全 文 ：文章编号: 1007-0435( 2003) 02-0154-05
驼绒藜属植物种质资源遗传多样性 RAPD分析
韩　冰, 王学敏, 易　津, 赵萌莉, 杨燕燕
(内蒙古农业大学,呼和浩特 010018)
摘要:对驼绒藜属 7 份材料在分子水平上, 采用 RAPD 技术进行遗传距离的分析和研究。结果表明,驼绒藜种
的宁夏生态型、新疆生态型和荒漠生态型以及科尔沁生态型的华北驼绒藜种与华北驼绒藜聚成一个大类群。驼
绒藜种和华北驼绒藜种的遗传关系较近。将北美驼绒藜种和心叶驼绒藜种划成两个独立类群。驼绒藜属内的种
间存在着较大的遗传差异,具有丰富的遗传多样性。随机引物 S64 扩增的 7种谱带类型可以区别 7 份材料。
关键词: RAPD 技术; 驼绒藜; 遗传多样性
中图分类号: Q943; S541. 9　　　文献标识码: A
Genetic Diversity of Ceratoides Germplasm by RAPD Analysis
HAN Bing, WANG Xue-min, YI Jin, ZHAO Meng-li, YANG Yan-y an
( Inner Mongo lia Ag r icultur al Univer sity , Huhho t, Inner M ongolia Autonom ous Region 010018, China)
Abstract: Seven Cer atoides L. materials w ere analyzed using the RAPD ( DNA ) method. T he genet ic
distance of the ecotypes of Ningx ia , Xinjiang , desert , and Hor qin( Inner M ongo lia) g ather in a big gr oup
based on the molecular level, show ing that they belong to the northern China species( C. arborescens) , and
has close genet ic relat ionship w ith C. latens. C. ew er smanniana and C. lanata ar e differ ent iated into tw o
independent species. There are obvious dif ferences and abundant genet ic div ersit ies among the Ceratoides
L. species.
Key words : RAPD; Ceratoides L; Genet ic div ersity
　　驼绒藜属是藜科最古老的属之一,在世界上共
有 6个种,我国产 4种,本文共涉及到其中 4个种的
7个材料[ 1, 2]。驼绒藜是生长于荒漠及荒漠草源的半
灌木或小灌木植物,其生活年限长,具有抗寒、耐热、
耐贫瘠的特性,而且驼绒藜诸种均为农畜所喜食的
优良抓膘饲草,具有产草量高,叶量和干物质多等优
点。驼绒藜生育期较长,在水土保持, 防风治沙, 以及
草原植被恢复与保持, 荒漠化的防治等方面都有广
阔的应用前景,尤其对于西北干旱、半干旱地区的荒
漠治理具有非常重要的意义[ 2]。对于该属植物各方
面的研究报道较少,现有的主要集中在分类学、植物
学特征,地理分布等方面。本项目是在以往研究的基
础上,在分子水平上, 采用 RAPD方法对驼绒藜属7
个材料进行遗传距离的分析和研究[ 5～8] ,进一步了
解各材料间的关系及其亲缘关系的远近,为驼绒藜
属植物的栽培、驯化、选育和荒漠草原的合理利用及
改良,发展我国干旱地区畜牧业提供理论依据。
由于 RAPD 技术具有所用 DNA 的量很少, 且
无需事先知道 DNA 的序列,不需放射性同位素, 其
灵敏度和实验条件较简等一系列独特的优点, 因此
对驼绒藜属 7份材料的研究采用了 RAPD技术。
1　材料与方法
1. 1　实验材料
1. 1. 1　本实验所采用的驼绒藜属材料均采自内蒙
古农业大学牧草实验驼绒藜繁育基地, 共 7份材料,
包括 4个种,其中有驼绒藜种 C. latens的宁夏生态
