2
( 1. College o f Pasto ral Agr icultur e Science and Technolog y, Lanzhou Univ ersit y, Gansu G rassland Ecolog ical Resear ch
Institute , L anzhou, Gansu Prov ince 730020, China ; 2. Institute o f Animal Science, CAAS, Beijing 100094, China )
Abstract: The genetic diver sity within 14 w ild populations of L esp ed ez a M ichx. w as analy zed by r andom am-
plif ied polymorphic DNA ( RAPD) technique. T wenty primers w ere screened to be polymorphic f rom 60 10-
oligonucleot ieds primers. Among the total of 209 RAPD loci, 182 loci ( 87. 08%) w ere detected to be polymor-
phic. The resul ts indicate that the obser ved number of alleles ( A a) , effect iv e number o f alleles ( A e) , Nei′s
gene diversity ( H ) , and Shannon′s Informat ion index ( I ) w ere 1. 8708, 1. 5868, 0. 3344, and 0. 4921, respec-
tiv ely . The results also show that high genet ic diversity w as screened among 14 w ild L esp edez a populat ions,
the genet ic distance among which was varied f rom 0. 1006～0. 651. T he dendrograms const ructed based on Nei′
s g enetic distance of RAPD data show ed some similarity w ith that of the morphology . This study w ill provide a
reference to the preservat ion of g ermplasm resources and breeding for L esp edez a M ichx.
Key words : L esp edez a M ichx . ; Wild populat ion; Genet ic diversity; RAPD analy sis
　　胡枝子属( L esp ed ez a M ichx . )植物抗旱性较强,
为良好的水土保持及固沙植物, 在工业、农业、林业、畜
牧业、医药保健等方面具有较高的利用价值,近几年该
属植物的开发利用受到人们的重视 [ 1～5]。RAPD即随
机扩增多态性DNA( Random Amplif ied Polymorphic
DNA )标记技术,以其操作简便、成本低等优点, 已被
广泛应用于动植物的种质资源分类、遗传多样性分析
和遗传分化研究中。本试验对14份野生胡枝子材料进
行 RAPD 分析, 旨在从分子水平上探讨其遗传多样
性,初步明确不同种间以及种内不同居群间的遗传差
异,为胡枝子属植物种质资源的开发利用提供依据。
1　材料与方法
1. 1　试验材料
材料采自北京、山西和黑龙江3个地区的14份胡
枝子,来源及生境见表1。
收稿日期: 2006-01-16;修回日期: 2006-07-05
　　基金项目: 国家“十五”科技部基础性工作专项资助项目( 2003-2005年)。
　　作者简介: 张吉宇( 1978-) ,男,甘肃民乐人,讲师, 从事牧草育种与生物技术的教学和研究, E -m ail : zjyf ran k@ hotmail. com ; * 通讯作者 Author
for correspondence, E-mail: yuanqingh ua@ hotm ail . com
第14卷　第 3期
　Vo l. 14　 No . 3
草　地　学　报
ACT A AGRESTIA SIN ICA
　　　2006年　 9 月
　Sep. 　　 2006
表1　供试材料生境概况
T able 1　The habitat information of the 14 populations of L esp ed ez a Michx .
序号
Code of
populat ion
种名
Species name
倍性
Ploidy( 2n)
采集地点
Locat ion
生境
Habitat
Pop1
　
达乌里胡枝子
L esp edez a daur ica( Laxm. ) Sch indl.
四倍体
T et raploid
北京凤凰岭山门旁
Fenghuang mountain, Beijing
山坡草地
Gras sland at hil lside
Pop2
　
达乌里胡枝子
L esp edez a daur ica( Laxm. ) Sch indl.
四倍体
T et raploid
北京香山
Xiang shan mountain , Beijing
山坡路边
Road at hill side
Pop3
　
达乌里胡枝子
L esp edez a daur ica( Laxm. ) Sch indl.
四倍体
T et raploid
山西沁源
Qin yuan County, Shanxi Province
草地
Gras sland
Pop4
　
长叶铁扫帚
L esp ed eza carag anae Bg e.
二倍体
Diploid
北京凤凰岭山门旁
Fenghuang mountain, Beijing
山坡草地
Gras sland at hil lside
Pop5
　
长叶铁扫帚
L esp ed eza carag anae Bg e.
