全 文 ：第20卷 第5期
Vol.20 No.5
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2012年 9月
Sep. 2012
柳枝稷木质素合成酶基因F5H 核心片段
的克隆与表达特性的分析
李 园,王 珊,方 程*
(中国农业大学草地研究所,北京 100193)
摘要:柳枝稷(PanicumvirgatumL.)是一种重要的木质纤维作物,但其高木质素含量严重制约了其作为能源植物
的开发和利用。以柳枝稷茎秆中的mRNA为模板,采用RT-PCR方法克隆得到控制G/S木质素单体相互转化的
关键酶基因F5H 家族的2个基因,分别命名为PvF5H1与PvF5H2,将这2个基因序列提交到GenBank,登录号
分别为JQ430747与JQ430748。DNAMAN序列分析表明,这2个基因的核酸序列相似性为93%,氨基酸序列相
似性为90%。利用NCBI在线比对功能对这2个基因的生物学信息进行分析,结果表明:该基因通过生物学方法
分析的编码蛋白质与玉米(Zeamays)的同源性最高,系统进化树分析也表明,其与玉米的亲缘关系最近。利用实
时荧光定量PCR技术研究这2个基因在机械伤害胁迫下的表达趋势,结果表明:在伤害胁迫下,PvF5H1与
PvF5H2基因都快速响应,并且在一定时间内,这种响应呈现正相关,其变化趋势一致,但是表达量及其变化相差
较大。推测它们在柳枝稷应答伤害胁迫的过程中起重要作用。
关键词:F5H 基因;柳枝稷;木质素;机械伤害胁迫;表达分析
中图分类号:Q943.2 文献标识码:A 文章编号:1007-0435(2012)05-0927-08
CloningandExpressionAnalysisofPartialFragmentsfrom
LigninBiosynthesisF5HGenesinSwitchgrass
LIYuan,WANGShan,FANGCheng*
(InstituteofGrasslandScience,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100193,China)
Abstract:Switchgrass(Panicumvirgatum L.)isanimportantlignocelulosiccrop.Highlignincontent
seriouslylimitsitsutilizationasanenergyplant.ThepartialfragmentsofF5HgenesinvolvedinG/Slig-
ninmonomerconversionwereamplifiedfromswitchgrassbarkmRNAusingRT-PCRanddesignatedas
PvF5H1andPvF5H2respectively(GenBankaccessionnumber:JQ430747andJQ430748).DNAMAN
sequenceanalysisofbothgenesindicatedthatthesimilarityofnucleicacidsequencereached93%andthe
similarityofproteinsequencereached90%.NCBIBlastonlinewasperformedtoanalyzethebiologicalin-
formationofbothPvF5H1andPvF5H2.Sequenceanalyzedthroughbiologicalmethodsshowedthaten-
codedpolypeptideswerehighlyhomologoustoF5HproteinsofZeamays.Phylogenetictreeanalysisalso
demonstratedthatbothgeneswererelatedtotheF5HgenefromZeamays.Real-timequantitativePCR
(qPCR)wasperformedtoinvestigatetheexpressionprofilesofbothPvF5H1andPvF5H2underwound
stress.TheresultsofqPCRanalysisrevealedthatbothPvF5H1andPvF5H2showedfast-responseand
up-regulatedexpressionunderwoundstress.PvF5H1andPvF5H2haddifferentexpressionlevelwith
similarchangingtendency.
