全 文 ：第 15 卷 第 5 期
Vol. 15 No. 5
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2007 年 9 月
Sep. 2007
文章编号: 1007-0435( 2007) 05-0437-05
苜蓿属种质资源遗传多样性 RAPD分析
王 赫1, 2, 3 , 刘 利1, 周道玮1*
( 1.东北师范大学草地科学研究所 植被生态教育部重点实验室, 长春 130024;
2.中国科学院沈阳应用生态研究所, 沈阳 1100163; 3. 中国科学院研究生院, 北京 100049)
摘要 : 本文用 RAPD标记分析 10 份苜蓿属(Medicago L . )种质的遗传多样性和亲缘关系, 为苜蓿优秀种质资源开
发保护和杂交育种提供基础信息。结果表明: 33个引物在这 10 份材料间共扩增出 353 条带, 其中 263 条带为多态
性带,多态位点百分率为 74. 5% , 各引物扩增的条带数为 5~ 17条不等;遗传距离范围为: 0. 488~ 0. 686, 平均值 0.
592。聚类分析结果表明: 10 份材料大体划分为 3 类:草原 1 号、草原 3 号、美国苜蓿王和达菲成为第 1 类; 雅酷、呼
盟、蒙古和锡盟是第 2 类; 秋柳独自成为 1 类。
关键词: 苜蓿; 遗传多样性; RAPD分析
中图分类号: S812; Q943 文献标识码: A
RAPD Analysis of Genetic Diversity of Different Medicago L. Germplasms
WANG He1, 2, 3 , LIU Li1 , ZHOU Dao-w ei1*
( 1. Key Laboratory of Vegetat ion Ecology of M inis t ry of Edu cat ion, Inst itute of Grassland Science, N orth east Norm al University,
Changchun, Jilin Province 130024, China;
2. Inst itute of Applied Ecology, Chinese Academ y of S cien ces , S henyang, Liaoning Province 110016, Chin a;
3. Gradu ate School, C hinese Academy of S cien ces , Beijing 100049, China)
Abstract: The genet ic diver sity and relationships of the 10 dif ferent M edicago L. germplasms w ere ana-
lyzed using Random Amplif ied Polymorphic DNA ( RAPD) markers in order to provide essent ial informa-
t ion for further exploitation and hybridizat ion. RA PD analy sis demonst rated that 33 r andom primers pro-
duced 353 loci among which 263 w er e polymorphic loci, the per centage of po lymo rphic loci w as 74. 5%,
and each primer pr oduced 5~ 17 belts. Genetic similarity changed from 0. 488 to 0. 686, averaged 0. 592.
According to clustering analy sis, w e classif ied the 10 materials into thr ee groups: CaoYuan Ⅰ, CaoYuan
Ⅲ, Alfaking, and Daviluya w ere the f irst g roup, L . Yakuskayayellow , H uM eng, M engGu and XiM eng
the second group, and Culuskaya the thir d group.
Key words: Alfalfa; Genet ic diversity ; RAPD analy sis
豆科 ( Leguminosae)苜蓿属( M edicago L. )植
物在全世界约有 100余种,广泛分布于全球各地, 欧