二倍体
Diploid
北京百望山
Beiw an g moun tain, Beijin g
山坡路边林缘
Road at h ills ide, edg e of for est
Pop6
　
长叶铁扫帚
L esp edez a canaganae Bge.
二倍体
Diploid
北京八达处
Badachu, Beijing
山坡、路旁草丛中
Road at hill side
Pop7
　
多花胡枝子
L esp ed eza f loribunda Bung e.
二倍体
Diploid
北京百望山
Beiw an g moun tain, Beijin g
山坡路边林缘
Road at h ills ide, edg e of for est
Pop8
　
多花胡枝子
L esp ed eza f olribunda Bung e.
二倍体
Diploid
北京八达处
Badachu, Beijing
山坡路旁、林下
Road at hill side, among forest
Pop9
　
多花胡枝子
L esp ed eza f olribunda Bung e.
二倍体
Diploid
北京樱桃沟
Yingtao C hannel , Bei jing
山坡路边
Road at hill side
Pop10
　
多花胡枝子
L esp ed eza f loribunda Bung e.
二倍体
Diploid
北京凤凰岭
Fenghuang mountain, Beijing
山坡草地
Gras sland at hil lside
Pop11
　
二色胡枝子
L esp edez a bic olor T urcz.
二倍体
Diploid
北京百花山
Baihua m ountain , Bei jing
山坡
Hills ide
Pop12
　
细梗胡枝子
L esp edez a v irg ata( T hunb . ) DC.
二倍体
Diploid
北京天坛公园
T ian tan Park , Beijing
草地
Gras sland
Pop13
　
山豆花
L esp ed ez a tomentosa( Th unb. ) Sieb.
二倍体
Diploid
山西沁源
Qin yuan County, Shanxi Province
草地
Gras sland
Pop14
　
二色胡枝子
L esp edez a bic olor T urcz.
二倍体
Diploid
黑龙江
Heilongj iang Province
路边草地
Grassland at roadside
1. 2　基因组DNA提取与RAPD扩增反应体系
野生种子先在温室育苗,待幼苗高3～5 cm 后, 移
栽到田间,采取播种当年的嫩叶提取 DNA, 提取方法
使用改进的 CTAB 法[ 6]。
RAPD 扩增反应体系: 扩增反应总体积为25
L,
DNA 模板用量为75 ng , M g2+ 浓度2. 1 mmol/ L , dNT P
终浓度200
mol/ L, 随机引物浓度为0. 2 pm /
L, 10×
buf fer 2. 5
L, TaqDNA 聚合酶1. 5个单位。扩增反应
程序: 94℃预变性3 min; 94℃变性30 s, 36℃退火30 s,
72℃ 延伸1 m in, 循环45次; 72℃ 延伸10 min。
用含有0. 5
g/
L 溴化乙锭的0. 8%琼脂糖凝胶
电泳检测DNA 纯度,电压4～5 V/ cm,电泳1～2 h, 用
凝胶成像系统照相。
1. 3　PCR扩增与随机引物的筛选
对来自Opron 公司的A 组、B 组、C 组共60个随机
引物进行扩增筛选,选出扩增产物清晰、稳定的引物。
1. 4　统计分析
统计每一样品扩增的DNA 条带数,在同一电泳迁
移位置上,出现DNA扩增条带记为1,未出现带者记为
0。根据各带谱出现的频率, 利用POPGENE ( Version
1. 31, 1999) [ 7]统计软件计算各居群间Nei′s( 1972) [ 8]的
遗传距离, 并以此按不加权对平均聚类法( U PGMA )
方法进行聚类分析,此方法采用 PHYLIP( Ver sion 3.
5c, Joe Felsenstein, 1995)的Neighbo r-Joining 程序; 聚
类结果用 Tree View ( Version 1. 66, Roderic D. M .
