全 文 ：第 19 卷 第 4 期
Vol. 19 No. 4
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2011 年 7 月
Jul. 2011
苜蓿褐斑病抗性相关分子标记验证
毕 波1, 王 瑜1 , 袁庆华1* , 高建明2
( 1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京 100193; 2.天津农学院, 天津 300384)
摘要:选取 4 个具有不同遗传背景的紫花苜蓿( Med icago sativa L. )国内外推广品种为材料, 通过人工接种试验每
个品种筛选苜蓿褐斑病高抗、高感单株各 10 株,运用 ISSR , AFLP 和 SRAP分子标记技术对标记适用性进行验证,
以期筛选准确性高的分子标记,提高试验的重复性和稳定性。结果表明: 4 个品种的总体病情指数和抗病性成反
比,抗病性大小依次为: 赛迪> 新疆大叶> 中苜一号> 龙牧 801;且筛选到的高抗、高感单株的抗病性与 4 个品种的
总体抗病性基本相符;适用性高的标记有感病标记 ISSR22S450、抗病标记 SRAPM3E3R169和 ISSR20R750 , 分子标记检
测的符合率在 75% ~ 85%之间,可用于苜蓿褐斑病的标记辅助选择育种工作。适用性中等的标记有感病标记 IS-
SR6S640和 AFLP38S264 ,抗病标记 AFLP1R206 , AFLP16R185和 ISSR834R450均在 1个品种中显示出差异不显著, 仍需在
更多品种中验证;适用性差的标记有感病标记 ISSR11S750和 ISSR22S640 , 不能作为检测苜蓿褐斑病的可靠指标。
关键词:苜蓿; 褐斑病; ISSR标记; AFLP 标记; SRAP 标记; SCAR 标记
中图分类号: S541. 9; S432. 2 文献标识码: A 文章编号: 1007-0435( 2011) 04-0663-05
Verif ication of Molecular Markers Linked to Resistance Gene
of Common Leaf Spot Disease in Tetraploid Alfalfa
BI Bo1 , WANG Yu1 , YUAN Qing-hua1* , GAO Jian-ming2
( 1. In st itute of Animal Sciences, CAAS, Beijing 100193; 2. T ianjin Agricul tu ral Un iversity, Tianjin 300384)
Abstract: In this research, four alfalfa cult ivars w ith different genet ic backg rounds w ere used as exper-i
mental materials. Resistant and suscept ible plants w ere screened after art ificial infect ion. T he applicability
of marker s selected by ISSR, AFLP and SRAP were verif ied. Markers w ith high applicability w ere
screened to improve the repeatability and stability of exper iment . T he exper imental results demonstr ate
that susceptible marker ISSR22S450 , resistant markers SRAPM 3E3R169 and ISSR20R750 w ith high applicabil-i
ty can be used fo r marker-assisted select ion ( MA S) w ith 75% to 85% coincidence rate. Suscept ible mark-
ers ISSR6S640 and AFLP38S2 64 , resistant markers A FLP1R206 , AFLP16R185 and ISSR834R450 w ith middle ap-
plicability w il l requir e addit ional r esearch fo r verificat ion. T he suscept ible markers ISSR11S750 and IS-
SR22S640 w ith poo r applicability w ere not the reliability index for common leaf spot detect ion.