收稿日期: 2002-08-29; 修回日期: 2002-12-10
基金项目:国家自然科学基金“驼绒藜属牧草种子生物学特性的研究”(项目编号: C 39960010)资助
作者简介:韩冰( 1970-) ,女,讲师,在读博士生,主要从事植物分子生物学科研工作
第 11卷　第 2期
　Vo l. 11　　No. 2
草　地　学　报
ACT A AGRESTIA SIN ICA
　2003 年　6月
　June 　2003
型( K)、新疆生态型( O)、荒漠生态型( P ) , 华北驼绒
藜种C. ar borescens( G)、科尔沁生态型华北驼绒藜
C. arborescens( L ) , 心叶驼绒藜种 C. ew er smanniana
( N)以及北美驼绒藜种 C. lanata( R)。
1. 1. 2　每份材料随机采收 5 个单株, 分别提取
DNA ,等量做成一个 DNA 池, 混匀, 以下实验均使
用 DNA 池中的 DNA。实验于 2002年 3～6月在内
蒙古农业大学生物工程学院开放实验室完成。
1. 2　实验方法
1. 2. 1　DNA 的提取及检测　采用CT AB(十六烷基
三乙基溴化铵)法提取供试材料基因组 DNA。采用紫
外分光光度法, 检测DNA 的纯度及浓度,用 0. 7%的
琼脂糖水平凝胶电泳检测DNA 的纯度及完整性。
1. 2. 2　PCR 扩增　参照 Williams[ 3]等方法, 通过
对 DNA浓度,引物等条件进行初步调整,达到了反
应条件的优化, 确定 25 uL 的 PCR 反应体系: 10×
Buf fer 缓冲液 2. 5 uL, Mg 2+ 2. 0 uL ( 10 mmo l/ L ) ,
引物 1 uL( 100 pmol/ uL) , DNA 20 ng , T aq酶 0. 2
uL( 5u/ uL ) , dNT Ps 0. 2 uL ( 10 mmo l/ L ) , 最后用
无菌三蒸水将反应体系补齐至 25 uL。PCR反应的
条件设置为: 94℃预变性 3 m in, 94℃变性 1 m in,
37℃退火 1 min, 72℃延伸 1. 5 min, 45次循环, 最后
72℃延伸 5 m in。
1. 2. 3　引物的筛选　采用 Songon 公司的随机引
物,经预备实验从 95个引物中选择扩增产物稳定、
重复性好的 24 个引物对所有个体的基因组 DNA
进行扩增。
1. 2. 4　PCR 产物的检测　用 1. 5%的水平式琼脂
糖凝胶对 PCR扩增产物电泳, EB 染色检测扩增产
物,将凝胶放在自动凝胶成像系统下进行分析。
1. 3　RAPD数据统计分析
1. 3. 1　RAPD 表型带统计　每个引物扩增带按有
或无记录,“有”赋值为 1,“无”赋值为 0,得到原始数
据表。若扩增片段出现的频率小于 0. 99,则此位点
称为多态位点。
1. 3. 2　遗传分析　根据 Nei[ 4]的方法计算相似系
数 F, F= 2Nxy/ ( N x+ Ny)
式中 Nxy 为 x 和 y 扩增的共有条带数; Nx 和
Ny 分别为 x 和 y 的扩增总条带数。
1. 3. 3　遗传距离指数 D( Genet ic Distance Index )
　D= 1- F。根据遗传距离进行聚类分析, 构建树
状图。
2　结果与分析
2. 1　DNA 检测结果
用紫外分光光度法和 0. 7%的琼脂糖凝胶电泳
检测 DNA 的浓度及纯度,均达到 PCR 反应要求。
2. 2　特异谱带类型
PCR扩增后,引物 S47、S318、S73、S45、S64、S3
等产生了丰富的谱带类型,可以用来鉴定 7份材料,
其中引物 S64在 7份材料上扩增的谱带类型各不相
同(见图 1-2引物 S64扩增图谱) ,经 4次重复实验,
该结果重复稳定出现, 所以用引物 S64 可以区别鉴
定 7份驼绒藜材料。
2. 3　RAPD标记统计结果
对 7份材料进行扩增条带总数与多态性条带统
计分析结果,在 7份供试材料中, 24个有效引物扩
增出 166条清晰谱带,不同引物的扩增带数变幅从
3条到 13条不等, 平均每个引物扩增出 6. 91条带。
多态性条带为 139 条, 总的多态位点比率为
83. 73%。每个引物可扩增的多态性带有不等,变幅