洲、亚洲和非洲较多, 大多是野生草本植物, 多为重
要的饲料植物 [ 1]。我国苜蓿属植物种质资源丰富,
据《中国苜蓿》( 1995)记载我国有苜蓿属植物 12种、
3变种、6变型, 多分布于长江以北的广大地区,西起
新疆,东到江苏北部的 l4 个省市自冶区均有分布,
主要产在黄河流域的华北、西北地区。在苜蓿属中,
紫花苜蓿 (M . sat iv a L. )、黄花苜蓿( M . f alcata
L. )和胶质苜蓿(M. glutionsa)均能杂交产生紫花、
黄花苜蓿复合体, 异花授粉和互交可孕产生大量的
遗传变异,因此利用有利的遗传变异进行品种改良
和新品种的选育具有重要的实际意义 [ 2]。紫花苜蓿
在苜蓿属中栽培最为广泛, 因其具有产草量高、富含
蛋白质、适口性好等特点而被称为/牧草之王0。但
其抗寒性较差, 在北纬44b以北地区的生长状况较差
收稿日期: 2007-06-04;修回日期: 2007- 07-20
基金项目:国家重点基础研究发展计划( G2000018602)
作者简介:王赫( 1980- ) ,女,汉族,辽宁锦州人,博士研究生, 研究方向为牧草种质资源, E-mail: H e. w angw orld@ yahoo. com. cn; * 通讯
作者 Author for cor resp ond ence, E- mai l: z houdw@ nenu . edu. cn
草 地 学 报 第 15卷
或难以越冬[ 1]。黄花苜蓿虽然产量略低于紫花苜
蓿,但抗逆性较强[ 3~ 5] , 可在干旱、寒冷等自然条件
比较恶劣的地区生长,是一种优良的牧草种质资源,
是苜蓿育种最重要的抗逆基因源。
随机扩增多态 DNA ( RAPD)是在 PCR技术基
础上发展起来的 DNA 多态性检验技术,以基因组
DNA 为模板,人工合成的 10 bp的寡聚核苷酸作为
随机引物, 在 94 e 左右变性后, 低温退火, DNA 聚
合酶的作用下对基因组特定的 DNA 区域进行反复
扩增,扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段
的差异。RAPD技术可以在对物种无任何分子生物
学研究基础的情况下,对其 DNA 多态性进行分析,
反应所需模板量少,反应灵敏,方便快捷, 因而近些
年来受到广泛重视和应用 [ 6~ 8]。
我国学者在苜蓿遗传资源研究方面做了许多工
作[ 9~ 14] , 但研究工作主要集中在引种、栽培、区划及
少量品种选育等方面, 对苜蓿遗传多样性及育种基
础研究比较薄弱,尤其利用国外黄花苜蓿种质资源
进行杂交育种还鲜有报道, 国内优质、高产、多抗的
优良苜蓿品种比较缺乏, 目前我国育成新品种 17
个,而美国 1993- 1994年发布的苜蓿品种就有 221
个,可满足不同气候及栽培条件对苜蓿品种的要求。
因此,本研究应用 RAPD 标记对 6 份黄花苜蓿材
料, 2个紫花苜蓿品种和 2个杂花苜蓿品种进行遗
传多样性分析,以期对苜蓿属植物的亲缘关系有所
了解,为黄花苜蓿优秀种质资源进一步开发和利用
提供一定的依据和信息。特别是俄罗斯的 3个黄花
苜蓿品种,由于其生境处于高纬度、高寒地区,研究
其遗传多样性,有针对性的培育优质、高产、抗逆性
强的苜蓿新品种具有重要意义。
1 材料与方法
1. 1 实验材料
收集国内外苜蓿属 10份材料,其中 6份黄花苜
蓿, 2份紫花苜蓿和 2份杂花苜蓿品种(表 1)。
在吉林省长岭种马场田间建植试验小区。2004
年秋季最后一次刈割后从再生枝条上摘取健康、幼
嫩的叶片置- 20 e 冰箱短期保存, 用于提取 DNA。
每份材料各取 10个单株,混合。
表 1 实验材料
Table 1 Testing mater ials
编号 No. 实验材料 M aterial s 来源 S ou rces
1 达菲 Daviluya ( M. f alcata) 俄罗斯草地研究所
Russ ian Meadow Research Ins ti tu te
品种 Cu lt ivar
2 雅酷 L. Yaku skayayellow ( M. f alcata) 俄罗斯农业研究所
Russ ian Agriculture Research Inst itute
品种 Cu lt ivar
3 秋柳 Culuskaya ( M. f alcata) 俄罗斯农业研究所
Russ ian Agriculture Research Inst itute
品种 Cu lt ivar
4 蒙古 Menggu ( M. f alcata) 蒙古国克不多市
H ovd, M on golia
野生种 Wild
5 锡盟 Xim eng ( M. f alcata) 内蒙古锡林郭勒盟