Key words: Alfalfa; Common leaf spot ; ISSR marker; AFLP marker; SRAP marker; SCAR marker
苜蓿(Medicago sativa L. )假盘菌( P seudop e-
z iz a med icagini s ( L ib. ) Sacc)引起的褐斑病是最
常见和破坏性较大的真菌类病害之一, 可使冠层同
化 CO2 的能力下降, 导致苜蓿产草量减少、增加了
病草中香豆醇类物质的含量, 进而影响母畜的繁殖
能力[ 1] 。目前,研究人员普遍认为选育和使用抗病
品种是防治苜蓿褐斑病的有效措施,且分子标记已
在植物抗病育种研究中发挥了革命性的作用 [ 2]。传
统的病害诊断方法大多是根据植株的表观症状进行
的,随着研究技术的发展,国内外学者先后根据苜蓿
假盘菌的生理活性变化 [ 1, 3 4]、生物学特征 [ 5]、同工酶
的差异表达 [ 6 7] 和 DNA 的差异[ 8] 对苜蓿褐斑病进
行研究和评价。目前, 利用分子标记技术建立 DNA
指纹图谱( F ingerprint)为研究植物病害提供了新的
手段,并已应用于很多抗病基因的研究。例如, 番茄
( S olanum ly cop ersicum )抗斑萎病[ 9]、谷子( Setar ia
i tal ica ) 抗叶锈病[ 10]、小麦 ( Trit icum aesti vum )
抗叶锈病[ 11] 等方面。近年来, 陆续有研究者利用
收稿日期: 2011-03-04;修回日期: 2011- 04-15
基金项目:国家自然基金项目( 30972140) ;国家/ 十二五0科技支撑项目( 2011BAD17B01)资助
作者简介:毕波( 1984- ) ,女,河北唐山人,硕士研究生,研究方向为牧草种质资源与遗传育种, E-mail: bib o_1234569@ 163. com; * 通讯作者
Auth or for correspon dence, E-mail: yuanqinghua@ hotmail. com
草 地 学 报 第 19卷
RAPD, ISSR, AFLP 和 SRAP 分子标记技术对与苜
蓿褐斑病抗性基因连锁的分子标记进行了研
究[ 12~ 15] , 并初步筛选出了与苜蓿褐斑病连锁的分子
标记,但是,由于前人是在群体水平上进行上述研
究,缺乏在个体水平上对单株进行的可靠性分析。
因此,本试验选取具有不同遗传背景的国内外苜蓿
推广品种,在个体水平上检测与苜蓿褐斑病抗病基
因相关的分子标记的准确性。通过筛选准确性高的
分子标记,提高试验的重复性和稳定性,为将其转化
为快速检测苜蓿褐斑病 SCAR 标记和抗病基因的
克隆以及遗传图谱的建立奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
选取 4个具有不同遗传背景的紫花苜蓿品种
为试验材料, 即赛迪 Sadie( VS) (来源于北京克劳
沃草业技术开发中心)、新疆大叶( VX)、中苜一号
( VZ)和龙牧 801( VL) ,分别来源于美国、新疆、北
京和黑龙江, 种子均由中国农科院北京畜牧兽医
研究所提供。苜蓿假盘菌来自中国农业科学院北
京畜牧兽医研究所牧草试验地生长 6 年的感病苜
蓿田采集的菌株( P. m-A)。
1. 2 方法
1. 2. 1 育苗 参照孟芳等 [ 14]方法,并作适当改动。
每品种育苗 250株。幼苗接种根瘤菌后, 移栽到装
有草碳和泥土 (比例为 1 B 1)的育苗钵( 13 cm @
13 cm)内,并将温度控制在 20~ 25 e 之间。
1. 2. 2 接种鉴定 采用接种盘倒扣接种法[ 16] 。接
种 20 d后进行病情调查,以株为单位根据病情指数
对病害等级进行评价。首先,根据叶片上病斑个数
划分病情分级标准,即: 0级:无病斑; 1级:病斑数在
10个以下; 2级: 病斑数在 11~ 30个; 3级: 病斑数
在 31~ 50个; 4级: 病斑数在 50个以上。其次, 根
据病情指数[ 14] 将苜蓿材料分为4个等级:高抗 HR,
病情指数 [ 20;中抗 MR, 20< 病情指数 [ 40; 中感
MS, 40< 病情指数 [ 60;高感 H S, 病情指数> 60。
1. 2. 3 基因组 DNA 提取和定量 紫花苜蓿基因
组 DNA 提取方法采用 N 2-SDS 法 [ 17] , 定量方法参
照王瑜等[ 15] 的方法。用于 ISSR 和 SRAP 标记的
DNA 终浓度为 10 ng # LL - 1 , 用于 AFLP 标记的
DNA 终浓度为 20 ng #LL - 1 , - 20 e 保存备用。
1. 2. 6 分子标记反应体系和程序 验证前人筛选
到的与褐斑病基因连锁的标记[ 13, 14] (表 1) , 参照王
瑜[ 1 3]的 PCR反应体系和程序进行试验。
表 1 ISSR, AFLP 和 SRAP 引物序列
T able 1 Sequence o f ISSR , AFLP and SRAP primer s