Page, 2001)输出树状聚类图。
2　结果与分析
2. 1　RAPD随机引物的筛选
对A、B、C组共60个随机引物进行PCR扩增,结果
表明, 在60个10碱基随机引物中有6个随机引物没有
215第 3期 张吉宇等:胡枝子属植物野生居群遗传多样性的RAPD分析
扩增到产物, 54个(占90% )引物能够扩增出3～11条
带, 在这54个随机引物中,大多数引物的扩增产物虽然
谱带丰富,但是没有表现出多态性,说明DNA样品中不
存在这些随机引物的特异结合位点,无法进行特异性扩
增, 必须在上述有扩增条带的随机引物中筛选出可以稳
定进行特异性扩增的随机引物。因此,对已经筛选出的
这 54个随机引物进一步进行扩增筛选。淘汰那些无法
进行特异性扩增的随机引物,得到20个随机引物用于
RAPD分析(表2)。
表2　20 条引物的序列
Table 2　T he pr imer s fo r RAPD amplification
Operon编号
( Opron No. )
序列
Sequ ence5′→3′
Operon编号
( Opron No. )
序列
Sequen ce5′→3′
OPA06 GGT CCCT GAC OPB19 ACCCCCGAAG
OPA09 GGGTAACGCC OPB20 GGACCCT TAC
OPA11 CAAT CGCCGT OPC01 TT CGAGCCAG
OPA15 T TCCGAACCC OPC04 CCGCATCT AC
OPA18 AGGTGACCGT OPC05 GATGACCGCC
OPA20 GT T GCGAT CC OPC08 TGGACCGGT G
OPB01 GT TT CGCTCC OPC13 AAGCCT CGTC
OPB06 T GCT CTGCCC OPC14 T GCGT GCTT G
OPB08 GT CCACA CGG OPC16 CACACTCCAG
OPB10 CTGCT GGGAC OPC20 ACTT CGCCAC
2. 2　胡枝子属植物RAPD标记多态性
每个引物所扩增的谱带数都表现出差异,不同引
物在同一材料上扩增的谱带差异显著,最大变幅为3～
10;同一引物在不同材料上具有不同的谱带。在20个
引物中扩增谱带数最少的引物为OPC-04、OPC-08, 谱
带变幅为 3～6; 扩增谱带数最多的引物为 OPA-15、
OPB-19、OPB-20、OPC-01,谱带变幅为7～10。
　　引物在胡枝子属植物的 14份材料中所产生的不
同分子量的扩增谱带数和多态性带比例差异很大(表
3)。前者7～15条带,平均每个引物产生11条; 后者从
62. 50%～100%。20个引物在14份材料中共产生的不
同分子量的209个RAPD标记,多态性带182条,占总
数的87. 08%。说明胡枝子属植物种间遗传背景的复杂
性和多样性。这些DNA 片段的分子量在320～3000 bp
之间,主要集中在400～1400 bp 之间。
由Nei指数估计的 14个胡枝子居群基因多样性
(表4)。居群间观测等位基因数A a和有效等位基因数
A e 分别为 1. 8708和 1. 5868, Nei′s基因多样性 H 和
Shannon′s 信息指数 I 分别为0. 3344和0. 4921, Nei′s
基因多样性指数和 Shannon′s 信息指数数值相差不
大,揭示出相同的规律,即居群间存在较高的遗传多
样性。
2. 3　胡枝子属植物的亲缘关系
根据20个引物对胡枝子属植物14个居群所做的
RAPD分析结果,获得Nei ( 1972)的遗传距离D 和遗
传一致度I (表5)。在所有遗传距离中,以居群13与居
群7的遗传距离最大( 0. 651) ;居群11与10、12与7的
遗传距离次之,分别为0. 6238、0. 6061;居群5与6的遗
传距离最小( 0. 1006) , 其次是居群10与11、居群11与
12、居群5与4的遗传距离,分别为0. 111 2、0. 116 6、0.