Xilingu ole Gras sland, Inn er Mongolia
野生种 Wild
6 呼盟 Humeng ( M. f alcata) 内蒙古呼伦贝尔盟
H ulu nbeier Gras sland, Inner Mongolia
野生种 Wild
7 草原 1号 Caoyuan No.Ⅰ ( M. var ia) 内蒙古农牧学院
Inn er M ongolia College of Agricu lture and Animal H usbandry
品种 Cu lt ivar
8 草原 3号 Caoyu an No.Ⅲ ( M. var ia) 内蒙古农牧学院
Inn er M ongolia College of Agricu lture and Animal H usbandry
品种 Cu lt ivar
9 公农 1号 Gongn on g No.Ⅰ ( M. sat i va) 吉林省农科院
J ilin Academy of Agricultural S ciences
品种 Cu lt ivar
10 美国苜蓿王 Alfaking ( M. sat i va) 美国引进
From Un ited S tates
品种 Cu lt ivar
1. 2 实验方法
1. 2. 1 总 DNA的提取 每个样品选取 8~ 9片单
叶于液氮中研磨成粉, 采用 CT AB 提取苜蓿总
DNA [ 15]。
1. 2. 2 DNA 的检测 将提取的 DNA 样品, 用紫
外分光光度计和电泳-EB 染色的荧光强度, 测定浓
度,用已知的 KDNA作对照,确定 DNA的含量和分
子量。
1. 2. 3 引物筛选 从上海生物工程公司购买一套
438
第 5期 王赫等:苜蓿属种质资源遗传多样性 RAPD分析
引物( 60条) ,经过扩增筛选,选出 33条扩增产物清
晰、稳定的引物, 序列见表 2。在筛选引物的扩增
中,增设对照样品(不加模板 DNA 的样品) , 结果表
明,对照样品均无扩增产物出现。
表 2 筛选的 33 个有扩增产物的引物
T able 2 33 primer s used in this study
引物
Prim ers
序列( 5.-3. )
Sequ ence
引物
Prim ers
序列( 5.-3. )
Sequence
引物
Prim ers
序列( 5.- 3. )
S equence
R2 GAGGAT CCCT R16 CCAT T CCCCA R42 ACCTCGGCAC
R3 GGGCGCCT AG R17 GT CGTT CCT G R44 T CACCAGCCA
R6 GGCT GCGGT A R18 GGGCCACTCA R45 GGCTGGTT CC
R7 GGT CAGGGCT R19 GGCAGGCT GT R47 CT GCGCT GGA
R8 CTCAT ACGCG R25 GTGAGGCGT C R49 GAGGTCCACA
R10 CCCGCAGAGT R26 CACT GGCCCA RA68 CACCT TCGCC
R11 CCATCGT ACC R30 CT CACCGT CC RA71 GAACCACCCC
R12 CCCAAGGT CC R33 T CCGATGCT G D4 CGT TGGCCCG
R13 CCAGAT GCAC R35 CT GGCGAACT D9 T GGCCCCGGT
R14 TGCGGGT CCT R37 ACGGACGT CA D10 AGCCGGCCTT
R15 CCCGTAGCAC R40 CCT GCTCAT C A15 T T CCGA ACCC
1. 2. 4 扩增条件 扩增反应在美国 MJ 公司热循
环仪上进行。反应体积为 25 LL( 1 @ PCR Buf fer; 2
mmol/ L MgCl2 ; dNTP 各 100 Lmol/ L; 0. 5 mmol/ L
引物; 1单位 T aq酶(以上试剂均由上海生工提供)
及 12. 5 ng 左右的模板 DNA)。
扩增条件如下:
1. 2. 5 扩增产物的电泳检测 DNA 扩增产物在含
有溴化乙锭的 1. 5%的琼脂糖凝胶中稳压分离, 用
0. 5 @ TBE 电泳缓冲液, 并用 Lambda DNA/ EcoR
Ⅰ+ H indⅢ为标准分子量 Mar ker, 电压 100 V, 电
泳 2~ 3 h后,用自动凝胶扫描系统检测。
1. 2. 6 遗传距离的计算和聚类分析 对电泳带谱
进行统计时,把某一位点出现带者记为 1,未出现带
者记为 0,根据 1出现的次数计算各条带出现的频
率。根据各单体出现的频率, 利用 NT SYSpc 2. 0