标记 Mark ers 序列( 5c- 3c) Sequ ence( 5c-3c) 标记 Markers 序列( 5c- 3c) Sequ ence( 5c-3c)
ISSR6S640 ACACACACACACACACTC AFLP1R206 GAT GAGTCCT GAGT AA CAA
ISSR834R450 AGAGAGAGAGAGAGAGYT GACTGCGTACAT GCAG ACT
ISSR11S750 ACGACGACGACGACGACG AFLP16R185 GAT GAGTCCT GAGT AA CAC
ISSR20R750 AGAGAGAGAGAGAGAGCT GACTGCGTACAT GCAG T AG
ISSR22S640 T CTCT CT CTCT CT CTCCC AFLP38S264 GAT GAGTCCT GAGT AA CTA
ISSR22S450 T CTCT CT CTCT CT CTCCC GACTGCGTACAT GCAG GGA
SRAPM3E 3R169 T GAGT CCAAACCGGAAT
GACTGCGT ACGAAT T GAC
2 结果与分析
2. 1 抗病性鉴定
接种 20 d 后, 统计各品种的病情指数(表 3)。
病情指数最低的是来源于美国的赛迪苜蓿, 为
171 51;新疆大叶和中苜一号居中, 病情指数分别为
20. 29 和 20. 24; 龙牧 801 的病情指数最高, 为
271 79。赛迪的发病率为 76. 40%, 新疆大叶和中苜
一号的发病率分别为 80. 49%和 81. 18% ,龙牧 801
的发病率为 84. 08%。综合 4 个品种的病情指数和
发病率,抗病性依次为:赛迪> 新疆大叶> 中苜一号
> 龙牧 801,赛迪属于高抗品种,新疆大叶、中苜一
号和龙牧 801属于中抗品种, 龙牧 801的抗病性最
低。就本研究所用的苜蓿材料而言, 国外苜蓿品种
对苜蓿褐斑病的抗病性优于国内材料。
根据接种鉴定的结果, 在 4个苜蓿品种中做进
一步筛选。从每个品种中分别筛选出长势良好、且
病情指数最高及最低各 10个单株(表 3)。筛选到
的高感单株的病情指数均> 60, 抗病单株的病情指
数均< 20,且每个品种中 10 个高感单株和 10个高
抗单株的病情指数均值均为赛迪< 新疆大叶< 中苜
一号< 龙牧 801,与 4个品种的抗病性基本相符。
664
第 4期 毕波等:苜蓿褐斑病抗性相关分子标记验证
2. 2 感病标记
感病标记 ISSR11S750和 ISSR22S640的符合率总
体最低, µ2 检测差异不显著, 在 4个品种中的符合
率也较低;标记 ISSR6S640和 AFLP38S264的符合率处
于中等水平, µ2 检测差异显著, 4个品种中均各有 1
个品种的 µ2 检测差异不显著; 标记 ISSR22S450在 4
个品种的抗感单株间差异均达显著水平, 分子标记
检测的符合率在 75%~ 85%之间, 总体符合率也最
大, µ2 检测差异显著(表 2)。在 5个标记中, 赛迪的
符合率较低,有 4个标记的差异不显著。
表 2 ISSR, AFLP 和 SRAP 各标记单株验证结果
Table 2 Validation in resistant and suscept ible plants with ISSR, AFLP and SRAP markers
标记
Markers
品种
Variety
R+ R- S+ S-
符合率
CR, %
µ2 P 标记
Markers
品种
Variety
R+ R- S+ S-
符合率
CR, %
µ2 P
ISSR22S450 V S 0 10 5 5 75. 00 6. 67 0. 010 ISSR20R750 V S 10 0 3 7 85. 00 10. 77 0. 001
VX 0 10 5 5 75. 00 6. 67 0. 010 VX 10 0 4 6 80. 00 8. 57 0. 003
V Z 0 10 5 5 75. 00 6. 67 0. 010 V Z 10 0 5 5 75. 00 6. 67 0. 010
VL 0 10 7 3 85. 00 10. 77 0. 001 VL 10 0 5 5 75. 00 6. 67 0. 010
总计 T ot al 0 40 22 18 77. 50 30. 35 0. 000 总计 T ot al 40 0 17 23 78. 75 32. 28 0. 000
AFLP38S264 V S 4 6 7 3 65. 00 1. 82 0. 178 SRAPM3E3R169 V S 7 3 0 10 85. 00 10. 77 0. 001
VX 5 5 10 0 75. 00 6. 67 0. 010 VX 6 4 0 10 80. 00 8. 57 0. 003
V Z 4 6 10 0 80. 00 8. 57 0. 003 V Z 6 4 1 9 75. 00 5. 50 0. 019
