全 文 ：第 16 卷
第 1 期

Vol. 16
No . 1
草
地
学
报
ACTA AGRESTIA SINICA



2008 年
1 月

Jan.

2008
微波辅助提取苜蓿黄酮方法的研究
张咏梅, 晏石娟 , 曹致中* , 师尚礼
(甘肃农业大学草业学院 , 甘肃 兰州 730070)
摘要: 为充分利用紫花苜蓿( Med icago sativa L. )中的黄酮类物质,应用微波辅助提取技术, 分别对影响其黄酮提
取量的乙醇浓度、微波功率、固液比、提取时间和提取次数进行单因素试验, 并在此基础上对各因素的互作效率进
行正交试验。结果表明:固液比和乙醇浓度是影响提取量的主要因素,微波功率和其它因素影响较小; 微波提取苜
蓿黄酮的最佳工艺为: 40%乙醇浓度, 1
30固液比, 微波 500 W功率下作用 60 s; 在此工艺条件下, 黄酮提取量的
理论值为 4. 92 mg/ g, 接近于实际测定值 4. 88 mg / g。
关键词: 微波辅助; 紫花苜蓿(Medicago sativ a L . ) ; 类黄酮; 提取方法
中图分类号: S816. 7




文献标识码: A




文章编号: 1007
0435( 2008) 01
0076
05
Methodological Study for Total Flavonoid Extraction from Alfalfa
by Microwave Assistance
ZHANG Yong
mei, YAN Shi
juan, CA O Zhi
zhong* , SH I Shang
li
( Pratacul tu ral College, Gan su Agricultu ral University, Lan zhou, Gansu Province 730070, China)
Abstract: M edicago L. , an important medical and edible g rass, is rich in natural bioact ive substances. In
order to make full use of f lav ono ids in M. sativa L. , the microwave
assisted f lavonoid ext raction pro cess
w as studied by one
factor exper iment o f ethano l concentrat ion, microw ave pow er, rat io of so lid to liquid,
and pr ocessing t ime, and ext ract ion t imes, respect ively, and the orthogonal experiment based on the one

facto r experiments. T he results show that rat io of solid to liquid and m icrow ave pow er w er e main factors
and the o thers w ere mino rs. The parameters fo r optim ized ex t ract ion pro cess w ere ethanol concentrat ion at
40% , r at io of so lid to liquid at 1
30, m icrow ave pow er at 500 W, and radiat ion t ime at 60 seconds. The
amount o f f lavonoids ex t racted f rom alfalfa w as 4. 88 mg/ g under the opt imized ex tr act ion process and sim

ilar to the theor et ical content at 4. 92 mg / g.
Key words: M icrow ave
assisted; Alfalfa ( Med icago sativa L. ) ; F lav ono id; Ext ract ion process


紫花苜蓿(M edicago sativa L. ) (下称苜蓿)为
多年生豆科牧草,是重要的的饲料作物。分布广泛,
产草量高, 营养丰富, 适口性好, 适应性强, 被称为

牧草之王
。同时苜蓿具有重要的药用价值。我国
传统医学认为, 苜蓿性味微甘、淡, 可治水肿, 膀胱结
石等症。
本草纲目
谓其有
利五脏, 轻身健人, 洗
去脾胃间邪热之火, 通小肠诸恶热毒
之功效 [ 1]。苜
蓿含有多种具有生理和药理活性的黄酮类化合物
( F lav ono id)、皂苷( Saponin)、香豆素 ( Coumarin)、
绿原酸( Chloro genic acid)等有效物质 [ 2] , 其中黄酮
类化合物能抗氧化, 消除自由基, 降低血糖,延缓衰
老,能够调节毛细血管的脆性和渗透性,预防和保护
心脑血管疾病,增强免疫和抗肿瘤作用[ 3, 4] ,具有微
量的雌激素样作用[ 5] , 抗炎杀菌抗病毒作用。同时
黄酮类化合物也是重要的功能食品添加剂、饲料添
加剂[ 6]、天然抗氧化剂, 具有保鲜和护肤美容作
用[ 7 ]。紫花苜蓿分布广泛,世界各地广有栽培, 我国
每年栽培苜蓿约 200万 hm2 ,资源丰富。苜蓿提取
黄酮具有大田作物产量高、原料易得、生产工艺简便
的优点,同时提取黄酮后的残渣仍是营养丰富、品质
收稿日期: 2007
05
14; 修回日期: 2007
08
30
基金项目: 优质饲草高效生产关键技术研究与产业化开发( 2002BA518A03)
作者简介: 张咏梅( 1974
) ,女,甘肃武威人,博士研究生,研究方向为牧草深加工及天然有效成分分离与纯化工作, E
m ail: z ym19740824
@ sohu. com 或 zym824@ sina. com; * 通迅作者 Au th or for corresponden ce, E
mail : caozz@ gsau. edu. cn
第 1期 张咏梅等:微波辅助提取苜蓿黄酮方法的研究
优秀的饲草,提取黄酮提高了苜蓿的经济附加值, 具
有重要的现实意义。
近年来, 微波辅助提取法应用于天然有效成分
的提取日趋活跃, 是一种很有潜力的新方法。具有
选择性强、快速、加热均匀、高效、清洁、不产生噪音、
不造成污染的特点[ 8] ,对于一些生物细胞内耐热物
质和吸水性良好的物质提取效果良好[ 9]。微波法应
用于银杏[ 9] 、柚皮[ 10] 、甘草[ 11]、白芍[ 12] 等植物提取
黄酮类化合物, 发现此法不仅节省时间,而且提取效
率高,提高了材料的综合利用率。
1
材料与方法
1. 1
材料、仪器和试剂
1. 1. 1
材料