从 1条到 13条,平均为 5. 79条(表 1)。表明驼绒藜
属植物材料间具有很高的多态性, 遗传变异较大。部
分引物的扩增结果见图 1。
2. 4　遗传相似系数及遗传距离分析
遗传相似系数( genet ic sim ilar ity , F )和遗传距
离( g enet ic distance, D)是评价遗传变异水平的重
要指标。根据 24个有效引物 PCR 扩增产物的电泳
结果,按 N ei氏的方法计算供试材料的遗传相似系
数( F )和遣传距离( D) (表 2、3)。遗传相似度越大,
亲缘关系越近,遗传距离越大,说明亲缘关系越远。
各材料间的遗传距离从 0. 205到 0. 397不等。其中
荒漠型驼绒藜( P )与北美驼绒藜( R)的遗传相似系
数最小( 0. 603) ,遗传差异最大。原产于内蒙古中东
部的华北驼绒藜( G)与原产于新疆的新疆生态型驼
绒藜( O)的相似系数最大为 0. 795, 遗传差异最小。
华北驼绒藜的两份材料( G和 L )相似系数是0. 725。
驼绒藜的三份材料中 K、O相似系数是 0. 713, K、P
155第 2期 韩　冰等:驼绒藜属植物种质资源遗传多样性 RAPD分析
表 1　供试材料 RAPD 标记统计结果
Table 1　Result s o f RAPD loci gener ated by 24 random decamer pr imer s o f 7 mat erials
引物 扩增带总数 多态性条带总数 供试材料编号 多态性条带( % )
Primers
Total b ands
inertased
No. of polymorphic
bands
Plant material s number
K P L O G R N
Polymorphic
bands ( % )
S 3 10 8 5 6 6 5 5 4 5 80. 00
S9 10 10 1 1 2 2 1 1 1 100. 00
S10 5 4 1 1 3 3 4 5 5 80. 00
S24 10 8 6 5 5 4 6 7 6 80. 00
S37 3 2 3 2 3 3 2 3 3 66. 67
S45 3 1 2 2 2 3 3 2 2 33. 33
S46 9 9 1 2 3 5 5 3 5 100. 00
S47 5 3 4 3 4 4 2 3 3 60. 00
S48 5 5 1 1 1 2 2 2 1 100. 00
S49 4 3 1 2 1 3 3 2 2 75. 00
S64 7 7 4 5 4 3 3 3 4 100. 00
S73 5 4 4 4 3 3 4 4 2 100. 00
S123 5 4 2 2 4 2 3 3 2 80. 00
S311 7 6 5 6 7 1 1 3 4 85. 71
S318 5 3 5 2 4 3 4 4 4 60. 00
S320 4 2 3 2 2 4 2 2 2 50. 00
S441 10 10 3 1 2 2 3 4 4 100. 00
S442 6 6 3 0 3 4 4 4 2 100. 00
S446 8 5 4 5 6 6 4 4 7 62. 50
S450 6 6 1 1 1 1 1 1 1 100. 00
S451 12 9 6 6 7 6 3 5 5 75. 00
S454 9 8 3 4 4 5 5 4 4 88. 89
S455 4 3 1 1 3 3 2 2 1 75. 00
S456 13 13 4 2 3 5 5 5 5 100. 00
图 1　供试材料 RAPD 分子标记结果
F ig . 1　T he RAPD amplified r esult of 7 mater ials
K:宁夏生态型驼绒藜(C . late nsNin gxia ecotype)、O:新疆生态型驼绒藜( C. latens Xinjiang ecotype)、P:荒漠生态型驼绒藜( C. lat ens desert
ecotyp e)、G:华北驼绒藜( C. arbore scens)、L: 科尔沁生态型华北驼绒藜( C. arbor escens Horqin ecotype)、N:心叶驼绒藜( C . ew ersmanniana)、R:
北美驼绒藜( C. lanata)
156 草　地　学　报 第 11卷