Keywords:F5Hgene;PanicumvirgatumL.;Lignin;Woundresponse;Expressionanalysis
柳枝稷(Panicumvirgatum L.)属于禾本科
(Gramineae)黍属(Panicum),是起源于北美洛基山
脉以东、北纬55°以南大草原的暖季型高秆多年生
草本C4 植物,通常被用于放牧、水土保持以及生态
建设等[1-3]。柳枝稷光合效率高,适应性强,具有较
高的产量潜力和较强的耐旱耐脊能力,对环境友好,
收稿日期:2012-02-27;修回日期:2012-04-12
基金项目:边际土地能源草分子育种与新种质创制(2012AA101801);耐盐碱能源草筛选与新品种培育项目(2009BADA7B04);草业科学
北京市重点实验室共建项目资助
作者简介:李园(1987-),女,河北邢台人,硕士研究生,研究方向为牧草分子技术,E-mail:liyuan2010kaoyan@163.com;*通信作者 Author
forcorrespondence,E-mail:fangcheng@cau.edu.cn
草 地 学 报 第20卷
能够用于生产生物能源。近年来,国际上将其作为
一种新型能源作物深入研究[4-5]。我国可再生能源
发展目标宏大,宜能边际土地资源丰富,国内许多相
关专家对其也逐渐开始重视,这使得柳枝稷在我国
有巨大的发展潜力[5]。柳枝稷的生物质主要成分是
木质纤维素,包括纤维素、半纤维素和木质素3种,
纤维素和半纤维素经过发酵可转化为乙醇,而木质
素不能被水解,且在纤维素周围形成保护层,影响纤
维素的水解从而影响工业乙醇的生产[6]。因此,如
何有效降低木质素的含量、改变木质素的组成、修饰
木质素的生物合成,是提高柳枝稷作为能源植物的
应用价值丞待解决的重要难题。
木质素是植物体中含量仅次于纤维素的大分子
有机物质,具有重要的生物学功能,如果木质素的含
量过低,会造成维管系统紊乱和激素运输的变化,最
终影响植物本身的生长发育[7]。因此,在一定范围
内降低木质素单体含量并同时重视木质素的组分改
变更符合实际生产的需要[8]。柳枝稷的木质素是由
对-羟基苯基木质素(H 木质素)、愈创木基木质素
(G木质素)、紫丁香木基木质素(S木质素)3种单
体组成。其中,G木质素只有一个甲氧基集团,C-5
位置与其他单体形成较为稳定的C-C键,在工业利
用中较难除去;S木质素有2个甲氧基集团,无游离
的C-5,不能形成C-C连接而结构疏松,在工业利用
中易于除去[9]。木质素生物合成关键酶基因的调控
研究表明,F5H(ferulate-5-hydroxylase)基因对S
木质素合成起限速的作用,过量表达能在真正意义
上增加S木质素含量,在总木质素含量不变的情况
下,使G单体向S单体转化[10]。
Meyer等[11]利用 T-DNA 技术首次从拟南芥
(Arabidopsisthaliana)中克隆出F5H 基因,并将
其定义为一种细胞色素 P450 单氧化酶基因。
Franke等[12]在烟草(Nicotianatabacum)和杨树
(Populustomentosa)上分别过表达拟南芥F5H 基
因,Sibout等[13]在拟南芥中过表达杨树F5H 基因,
转基因植株的 S木质素含量均增加了。Sibout
等[13]还在拟南芥突变体fah1-2中引入杨树F5H
基因,使突变体fah1-2的表型得到了恢复。因此,
异位过表达F5H 基因对于改造植物木质素组分很
有意义。在胁迫应答方面,类苯基丙烷途径在植物
的伤害恢复和抗病过程中起到了很大的作用,在受
到伤害和病菌侵染时,诱导木质化过程是植物重要
的应答反应[14-15]。木质素合成早期的一些基因,如
PAL[16]、C4H[17]、CHS[18]等被鉴定出能够应答于
伤害和病原菌侵染等胁迫诱导。各种环境胁迫下,
F5H 表达情况方面的研究鲜见报道。仅有研究表
明,喜树 (Camptothecaacuminata)F5H1基因在机
械损伤或是乙烯、ABA、双氧水等的胁迫下,会在其
叶中转录增强,而水杨酸和DPI则会抑制损伤诱导