甘农 3 号
紫花苜蓿采集于甘肃省
景泰县草窝滩乡牧草试验基地。2006年 6月 10日
选择盛花期生长势一致、健康无病的植株人工收割,
于水泥场地摊晒干燥后, 粉碎,过 60目筛,备用。
1. 1. 2
主要仪器
2XZ
0. 25 型旋片真空泵, 浙江
省黄岩黎明实业公司; MD
2480EGC 海尔微波炉,
青岛海尔微波制品有限公司; 722N 可见分光光度
计, 上海精密科学仪器有限公司; M ET TLER
TILEDO电子天平,梅特勒托利多仪器(上海)有限
公司; KE WEI 电热恒温水浴锅,北京科伟永鑫实验
仪器设备厂。
1. 1. 3
试剂
芦丁标准品( HPLC> 98%) ,成都思
科华生物技术有限公司; 5%亚硝酸钠溶液、10%硝酸
铝溶液、1 mol/ L 氢氧化钠溶液、不同浓度乙醇溶液。
1. 2
实验方法
1. 2. 1
标准曲线的绘制方法
参照刘江雏方法, 以
浓度 C( mg / ml)对吸光值 A进行线性回归。标准曲
线回归方程 C= 0. 1015A- 0. 0048, A 为吸光度; C
为芦丁浓度( mg/ g )
1. 2. 2
黄酮提取量的测定
准确称取苜蓿草粉
3. 00 g, 按一定固液比加入一定浓度的乙醇。按下
述方法处理:家用微波炉的转盘中央置一个装有适
量自来水的大烧杯,处理样品沿大烧杯四周摆放,每
次 3个,在微波炉不同功率下作用一定时间, 取出,
待冷至室温,再如上重复一定次数,进行微波辅助提
取。合并浸出液, 真空抽滤,滤液加石油醚萃取 3~
5次, 去除叶绿素干扰。浓缩并定容至 50 mL,得提
取液。取 5 mL 提取液按芦丁测定的方法, 在分光
光度计上 510 nm 波长下比色, 测定吸光度。根据
芦丁标准曲线,计算提取液黄酮质量浓度。
黄酮含量( mg/ g ) = ( Y
V) / WY 为提取液黄
酮质量浓度 mg/ mL; V 为提取液体积 mL; W 为苜
蓿粉质量 g
1. 2. 3
单因素实验
1. 2. 3. 1
乙醇浓度对黄酮提取量的影响
准确称
取草粉 3. 00 g,在固液比 1
20,微波功率 500 W,分
别设定乙醇浓度为 0%、20%、40%、60%、80%的提取
液,作用 50 s,间歇提取 3次,进行微波辅助提取。
1. 2. 3. 2
微波作用时间对黄酮提取量的影响
准
确称取草粉 3. 00 g ,在 40%乙醇浓度下,固液比 1

20,微波功率 500 W, 分别作用 10、30、50、70 s, 间歇
提取 3次,进行微波辅助提取。
1. 2. 3. 3
固液比对黄酮提取量的影响
准确称取
草粉3. 00 g,在 40%乙醇浓度下, 固液比分别为 1