143 8。遗传一致度的变异范围在 0. 521 5～0. 904 3
之间。
系统聚类树状图可以更直接地反映 14个居群的
亲缘关系(图1)。达乌里胡枝子的3个居群中1和3先
聚在一起, 然后和居群2聚为一类;居群4、5、6的长叶
铁扫帚聚为一类; 在多花胡枝子的4个居群中, 居群7
和8聚为一类,居群9和10两者之间没有聚在一起, 同
时与居群7和8之间的距离都很大;居群11和14之间
的遗传距离较大, 没有直接聚在一起,但最终能聚为一
类;居群9与13,居群10与12各聚为一类, 说明多花胡
枝子、长叶铁扫帚和细梗胡枝子这3个种间差异较小。
表3　20 个引物对胡枝子属植物扩增的多态性结果
Table 3　Percent age o f po lymo rphic lo ci w ith 14 populatins o f L esp edeza Michx . using 20 primers
引物
Prim er
扩增总位点数
T otal loci
多态位点数
No. polymorph ic
多态性带比例( % )
Percentage of
polym orphic(% )
引物
Primer
扩增总位点数
T otal loci
多态位点数
No. polymorphic
多态性带比例( % )
Percentag e of
polymorph ic( % )
OPA06 9 7 77. 78% OPB19 14 14 100. 00%
OPA09 12 10 83. 33% OPB20 15 15 100. 00%
OPA11 11 8 72. 73% OPC01 14 11 78. 57%
OPA15 14 13 92. 86% OPC04 10 9 90. 00%
OPA18 10 8 80. 00% OPC05 8 8 100. 00%
OPA20 8 7 87. 50% OPC08 7 6 85. 71%
OPB01 9 8 88. 89% OPC13 10 9 90. 00%
OPB06 10 7 70. 00% OPC14 8 7 87. 50%
OPB08 12 12 100. 00% OPC16 8 5 62. 50%
OPB10 11 9 81. 82% OPC20 9 8 88. 89%
216 草　地　学　报 第 14卷
表 4　14份胡枝子居群基因多样性
T able 4　Summary of g enetic var iation statistics fo r differ ent prim er s w ithin 14 L esp edeza populations
引物
Primer
观测等位基因数A a
Observed number of alleles
有效等位基因数Ae
E ffect ive number of al leles
Nei′s 基因多样性H
Nei′s ( 1973) gene diver sity
Shannon′s 信息指数 I
Shannon′s Information index
OPA06 1. 7778 1. 6832 0. 3617 0. 5112
OPA09 1. 8333 1. 4862 0. 2874 0. 4324
OPA11 1. 7273 1. 2856 0. 1846 0. 2966
OPA15 1. 9286 1. 6138 0. 3520 0. 5200
OPA18 1. 8000 1. 4638 0. 2725 0. 4101
OPA20 1. 8750 1. 5921 0. 3329 0. 4891
OPB01 1. 8889 1. 6423 0. 3640 0. 5304
OPB06 1. 7000 1. 5696 0. 3102 0. 4437
OPB08 2. 0000 1. 7211 0. 4082 0. 5949
OPB10 1. 8182 1. 3867 0. 2421 0. 3782
OPB19 2. 0000 1. 7290 0. 4009 0. 5816
OPB20 2. 0000 1. 6468 0. 3776 0. 5595
OPC 01 1. 7857 1. 6069 0. 3346 0. 4825
OPC 04 1. 9000 1. 6178 0. 3582 0. 5262
OPC 05 2. 0000 1. 5811 0. 3457 0. 5212
OPC 08 1. 8571 1. 6447 0. 3586 0. 5192
OPC 13 1. 9000 1. 6670 0. 3745 0. 5435
OPC 14 1. 8750 1. 6226 0. 3546 0. 5180
OPC 16 1. 6250 1. 4302 0. 2462 0. 3617
OPC 20 2. 0000 1. 7029 0. 3934 0. 5752
平均Mean 1. 8708 1. 5868 0. 3344 0. 4921
标准误 St . Dev 0. 3362 0. 3426 0. 1676 0. 2272
表5　14 份胡枝子间的遗传距离和遗传一致度
Table 5　Nei′s or ig inal measur es of g enet ic ident ity and genetic distance
居群
Pop ID
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
1 **** 0. 8612 0. 8182 0. 5742 0. 5742 0. 5742 0. 5407 0. 6411 0. 5981 0. 5694 0. 5981 0. 6029 0. 6268 0. 6172
2 0. 1494 **** 0. 7847 0. 5598 0. 5885 0. 5885 0. 5646 0. 6364 0. 6316 0. 555 0. 5742 0. 5885 0. 6411 0. 6316