F5H1基因的表达[14]。迄今为止,已从杨树[13]、喜
树[19]、苜蓿(Medicagosativa)、桑树(Morusalba)、
芸薹(Brassicacampestris)、水稻(Oryzasativa)[20]
等中克隆出了F5H 基因,但尚未见从柳枝稷中克
隆出F5H 基因的相关报道。本研究从低地型柳枝
稷中克隆了F5H 家族的2个核心片段,对其进行了
生物信息学的分析,并分析了这2个基因在机械伤
害胁迫下的表达趋势,以期为深入研究其功能和胁
迫应答机制提供理论基础,并为柳枝稷的木质素改
良提供依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料及处理
低地型柳枝稷种子来源于美国,于中国农业大
学种质资源实验基地上庄试验田种植。将柳枝稷返
青前的茬分栽至温室,取其长出的幼苗作为供试材
料。柳枝稷的幼苗在温室中培育一段时间后,选取
大小、年龄相似的叶片,用灭菌的打孔器作机械伤害
处理(每个叶片一半做处理,一半作对照),分别在处
理0,1,2,4,6,8,12和24h时取样,将剪下的叶片
迅速置于液氮中,-80℃保存备用。
1.2 试剂
总RNA提取 Trizol试剂盒、逆转录试剂盒、
TaqDNA聚合酶(2×taqmix)、DNA快速纯化/回
收试剂盒、pGEM-TEasyVector等均购自北京华
越洋生物公司;DNA分子 marker购自北京欣经科
生物公司。
1.3 PvF5H1与PvF5H2基因的克隆
1.3.1 总RNA的提取与cDNA第一链的合成
以温室培养的柳枝稷茎为材料,用总RNA提取Tr-
izol试剂盒提取总RNA,并纯化。RNA的质量用
1%的琼脂糖凝胶电泳检测,RNA的浓度和纯度用
紫外分光光度计测定。按照逆转录试剂盒的操作说
明书合成第一链cDNA,-20℃储存备用。
1.3.2 PCR引物的设计 用 DNAMAN软件对
NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)已经发表
829
第5期 李园等:柳枝稷木质素合成酶基因F5H 核心片段的克隆与表达特性的分析
的Arabidopsisthaliana(AF068574),Populustri-
chocarpa (AJ010324),Broussonetia papyrifera
(AY850934),Camptothecaacuminata (AY621153),
Lycopersiconesculentum (AF150881),Oryzasativa
(OSF5HL,AB207252),Oryzasativa (OSF5HL2,
AB207253)的F5H 基因家族的基因进行同源比对,
找出其保守区,利用软件PrimerPremier5.0设计
引物,由上海博尚生物技术有限公司合成。引物上
下游的序列、退火温度和目的片段长度等信息如表
1所示。
1.3.3 PvF5H1与PvF5H2基因的克隆 先通过
预试验对PCR反应体系及扩增条件进行优化,并最
终确定反应的条件(表1)。以反转录得到的柳枝稷
cDNA的第一条链为模板进行PCR扩增。PCR扩
增产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。
参照试剂盒说明书,对PCR产物进行切胶回收
并纯化,回收的产物连接到pGEM-TEasyVector,
转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α中,然后在LB/
X-gal平板上进行蓝白斑筛选,挑取的阳性克隆经
PCR鉴定后,送至上海英骏生物公司测序。
表1 RT-PCR中所用引物的一些信息
Table1 PrimersusedinRT-PCR
基因名称
Genesname
引物序列(5′-3′)
Sequencesoftheprimerpair(5′-3′)
Tm/℃
反应体系/μL
Reactionsystem
PCR程序
PCRprogram
长度/bp
Fragmentsize