10、1
20、1
30、1
40条件下, 微波功率 500 W,
作用 50 s,间歇提取 3次,进行微波辅助提取。
1. 2. 3. 4
提取次数对黄酮提取量的影响
准确称
取草粉 3. 00 g,在 40%乙醇浓度下,固液比 1
20,
微波功率 500 W, 作用 50 s, 分别间歇提取 1、2、3、
4、5次,进行微波辅助提取。
1. 2. 3. 5
微波功率对黄酮提取量的影响
准确称
取草粉 3. 00 g,在 40%乙醇浓度下, 固液比 1
20,
分别在微波功率 100、250、500、650、800W 条件下,作
用 50 s,间歇提取 3次,进行微波辅助提取。
1. 2. 4
微波提取条件优化试验


正交试验
通过
对影响黄酮提取量的因素进行初步筛选,有必要对各
因素的互作效率进行综合考虑。因此进行正交试验
设计,对影响黄酮提取量的乙醇浓度、提取功率、固
液比、提取时间进行 4因素3水平的优化设计(表 1)。
表 1
微波辅助提取正交实验设计
Table 1
Or thogonal design of micr ow ave
assisted ex traction experiment
水平
Level
因素 Factor
A(乙醇浓度) ( % ) E th anol con c. B(微波功率) ( W) Pow er C(提取时间) ( s ) Time D(固液比) Ratio of s ol id to liquid
1 20 250 50 1
30
2 30 500 60 1
40
3 40 650 70 1
50
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1. 2. 5
验证试验
根据正交试验的最佳工艺条件
进行 3次验证实验, 确定其可靠性。
2
结果与分析
2. 1
乙醇浓度对苜蓿黄酮提取量的影响
苜蓿黄酮受乙醇浓度的影响较大(图 1)。40%
的乙醇浓度,苜蓿黄醇提取量最高,为 4. 42 mg/ g,极
显著地高于 80%乙醇的提取效率。在 1
20固液比,
500W微波下作用 50 s的固定条件下, 各浓度的乙醇
提取液温度均在 40~ 45
之间,温度较低,避免了苜
蓿黄酮因温度过高而分解的弊端。
图 1
乙醇浓度对苜蓿总黄酮提取量的影响
F ig . 1
Effect o f ethano l concentr ation on to tal
flavono id extr acted fr om alfalfa
2. 2
微波处理时间对苜蓿总黄酮提取量的影响
在40%乙醇, 1
20料液比, 500 W 微波功率的
固定条件下,苜蓿总黄酮提取量起先随着处理时间
图 2
处理时间对苜蓿总黄酮提取量的影响
Fig. 2
Effect of pro cessing t ime on total flav onoid
ex tracted from alfalfa
的延长而增加, 50 s达到最高值, 为 4. 68 mg/ g, 之
后,总黄酮提取量不再增加, 反有降低的趋势(图
2)。说明 50 s左右的微波处理时间,苜蓿黄酮可提
取完全。
2. 3
微波功率对苜蓿黄酮提取量的影响
微波炉的大功率和小功率均不利于苜蓿黄酮的
提取,中间功率处理效果较好。在 40%乙醇, 1
20
固液比,微波作用 50 s 的固定条件下, 250 W 功率
下,苜蓿总黄酮提取量最高, 为 4. 41 mg / g, 显著高
于其他功率的效果; 500W 和 650W 的处理效果不
及 250W, 提取量居中 ( 图 3 )。提取液温度随微
波功率的增大,由 25
升高到 45
,提取条件较为
温和。