表 2　供试材料 RAPD扩增产物的条带数目及相似率
T able 2　The common bands and similar itiy r ate among bands of RAPD of 7 mater ials
材料 总条带数 相同条带数
No. of s ame bands
相似率
Sim ilarit y rate
M ater ials Total b ands K L N O P R K L N O P R
G 77 52 58 53 64 48 55 0. 693 0. 725 0. 675 0. 795 0. 671 0. 701
K 73 - 60 52 56 54 56 - 0. 769 0. 680 0. 713 0. 777 0. 732
L 83 - 56 66 48 59 - 0. 687 0. 790 0. 711 0. 724
N 80 - 53 51 52 - 0. 646 0. 699 0. 650
O 84 - 48 56 - 0. 640 0. 683
P 66 - 44 - 0. 603
R 80 - -
表 3　7 份材料间的遗传距离(D= 1- F)
T able 3　Genetic distance among 7 mater ials
G K L N O P R
G - 0. 307 0. 275 0. 325 0. 205 0. 329 0. 299
K - 0. 231 0. 320 0. 287 0. 223 0. 268
L - 0. 313 0. 210 0. 289 0. 276
N - 0. 354 0. 301 0. 350
O - 0. 360 0. 317
P - 0. 397
R -
图 2　7份材料 RAPD 聚类分析树状图
F ig . 2　A dendrog ram genera ted fr om 7 mater ials based on RAPD marker s
K: 宁夏生态型驼绒藜( C. late ns Ning xia ecotype)、O:新疆生态型驼绒藜( C. lat ens Xinjiang ecotype)、P: 荒漠生态型驼绒藜( C . lat erns
Desert ecotype)、G: 华北驼绒藜 ( C. arbor escens)、L : 科尔沁生态型华北驼绒藜 ( C . arborescens Horqin ecotype)、N: 心叶驼绒藜 ( C.
ew ersmanniana)、R:北美驼绒藜( C. lanata)
相似系数是 0. 777, O、P 相似系数是 0. 640, 均小于
种内居群间的遗传一致度 0. 90[ 10] , 说明这两个种内
的材料间都具有较大的遗传差异。
2. 5　 UPGMA ( Unweighted pair group method
using arithmetic averages )分析结果 [ 10]
以 1- F 值用 U PGMA方法进行 7个生态型的
聚类分析,并画出聚类图(图 2) ,驼绒藜属 7份材料
的聚类结果,将华北驼绒藜 G 和新疆型驼绒藜 O,
宁夏型驼绒藜 K 和荒漠型驼绒藜 P,先分别聚成两
个类群,然后是将 K- P- G- O- L( L :科尔沁型华
北驼绒藜)聚成一个大类群, 将北美驼绒藜种 R 和
心叶驼绒藜种 N 划成两个独立类群。本实验涉及到
驼绒藜属的四个种, 由此可初步认为,华北驼绒藜种
157第 2期 韩　冰等:驼绒藜属植物种质资源遗传多样性 RAPD分析
和驼绒藜种的遗传背景较一致, 而北美驼绒藜与这
两个种的遗传关系比心叶驼绒藜与这两个种的遗传
差异小。结果表明我国驼绒藜属植物存在着较大的
遗传差异,具有丰富的遗传多样性。
3　讨论
3. 1　驼绒藜属植物遗传多样性的初步分析
从实验分析结果可以看出, 宁夏型、新疆型、荒
漠型作为驼绒藜一个种内的 3 份材料,遗传相似系
数并没有达到 0. 90,而是 0. 713、0. 777、0. 640, 说明
它们之间由于生态环境的不同存在着一定遗传分
化,或者是变种,或者是形态上高度相似而遗传上高
度隔离的种存在;同样华北驼绒藜和科尔沁生态型
华北驼绒藜也存在这样的问题, 需要进一步从其他
方面进行综合研究考证。心叶驼绒藜种与驼绒藜种、
华北驼绒藜种的遗传距离大于原产地美国的北美驼