VL 3 7 10 0 85. 00 10. 77 0. 001 VL 6 4 1 9 75. 00 5. 50 0. 019
总计 T ot al 16 24 37 3 76. 25 24. 65 0. 000 总计 T ot al 25 15 2 38 78. 75 29. 57 0. 000
ISSR6S640 V S 4 6 7 3 65. 00 1. 82 0. 178 AFLP 1R206 V S 9 1 0 10 95. 00 16. 36 0. 000
VX 6 4 10 0 70. 00 5. 00 0. 025 VX 9 1 4 6 75. 00 5. 50 0. 019
V Z 5 5 10 0 75. 00 6. 67 0. 010 V Z 7 3 2 8 75. 00 5. 05 0. 025
VL 4 6 10 0 80. 00 8. 57 0. 003 VL 10 0 8 2 60. 00 2. 22 0. 136
总计 T ot al 19 21 37 3 72. 50 19. 29 0. 000 总计 T ot al 35 5 14 26 76. 25 23. 23 0. 000
ISSR11S750 V S 6 4 2 8 40. 00 3. 33 0. 068 AFLP 16R185 V S 10 0 2 8 90. 00 13. 33 0. 000
VX 5 5 7 3 60. 00 0. 83 0. 361 VX 10 0 3 7 85. 00 10. 77 0. 001
V Z 6 4 10 0 70. 00 5. 00 0. 025 V Z 10 0 6 4 70. 00 5. 00 0. 025
VL 5 5 10 0 75. 00 6. 67 0. 010 VL 10 0 10 0 50. 00 - -
总计 T ot al 22 18 29 11 58. 75 2. 65 0. 104 总计 T ot al 40 0 21 19 73. 75 24. 92 0. 000
ISSR22S640 V S 6 4 4 6 40. 00 0. 80 0. 371 ISSR834R450 V S 10 0 3 7 85. 00 10. 77 0. 001
VX 4 6 5 5 55. 00 0. 20 0. 653 VX 10 0 4 6 80. 00 8. 57 0. 003
V Z 4 6 5 5 55. 00 0. 20 0. 653 V Z 9 1 4 6 75. 00 5. 50 0. 019
VL 4 6 6 4 60. 00 0. 80 0. 371 VL 1 9 2 8 65. 00 0. 39 0. 531
总计 T ot al 18 22 20 20 52. 50 0. 20 0. 654 总计 T ot al 30 10 13 27 71. 25 14. 53 0. 000
注( No te) : CR: coincide rate
表 3 4 个苜蓿品种病情指数统计
T able 3 Disease index statistics of 4 alfalfa var ieties
品种
Variety
株数
No.
发病率, %
Dis ease rate
病情指数
DI
抗病性
Diseas e resi stance
高抗株病情指数平均值
DI in 10 resistant plan ts
高感株病情指数平均值
DI in 10 su scept ible plants
赛迪 178 76. 40 17. 51 高抗 HR 2. 11 63. 75
新疆大叶 205 80. 49 20. 29 中抗 MR 2. 14 65. 79
中苜一号 186 81. 18 20. 24 中抗 MR 2. 21 72. 04
龙牧 801 201 84. 08 27. 79 中抗 MR 2. 29 75. 77
注( Note) : DI: Dis ease index; H R: H igh res istant ; MR: Middle resis tant
2. 3 抗病标记
抗病标记 SRAPM 3E3R169 (图 1)和 ISSR20R750
在 4个品种的抗感单株间均有显著差异, 分子标记
检测的符合率在 75% ~ 85%之间,总体符合率均为
78. 75% , µ2 检测差异达显著水平(表 2) ; 标记 IS-
SR834R450 , AFLP1R206和 AFLP16R185的总体符合率
居中, µ2 检测显示仅在 1个品种中差异不显著。在
所有抗病标记中, 龙牧 801符合率最低,赛迪最高。
665
草 地 学 报 第 19卷
图 1 SRAPM3E3R169标记在抗、感单株中的扩增图谱
F ig. 1 Validat ion of SRAPM3E3R169 primer in r esistant and susceptiple plants
注: M : DNA 标准; 1~ 10:赛迪感病单株; 11~ 20:赛迪抗病单株; 21~ 30:新疆大叶感病单株; 31~ 40:新疆大叶抗病单株;