图 3
微波功率对苜蓿总黄酮提取量的影响
Fig . 3
Effect of micr owave power on total flav onoid
extr acted fr om alfalfa
2. 4
提取次数对苜蓿黄酮提取量的影响
在 40%乙醇浓度、1
20固液比、500W 微波功
率、作用 50s固定条件下, 提取 2次苜蓿总黄酮提取
量最高,为4. 70 mg/ g (图4)。提取液温度随提取次
图 4
提取次数对苜蓿总黄酮提取量的影响
F ig . 4
Effect o f extr action times on to tal flavono id
extr acted fr om alfalfa
78
第 1期 张咏梅等:微波辅助提取苜蓿黄酮方法的研究
数的增加由 26
逐渐升高到 45
, 均为淡黄绿色
滤液。
2. 5
固液比对苜蓿总黄酮提取量的影响
在 40%乙醇浓度、500W 微波功率、作用 50 s、
间歇提取 3次的固定条件下, 苜蓿黄酮提取量随乙
醇量由 10、20、30、40、50倍增加而升高(图 5)。
2. 6
正交实验
固定微波提取次数为 2次,对其它影响苜蓿黄
酮提取量的因素,按初选水平进行 4因素 3水平正
交实验。如表 2、3所示, 乙醇浓度和固液比对苜蓿
黄酮的提取量具有极显著的影响,微波功率对其有
显著影响,而浸提时间对其无明显影响。因此 4 因
素的影响主次分别为 D > A > B> C, 从而得出
最佳提取工艺为 A3B2C2D1, 即 40% 乙醇、500W
功率、作用 60 s、1
30固液比。理论黄酮提取量为
4. 92 mg / g。以此工艺为提取条件 , 实际苜蓿黄酮
提取量为 4. 88 mg / g。与 40%乙醇、1
30固液比、
60
水浴 1 h 的提取量 4. 82 mg/ g 相当。节约时间
10倍以上。
图 5
固液比对苜蓿总黄酮提取量的影响
Fig . 5
Effect o f solid t o liquid ratio on tot al flavonoid
extr acted fr om alfalfa
表 2
微波辅助 4 因素 3 水平正交实验
T able 2
Results of the o rthogonal design [ L 9( 34 ) ] fo r micr owave
assisted ext raction exper iment
处理号
T reatment No.
因素 Factor
A B C D
观察值 Data
1 1 1 1 1 4. 59 4. 23 4. 52
2 2 2 3 1 4. 72 4. 68 4. 79
3 3 3 2 1 4. 81 4. 87 4. 80
4 1 2 2 2 4. 32 4. 26 4. 52
5 2 3 1 2 4. 42 4. 49 4. 28
6 3 1 3 2 4. 36 4. 50 4. 44
7 1 3 3 3 4. 09 4. 06 3. 85
8 2 1 2 3 4. 35 4. 31 4. 10
9 3 2 1 3 4. 54 4. 45 4. 41
T1 38. 45 39. 40 39. 95 42. 01
T2 40. 14 40. 69 40. 33 39. 59
T3 41. 18 39. 68 39. 48 38. 17
T 119. 76 119. 76 119. 76 119. 76
X1 4. 27 4. 38 4. 44 4. 67
X2 4. 46 4. 52 4. 48 4. 40
X3 4. 58 4. 41 4. 39 4. 24
Xmin 4. 27 4. 38 4. 39 4. 24
Xmax 4. 58 4. 52 4. 48 4. 67
R 0. 30 0. 14 0. 09 0. 43
表 3
正交设计方差分析
Table 3
Variance analysis o f ort ho gonal experiment
变异来源
Source of variance
平方和
Sum of squ are
自由度
Freedom
均方
Mean square
F值
F valu e
F0. 05值
F0. 05
F0. 01值
F0. 01
A 0. 4225 2 0. 2113 16. 3531** 3. 55 6. 01
B 0. 1016 2 0. 0508 3. 9329*
C 0. 0401 2 0. 0200 1. 5512
D 0. 8382 2 0. 4191 32. 4447**
误差 Error 0. 2325 18 0. 0129
79
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3
讨
论
3. 1
紫花苜蓿黄酮的提取方法有热水煎煮法、索氏
提取法、有机溶剂浸提法、微波法等,前两者需要加
热到沸腾,提取温度高, 不利于保持黄酮的稳定性,
前 3种方法均有提取时间长、杂质多、效率低的缺
点。而后者提取温度始终在 35~ 40
之间,提取条
件温和、节能、省时、效率高和选择性强。这是因为
被提取的极性分子在微波电磁场所产生的每秒24. 5
亿次超高频率下快速震动,物料分子间相互碰撞、挤
压、摩擦, 使物料充分并且快速溶解于溶剂 [ 13, 14] , 有
利于有效成分的浸出。
3. 2
微波辅助萃取法的萃取速度和质量使该技术
成为天然产物提取的有利工具。利用微波可实现苜
蓿黄酮的快速、高效提取。若能在微波炉中增加搅
拌装置,将会更有利于产品的提取。
4
结
论
4. 1
在微波辅助提取苜蓿黄酮时,固液比和乙醇浓
度是影响提取效率的主要因素, 微波功率和其它因
素影响较小。最佳提取工艺为: 40%乙醇、500 W 功
率、作用 60 s、1
30固液比。此工艺条件下, 黄酮
提取量的理论值为 4. 92 mg/ g, 接近于实际测定值
4. 88 mg / g。与传统的有机溶剂温浸法相比, 具有
节省时间、节约能耗、效率高的优点。
4. 2
纯水、20%乙醇、40%乙醇的提取液为茶黄色
至淡黄绿色,非极性杂质影响较小; 60%乙醇、80%
乙醇提取液为绿色至浓绿色, 需加石油醚萃取 3~ 5
次去除叶绿素干扰,增加了试验步骤和成本。
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(责任编辑
梁艳萍)
80