绒藜种,这表明心叶驼绒藜种与国内的两个种虽然
地理距离小, 但基因流小,种间存在着较大的遗传距
离。驼绒藜种的 3份材料和华北驼绒藜种的 2份材
料聚成一个大类群, 也有可能两个种之间存在着一
定的基因流, 导致种间的遗传距离较小,需要进一步
测定基因流加以验证。
3. 2　RAPD实验方法可靠性分析
RAPD 是利用一系列随机引物对整个基因组
DNA 进行多态性检测,检测区域可以覆盖整个基因
组,可以检测出不同基因组间的微小差异, 每一个引
物只能检测基因组的有限区域, 当所用引物扩增条
带数达到 50 条以上就可将所检测的种(品种)分
开[ 11 , 12]。
另外, 用基因池代替每份材料内的所有个体进
行 RAPD分析, 容易使实验结果与真实情况出现误
差,克服这个问题主要是 RAPD 条带的重复性和条
带统计的标准统一 [ 11]。对于遗传背景差异较大的野
生材料,用基因池的方法得不到群体内的遗传信息,
将掩盖群体内的遗传多样性,不利于较全面的分析,
这一点需要以后继续深入研究。在本项实验研究中
发现,实验所选用的扩增引物具有稳定的重复性,用
筛选的引物S64特异的谱带类型可以鉴定 7份驼绒
藜材料,但尚未发现各个材料特有的标记性谱带, 这
尚需要大量的引物筛选工作。
4　结论
4. 1　引物 S64可以用来区别鉴定 7份驼绒藜材料。
4. 2　本实验的聚类结果基本符合种内和种间的遗
传距离关系,将宁夏型驼绒藜和荒漠型驼绒藜首先
聚类,新疆型驼绒藜和华北驼绒藜聚成一类。驼绒藜
种和华北驼绒藜种聚成一个大类群, 然后依次与北
美驼绒藜、心叶驼绒藜聚类,共形成了一个大类群和
两个独立类群。
4. 3　驼绒藜属内存在着较大的遗传差异,具有丰富
的遗传多样性。
参考文献
[ 1]　库尔班·尼扎米丁. 驼绒藜属饲用植物的初步研究[ D] .新疆
乌鲁木齐八一农学院研究生毕业论文, 2～3
[2]　杨九艳,吕进英. 驼绒藜和冷蒿营养器官发育解剖学研究[D] .
内蒙古农牧学院毕业生论文, 1988, 7, 9～11
[3 ] 　Williams J G K. DAN polym or phism amplif ied by arbit rary
primers are u seful as genet ic mark ers [ J ] . Nucleic Acids
Resear ch, 1990, 18( 22) : 6531～6535
[ 4 ]　Nei M . Analysis of gen e diversity in sub divided population s
[ J] . Proc. Nat l. Acad Sci . USA, 1973, 70: 3321～3323
[ 5]　Welsh J, Me Cls ll. Finger print ing genomes usin g PCR w ith
ar bit rary prim ers [ J] . Nucleic Acids Research, 1990, 18: ( 22)
7213～7218
[6]　府宇雷,钱吉,马玉虹,李军等. 不同尺度下野大豆种群的遗传
分化[ J] ,生态学报, 2002, 22( 2) : 176～18
[ 7]　裴颜龙,邹喻苹. 矮牡丹与紫牡丹 RAPD 分析初报 [ J] . 植物
分类学报, 1995, 33( 4) : 350～356
[ 8]　陈亮,王平盛,山口聪. 应用 RAPD 分子标记鉴定野生茶树种
质资源研究[ J] . 中国农业科学, 2002, 35: ( 10) 1168～1191
[ 9]　严华军, 吴乃虎. DNA 分子标记技术及其在植物遗传多样性
研究中的应用[ J] . 生命科学, 1996, 8( 3) : 32～36
[10] 王中仁,植物等位酶分析[ M ] ,北京:科学出版社, 1998, 37～69
[11] 汪小全,邹喻苹,张大明,张志宪等. RAPD 应用于遗传多样性
和系统学研究中的问题 [ J] . 植物学报, 1996, 38 ( 12) : 954～
962
[12] 聂以春,左开井,张献龙,等. RAPD 标记在棉属种间杂种后代
检测中的应用[ J] . 中国农业科学, 2000, 33( 5) : 25～29
158 草　地　学　报 第 11卷