统计软件计算各份材料间的相似性系数, 并生成系
统树进行分析[ 18] 。
2 结果与分析
33个引物在这 10 份材料间共扩增出 353 条
带,其中 263条带为多态性带, 多态位点百分率为
74. 5%,表明各份材料间已产生了遗传分化, 具有较
高的遗传变异水平。各引物扩增的条带数为 5~ 17
条不等(图 1)。
多态位点百分数是反映遗传多样性的重要指标
之一,由表 3可知,各实验材料多态位点比率是: 秋柳
> 蒙古> 雅酷> 达菲> 草原 1号> 呼盟> 草原 3号
> 美国苜蓿王> 锡盟> 公农 1号。其中秋柳遗传多
态性最高,为 57. 8% ,公农 1号最低,仅为 28. 6%。
图 1 引物 R19、RA68 的 RAPD扩增产物琼脂糖
凝胶电泳图谱
Fig. 1 T he amplified results using pr imer R19 and RA68
注:泳道从左到右依次为 M1: 草原 1 号; M2: 草原 3 号; M 3:
公农 1号; M4: 美国苜蓿王; M5: 达菲; M6: 秋柳; M7: 雅酷;
M8: 呼盟; M9: 蒙古; M10: 锡盟
Note: Channels f rom lef t t o right are: M 1: Caoyu an No. Ⅰ;
M2: Caoyuan No.Ⅲ; M 3: Gongn ong No. Ⅰ; M 4: Alfaking; M 5:
Daviluya; M6: C uluskaya; M 7: L. Yakuskayayellow ; M8: Hu-
meng; M9: Menggu; M10: Ximeng
439
草 地 学 报 第 15卷
表 3 各实验材料多态位点比较
T able 3 Po lymorphic loci compar isons o f the test ing mater ials
实验材料
M aterial s
总位点数
No. of loci
多态位点数
No. of polym orphic loci
多态位点百分率%
Percent of polymorphic loci
草原 1号 Caoyuan No.Ⅰ 353 142 40. 2
草原 3号 Caoyuan No. Ⅲ 353 132 37. 4
公农 1号 Gon gnong No.Ⅰ 353 101 28. 6
美国苜蓿王 Alfak ing 353 113 32. 0
达菲 Daviluya 353 142 40. 2
秋柳 Culu skaya 353 204 57. 8
雅酷 Yakuskayayellow 353 174 49. 3
呼盟 H umeng 353 138 39. 1
蒙古 Menggu 353 175 49. 5
锡盟 XiMeng 353 112 31. 7
表 4 10 种苜蓿属植物的遗传距离(RAPD标记)
T able 4 Genetic distances among the 10 Medicago L. materials based on RAPD markers
实验材料
Material s
M 1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10
M1 0. 000
M2 0. 488 0. 000
M3 0. 524 0. 513 0. 000
M4 0. 521 0. 538 0. 496 0. 000
M5 0. 566 0. 545 0. 563 0. 561 0. 000
M6 0. 671 0. 684 0. 686 0. 684 0. 621 0. 000
M7 0. 583 0. 573 0. 632 0. 578 0. 609 0. 605 0. 000
M8 0. 600 0. 614 0. 588 0. 609 0. 597 0. 621 0. 571 0. 000
M9 0. 618 0. 628 0. 639 0. 614 0. 593 0. 643 0. 571 0. 588 0. 000
M10 0. 592 0. 616 0. 585 0. 553 0. 595 0. 641 0. 578 0. 581 0. 566 0. 000
注: M1: 草原 1号; M2: 草原 3号; M3: 公农 1号; M4: 美国苜蓿王; M5: 达菲; M6: 秋柳; M7: 雅酷; M8: 呼盟; M9: 蒙古; M10: 锡盟
Note: M1: Caoyu an No.Ⅰ; M2: Caoyuan No. Ⅲ; M3: Gon gn ong No. Ⅰ; M4: Alfaking; M 5: Daviluya; M6: C ulusk aya; M7: L.