41~ 50:中苜一号感病单株; 51~ 60:中苜一号抗病单株; 61~ 70:龙牧 801感病单株; 71~ 80:龙牧 801抗病单株
N ote: M : DNA M ark er; 1~ 10, 21~ 30, 41~ 50, 61~ 70: suscept ible plan ts; 11~ 20, 31~ 40, 51~ 60, 71~ 80: resistant plants
3 讨论
苜蓿褐斑病抗病基因紧密连锁标记的获得, 可
以进行分子标记辅助育种,提高育种效率,加快苜蓿
新品种的选育进程。马鸿文[ 18] 对苜蓿假盘菌的最
适培养条件进行了探讨, 并对假盘菌进行 ISSR 分
子指纹分析, 将北京 Pm-A、南疆 Pm-D 和内蒙的
Pm-F 菌株划分到一类; 桂枝等 [ 19]运用 RAPD分子
标记技术对抗褐斑病苜蓿进行多态性分析; 孟芳
等[ 1 4, 20]用 ISSR技术筛选到 5个与 F1 代苜蓿褐斑
病连锁的分子标记, 并将其中 2个标记成功的转化
为 SCAR标记;王瑜[ 13]用 ISSR, AFLP 和 SRAP 技
术获得 8个与苜蓿褐斑病相关的分子标记,但国外
未见相关报道,前人的研究大大丰富了苜蓿褐斑病
分子标记的种类和数量。
由于紫花苜蓿为同源四倍体,自交不亲和, 遗传
本质非常复杂,导致品种内的差异往往比较大, 加之
苜蓿对褐斑病的抗性又为数量性状, 因此在群体水
666
第 4期 毕波等:苜蓿褐斑病抗性相关分子标记验证
平上以某些品种为材料筛选出的标记可能并不适合
于其他品种,故而有必要在具有不同遗传背景的群
体中验证已筛选出的标记的适用性。结果表明, 标
记 ) ) ) 性状符合率值的高低代表了标记与苜蓿褐斑
病抗病(或感病)基因连锁的紧密程度。根据符合率
值的高低将所验证的标记分为 3 类。第一类包括
ISSR22S450 , SRAPM 3E3R169和 ISSR20R750 , µ2 值分别
高达 30. 35, 29. 57和32. 28,符合率高(分别为77150%,
78. 75%和 78. 75%) , 且在 4个品种中均差异显著,
说明这 3个标记与褐斑病相关基因紧密连锁, 标记
的适用性高。由于标记辅助选择的关键是标记和目
的基因连锁的紧密程度, 因此,将这一类标记用于标
记辅助选择,可在选育抗病品种的过程中,极大地提
高杂交/回交的速度和效率,降低成本。第二类包括
标记 ISSR6S640 , AFLP38S264, AFLP1R206 , AFLP16R185 和
ISSR834R450 ,虽然 µ2 检测差异显著, 但这 5 个标记
均在 1个品种中显示出差异不显著,表明其与苜蓿
褐斑病相关基因的连锁不是很紧密,检测符合率为
中等,标记的适用性亦为中等;第二类标记的适用性
如何还需要在更多的品种中进行验证。第三类标记
有 ISSR11S750和 ISSR22S640 , µ2 检测差异不显著, 符
合率也较低,表明这 2个标记与苜蓿褐斑病相关基
因连锁不紧密; 在多数品种中 µ2 检测均显示差异不
显著,说明标记的适用性差,不能作为检测苜蓿褐斑
病的可靠指标。
ISSR6S640等 5个标记均表现出在 3个品种中符
合率高而另 1个品种中符合率低的现象, 可能是由
于这些标记与褐斑病相关基因间遗传距离比较大,
发生遗传重组的几率比较大; 一旦发生重组, 势必降
低品种中携带该标记的单株比率, 导致符合率降低。
研究结果显示 4个品种的抗病性大小依次为:
赛迪> 新疆大叶> 中苜一号> 龙牧 801,即:赛迪属
于高抗材料,其他 3个品种属于中抗材料,其中又以
龙牧 801的抗病性最低。因此,对于赛迪来说,从中
筛选出的抗病单株才能代表其真实的遗传特性, 而
感病单株则偏离了其真实的特性, 所以感病标记(如
ISSR11S750和 ISSR22S640 ) 在抗病性最好的品种 (赛
迪)中的符合率最低。对龙牧 801来说,由于其抗病
性更接近中抗(中感) , 因此从中筛选出的感病单株
能较真实地反映其遗传特性, 而筛选出的抗病单株
则在一定程度上偏离了该品种的特性, 所以抗病标
记(如 SRA PM3E3R169和 ISSR20R750 )在龙牧 801 中
的符合率最低。
4 结论
验证了前人筛选到的与苜蓿褐斑病相关的分子
标记, 适用性高的标记为感病标记 ISSR22S450、抗病
标记SRA PM3E3R169和 ISSR20R750 ;适用性中等的标
记有感病标记 ISSR6S640和 AFLP38S264 , 抗病标记
AFLP1R206 , AFLP16R185和 ISSR834R450 ; 适用性差的
标记有感病标记 ISSR11S750和 ISSR22S640。
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(责任编辑 李美娟)
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