PvF5H1 F CCGCTTGCTACTACCGTACCTC
56.9 PCR Mix:12.5;F/R
primer:0.25;cDNA:
1;ddH2O:11
94℃ 4min;94℃ 30s;
56.9/59.830s;72℃ 1
min35cycle;72℃5min
803
R CGACATGCTCGCCTTCCTC
PvF5H2 F CGACATGCTCGCCTACCTC
59.8 786
R CCATCCGCTGCTACCTTGATA
1.4 序列分析
应用DNAMAN软件对所克隆的序列进行同
源比对,并对蛋白质的氨基酸进行预测;运用NCBI
在线分析软件BLAST,对预测的氨基酸序列进行
进一步同源比对;应用ClustalX2.0和 MEGA5.0
软件对来自不同植物的F5H 基因进行同源性多重
比对,并用Neighbor-Joining法构建系统进化树。
1.5 实时荧光定量PCR分析
根据所克隆的PvF5H1与PvF5H2的序列,
参照荧光定量 PCR 引物的原则,设计荧光定量
PCR引物。PvF5H1与PvF5H2基因的同源性很
高,因此,设计引物时取同源性相对较低的部分序
列,然后对设计的引物进行筛选。若扩增出同源序
列,其引物的溶解曲线会出现多峰,由于最终筛得的
2对引物的溶解曲线峰值不同,且每对引物均只有
一个峰(图1)。因此,这2对引物可分别应用于
PvF5H1与PvF5H2基因的荧光定量PCR试验。
图1 柳枝稷PvF5H1(左)与PvF5H2(右)基因荧光定量PCR引物的溶解曲线
Fig.1 Meltcurvesofreal-timefluorescencequantitativePCRwithPvF5H1andPvF5H2primers
此外,由于在NCBI上找不到柳枝稷的内参基
因,因此需要先将其克隆出来。根据 NCBI登陆的
β-Actin的序列,通过同源克隆的方法,克隆出柳枝
稷的组成型表达β-Actin 基因的核心序列;再根据
其序列,设计其荧光定量PCR的引物,以此基因作
为内部参照。利用StepOnePLUS 实时荧光定量
929
草 地 学 报 第20卷
PCR系统,以柳枝稷机械伤害后各时间取样点的
cDNA为模板,进行real-timePCR分析。荧光定量
PCR中的PvF5H1和PvF5H2与β-Actin 基因的
引物序列,反应的体系,反应的程序等信息如表2所
示。采用2-ΔΔCt法分析数据,并用Prizm4统计分析
软件进行数据统计分析,确定基因相对表达量的变
化情况。试验共设3次生物学重复,每个取样点设
3次上机重复。
表2 实时荧光定量PCR中所用引物的一些信息
Table2 Primersusedinreal-timefluorescencequantitativePCR
基因名称
Genesname
引物序列(5′-3′)
Sequencesoftheprimerpair(5′-3′)
反应体系
Reactionsystem/μL
PCR程序
PCRprogram
长度
Size/bp
PvF5H1
F TTCCTGCGGTGCGTCGTCAA
qPCRMix:10;Forward/
Reverseprimer:0.4;cD-
NA:1;ddH2O:8.2
95℃10min,95℃30s45
cycles,60℃30s;95℃15
s,60℃15s,95℃15s
79
R AGTCCTCGGCGGTCTCGT
PvF5H2
F ATCATCTCCGCCATCGCCCACT
118
R TGCAGAACACGCTCCGCCTCA
β-Actin
F AACTGGGACGACATGGAGAAGATTTGG
117
R CACGGTTAGCTTTGGGATTAAGGG
2 结果与分析
2.1 PvF5H1与PvF5H2基因的克隆
从柳枝稷茎中提取总RNA,以其反转录合成的
柳枝稷cDNA为模板,用设计的引物进行RT-PCR扩
增,得到2个长度分别为803bp与786bp的扩增片
段,大小与预期设计的一致(图2)。切胶回收纯化后
与T载体连接,蓝白斑筛选测序,测序结果输入NCBI