Yakuskayayellow ; M8: H umeng; M 9: Menggu; M10: Ximeng
图 2 10 份苜蓿材料的 UPGMA聚类分析
Fig . 2 Dendrog ram among 10 Medicago L. mater ials
using UPGMA cluster analy sis
注: M1: 草原 1号; M 2: 草原 3号; M3: 公农 1 号; M4: 美国
苜蓿王; M5: 达菲; M6: 秋柳; M7: 雅酷; M8: 呼盟; M9: 蒙古;
M 10: 锡盟
Note: M1: Caoyuan No. Ⅰ; M2: Caoyu an No. Ⅲ; M3:
Gongn ong No.Ⅰ; M4: Alfaking; M5: Davilu ya; M6: Cu lusk aya; M7:
L . Yakuskayayellow ; M 8: H um eng; M9: Menggu; M10: Ximeng
由表 4 可知, 10份材料间遗传距离平均值为
0. 592,草原 1号和草原 3号遗传距离最小( 0. 488) ,
其次为公农 1号和美国苜蓿王( 0. 496) ;秋柳和公农
1号之间的遗传距离最大,为 0. 686。
聚类分析结果表明(图 2) , 10份材料大体划分
为 3个类群:草原 1 号、草原 3 号、美国苜蓿王和达
菲成为第 1组;雅酷、呼盟、蒙古和锡盟是第 2组;秋
柳独自成为 1组。第 1组内草原 1号与草原 3号遗
传相似性最高首先成为 1 类; 公农 1 号与美国苜蓿
王聚为 1类;达菲是组内唯一的黄花苜蓿。第 2组
内所有实验材料均为黄花苜蓿, 其中雅酷和呼盟遗
传相似度较高聚为 1类,蒙古和锡盟聚为 1类。
3 讨论与结论
苜蓿属植物野生种群分布广泛, 在长期的历史
演化过程中,在突变、基因交流、遗传分化、品种选育
等自然或人工选择压力下, 使得各品种(系)和地理
440
第 5期 王赫等:苜蓿属种质资源遗传多样性 RAPD分析
种群间产生了较大的遗传分化 [ 17, 18]。本研究所揭
示的多态位点百分率( 74. 5%)从 DNA 分子水平上
反映了这种遗传分化程度, 其中蕴藏的丰富基因资
源是培育新品种的遗传基础和抗逆育种工作有所突
破的关键。
黄花苜蓿与紫花苜蓿有一定的亲缘关系, 但黄
花苜蓿比紫花苜蓿品种有较高的遗传多样性 [ 19]。
俄罗斯和蒙古国材料的多态位点百分率较高, 因而
具有很大的选育新品种和改良现有品种的潜力。紫
花苜蓿品种和我国锡盟野生黄花苜蓿的多态位点百
分率较低,这说明在长期的人工选育和遗传进化过
程中紫花苜蓿品种和锡盟黄花苜蓿丢失了部分遗传
多态性。从材料间的遗传距离可知,秋柳与其他紫
花苜蓿材料,尤其是与公农 1号的遗传距离最远, 说
明二者之间杂交具有一定的遗传基础。
草原 1号杂花苜蓿是内蒙古锡林郭勒盟的野生
黄花苜蓿为母本,准格尔紫花苜蓿作父本杂交育成,
草原 3号则是从草原 1 号中选育而成, 因此二者的
亲缘关系最近。公农 1号是 1922年从美国引进的
/格林0苜蓿品种,经过在吉林公主岭 26年大面积驯
化群体作为基础材料, 连续四代选育的结果[ 20] , 在
基因来源上与美国苜蓿王相似, 本研究结果也证实
了这一点。达菲与紫花苜蓿的亲缘关系较近, 由于
它的遗传背景相关报道较少, 因此需要进一步研究。
第二组黄花苜蓿材料之间的遗传距离小, 这与
材料的地理分布有一定的相关性,地理分布较近的
品种间基因交流的机会较多, 品种的遗传组成趋
同[ 21] ; 也有一些亲缘关系与地理分布不符的现象,
可能是不同地理种群间基因交流的结果。秋柳与其
他材料的遗传距离最大, 亲缘关系较远,单独聚为一
类,这可能是育种过程中的不同选育目的造成的, 在
今后的研究中可利用其与紫花苜蓿的亲缘关系, 进
行杂交育种,选育优质的杂花苜蓿后代。
本研究采用的 RAPD标记, 揭示了基因组中随
机的基因位点的多态性,由于反应体系很小, 所以对
实验的精确程度要求很高,对各项成分浓度要求十分
严格,在试验操作中,在各模板浓度一致的前提下,各
反应成分的混合成为关键。在初步接触 RAPD技术
时,需经过反复摸索条件和确定反应体系,但随着对
该项技术不断熟练的掌握和对实验条件的严格控制,
RAPD技术能够获得较好的重复结果。
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(责任编辑 梁艳萍)
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