3 0. 2007 0. 2425 **** 0. 5933 0. 5933 0. 5837 0. 5981 0. 5837 0. 6077 0. 5789 0. 5789 0. 6029 0. 6364 0. 6077
4 0. 5548 0. 5802 0. 5221 **** 0. 866 0. 8373 0. 8038 0. 5694 0. 6029 0. 6029 0. 6029 0. 6172 0. 5646 0. 5359
5 0. 5548 0. 5301 0. 5221 0. 1438 **** 0. 9043 0. 8612 0. 5885 0. 6124 0. 6029 0. 5837 0. 5694 0. 555 0. 555
6 0. 5548 0. 5301 0. 5383 0. 1775 0. 1006 **** 0. 8325 0. 6268 0. 6316 0. 622 0. 5837 0. 5981 0. 5742 0. 5837
7 0. 6149 0. 5716 0. 514 0. 2184 0. 1494 0. 1833 **** 0. 5742 0. 6172 0. 5789 0. 5694 0. 5455 0. 5215 0. 5789
8 0. 4445 0. 452 0. 5383 0. 5632 0. 5301 0. 4671 0. 5548 **** 0. 6316 0. 6603 0. 6699 0. 6746 0. 6603 0. 8038
9 0. 514 0. 4595 0. 4981 0. 5061 0. 4903 0. 4595 0. 4825 0. 4595 **** 0. 5694 0. 5885 0. 622 0. 7512 0. 6364
10 0. 5632 0. 5887 0. 5465 0. 5061 0. 5061 0. 4748 0. 5465 0. 4151 0. 5632 **** 0. 8947 0. 8708 0. 6651 0. 6459
11 0. 514 0. 5548 0. 5465 0. 5061 0. 5383 0. 5383 0. 5632 0. 4007 0. 5301 0. 1112 **** 0. 89 0. 6842 0. 6651
12 0. 5061 0. 5301 0. 5061 0. 4825 0. 5632 0. 514 0. 6061 0. 3936 0. 4748 0. 1383 0. 1166 **** 0. 7273 0. 6507
13 0. 4671 0. 4445 0. 452 0. 5716 0. 5887 0. 5548 0. 651 0. 4151 0. 2861 0. 4079 0. 3795 0. 3185 **** 0. 6842
14 0. 4825 0. 4595 0. 4981 0. 6238 0. 5887 0. 5383 0. 5465 0. 2184 0. 452 0. 4371 0. 4079 0. 4297 0. 3795 ****
　　注: 对角线以下为 Nei( 1972)的遗传距离, 以上为遗传一致度。Note: Nei′s genet ic iden ti ty ( above d iagonal ) and genet ic dis tance( below
diagonal )
3　讨　论
用来自Opron 公司的随机引物对供试材料进行
RAPD扩增, 结果表明在60个引物中54个(占90% )引
物能够扩增出谱带, 其中选定20个引物产生的不同分
子量的209个RAPD标记中,多态性谱带182条,占总
数的87. 08%。说明野生胡枝子属植物居群间具有丰富
的遗传多样性。居群间观测等位基因数Aa、有效等位基
因数A e、Nei′s基因多样性H 和Shannon′s信息指数 I
的值是衡量种群遗传变异的几个主要指标, 上述几个指
标共同揭示了胡枝子居群间存在较高的遗传多样性。
217第 3期 张吉宇等:胡枝子属植物野生居群遗传多样性的RAPD分析
图1　14 份胡枝子居群RAPD聚类结果
Fig . 1　T he dendrog r am of 14 populat ins of L esp edeza
Michx . by RAPD m aker s
从系统聚类树状图可以看出,达乌里胡枝子的 3
个居群中居群1和3先聚在一起, 然后和居群2聚为一
类;居群4、5、6都是长叶铁扫帚聚为一类,多花胡枝子
的4个居群中,居群7和8聚为一类,居群9和10两者
之间没有聚在一起,并且与居群7和8之间的距离都很
大;居群 11和14没有直接聚在一起, 但最终能聚为一
类;居群9与13,居群10与12各聚为一类, 说明多花胡
枝子、长叶铁扫帚和细梗胡枝子这3个种间差异较小,
种间的遗传亲缘关系与传统的胡枝子属植物种分类基
本一致。因此, RA PD分析将是胡枝子属植物系统学
研究的有效补充手段。供试的胡枝子材料在种间有二
倍体和四倍体之分, RAPD 分析产生的聚类结果将四
倍体的达乌里胡枝子聚在一起,二倍体的其它种聚在
了一起。
总之, 胡枝子属植物在种间的差异要小于居群间
的差异,也就是说,胡枝子属植物的遗传变异主要存在
于居群之间。Hamrick 等[ 9]通过对种水平上的遗传多
样度、居群内遗传多样度和居群间遗传多样度相关性
的比较也发现,在种水平上的遗传多样度和居群内的
遗传多样度呈正相关( r= 0. 89) ,而和居群间的遗传多
样度呈负相关( r= - 0. 11) ,居群内多样度和居群间多
样度则呈负相关( r= - 0. 54) [ 10]。
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(责任编辑　孙　彦)
218 草　地　学　报 第 14卷