中进行Blast比对,结果表明其确实是柳枝稷F5H 基
因家族中的基因,将其命名为PvF5H1与PvF5H2。
将这2个序列上传GenBank,获得的登录号分别为:
JQ430747与JQ430748。
图2 柳枝稷PvF5H1与PvF5H2基因片段扩增结果
Fig.2 PCRproductsofPvF5H1andPvF5H2
注:1:PvF5H1PCR产物;2:PvF5H2PCR产物;M:分子量标准 DL2000;箭头示PCR产物条带
Note:1:PCRproductsofPvF5H1;2:PCRproductsofPvF5H2;M:molecularmarkerDL2000;arrowindicatesPCRband
2.2 PvF5H1与PvF5H2基因核心片段的序列
对比
经过DNAMAN序列比对(图3和图4),发现
基因PvF5H1与PvF5H2的核酸序列相似性为
93%,蛋白质序列相似性为90%;在786个碱基中,
有44个不连续位点存在碱基差异,在260个氨基酸
中,有23个不连续位点的氨基酸存在差异。研究表
明,只有同源性低于40%的基因才不属于一个家
族[21-22],因此,推测这2个片段属于柳枝稷F5H 基
因家族中2个不同的成员基因。
2.3 编码蛋白质经NCBI蛋白质同源性比对的结果
将克隆的片段在NCBI上在线Blastx序列比对
(表3),每一个相似性高的物种选取一个登录号作
为代表,按照相似性的百分比降序排列绘制表格。
由于Blast结果的E-value都很小,接近零,因此,结
果都比较可靠。由分析结果可知,PvF5H1 与
PvF5H2基因的核心片段与其他已报道物种的蛋
白质序列同源性都较高,虽然二者在相似性上有一
定的差异,但差异只有1~2个百分比,基本一致。
这2个基因与单子叶植物中的玉米(Zeamays)、高
粱(Sorghumbicolor)、水稻和短柄草(Brachypodi-
umdistachyon)等的基因同源性在80%以上,与玉
米的基因同源性最高,二者均达到90%以上;与双
子叶草本或灌木植物的百金花(Centauriumeryth-
raea)和葡萄(Vitisvinifera)等的基因同源性达到
039
第5期 李园等:柳枝稷木质素合成酶基因F5H 核心片段的克隆与表达特性的分析
70%以上;与双子叶乔木的杨树、构树(Broussonetia
papyrifera)和桉树(Eucalyptusglobulus)等的基
因同源性达到60%以上。这与其他人的研究结果
类似[23],与植物的进化规律是相吻合的。
图3 柳枝稷PvF5H1与PvF5H2基因核心片段的核酸序列比对
Fig.3 AlignmentofPvF5H1andPvF5H2genekeyfragmentnucleotidesequences
图4 柳枝稷的PvF5H1与PvF5H2基因核心片段的预测氨基酸序列比对
Fig.4 AlignmentofPvF5H1andPvF5H2genekeyfragmentputativeaminoacids
2.4 系统进化树构建与分析
为了进一步研究植物F5H 基因的进化关系,
选用GenBank上已登录的9种植物的F5H 基因
作进化树分析(图5)。结果显示,本研究所克隆的
2个基因PvF5H1与PvF5H2(图中分别以Pani-
cumvirgatum-1与Panicumvirgatum-2指代)亲缘
性达到100%,进一步证实了它们同属一个基因家
族;另外分析表明,柳枝稷的PvF5H 基因与禾本
科植物中的玉米、高粱和短柄草的亲缘关系最近,
与禾本科植物中的大麦和水稻亲缘关系较近,而
与双子叶植物的关系较远,这符合柳枝稷在分类
学中的地位。
139
草 地 学 报 第20卷
表3 PvF5H1与PvF5H2基因核心片段预测蛋白质序列的NCBI数据库BLAST分析
Table3 BLASTanalysisoftheputativecodingproteinsofPvF5H1andPvF5H2genefragmentsinNCBI
登录号
AccessionNo.
同源性物种
Similarityspecies
PvF5H1 PvF5H2
E值E-value 相似性Identity/% E值E-value 相似性Identity/%
ACF84754 Zeamays 4e-143 92 8e-142 91
XP002464383 Sorghumbicolor 4e-157 86 1e-157 87
AAG13555 Oryzasativa 5e-128 85 2e-126 85
XP003571958 Brachypodiumdistachyon 3e-151 84 5e-150 84
BAJ95312 Hordeumvulgare 6e-132 77 4e-134 78
AAS92625 Centauriumerythraea 1e-113 71 2e-115 72
XP002274902 Vitisvinifera 2e-106 70 2e-117 70
XP003629360 Medicagotruncatula 2e-110 69 1e-112 71
AEO21428 Glycinemax 2e-116 68 3e-116 69
BAI47545 Eucalyptusglobulus 2e-117 67 1e-114 69
图5 用Neighbor-Joining建模的柳枝稷与其他物种F5H基因的进化树
Fig.5 MolecularphylogenetictreesbasedonthenucleotidesequencesofbotanicF5HgenesbyNeighbor-Joining
2.5 机械伤害对PvF5H1与PvF5H2基因的诱导
表达分析
用机械打孔的方法处理柳枝稷的叶片,以实
时 荧 光 定 量 PCR 的 方 法 分 析 PvF5H1 与
PvF5H2基因的表达动态(图6),研究其在非生物
胁迫中的应答机制。结果表明,在伤害胁迫下,
PvF5H1与PvF5H2基因都快速响应,其变化趋
势一致,但是表达量及其变化相差较大。PvF5H1
与PvF5H2的表达量均首先表现为下降趋势,在
处理2h后最低,然后逐渐上升,到12h达到最
高,随后下降。但是,PvF5H1在12h时表达量达
到原有水平的5.749倍;PvF5H2在12h时表达
量达到77.37倍。由此表明,这2个基因对于机
械伤害胁迫能够产生明显响应,并且在一定时间
内这种响应呈现正相关。
3 讨论
本研究首次从柳枝稷中克隆出2个F5H 基因
的核心片段PvF5H1与PvF5H2。分析其核酸和
氨基酸的多序列比对结果,发现与柳枝稷的F5H
基因同源性最高的均为禾本科的玉米、高粱、水稻等
植物的F5H 基因,而双子叶植物与其亲缘关系较
远。在禾本科内,该基因比较保守,同源性可达
80%以上。这为利用禾本科植物特别是水稻的基因
组数据库来分离柳枝稷基因提供了理论依据和技术
途径。本研究表明,该基因在不同科属之间的同源
性差异较大,这为利用该同源基因的进化来推断不
同科属进化关系提供了依据。
研究发现,伤害诱导刺激类苯基丙烷的积累通
常伴随着相关基因表达量的增加[24-25]。迄今为止,
本研究是第1次在单子叶植物中研究伤害胁迫与
F5H 基因表达的关系,结果表明,机械伤害在一定
条件下与PvF5H1和PvF5H2的表达成正相关,
这与Kim等[19]在喜树上的研究结论基本一致。但
是,在本试验中发现这2个基因均在2h时表达量
为最低,12h达到最高,在0~2h与12h以后其实
是呈现一种下降的趋势,这与Kim等[19]在喜树上
239
第5期 李园等:柳枝稷木质素合成酶基因F5H 核心片段的克隆与表达特性的分析
图6 PvF5H1与PvF5H2在机械伤害处理下的表达情况
Fig.6 ExpressionsofPvF5H1andPvF5H2inwoundtreatment
研究结果不完全吻合。这可能是因为本研究的试验
处理是在植物体上直接进行的,机械打孔伤害比较
严重,影响了叶片整体的生命力,需要一段时间的恢
复,而Kim等[19]是在离体叶片上处理的,影响相对
小一点。此外,本试验还表明,这2个基因在12h
时达到最高表达量,这可能与取样时间有一定关系。
因为本试验的取样时间为0,1,2,4,6,8,12,24h,
可能在12~24h之间的某个时间点达到最高表达
量。但结论还有待进一步证明。
目前,大部分的研究主要集中在木质素生物合
成途径中相关酶基因的分离方面,但有关其功能的
研究相对较少。F5H 基因是个多基因的家族[26],
并不是每个基因都对G/S木质素单体转化起调控
作用,Chapple等[27]通过对拟南芥突变体fah1进
行分析,发现其基因家族中只有成员F5H1才与S
木质素的合成相关,在其他植物中还没有相关研究。
因此,柳枝稷的这2个基因的功能特性还没办法确
定,需要进一步深入研究。本研究对柳枝稷的F5H
基因进行了初步的探索,为RNAi、转基因等技术培
育G/S比例低的柳枝稷新品种提供基础的参考
依据。
4 结论
本试验成功地从柳枝稷中克隆出了F5H 基因
家族的2个基因PvF5H1与PvF5H2,它们的核酸
与氨基酸序列相似性分别达到93%与90%。将这
2个基因与GenBank中已注册的植物的F5H 基因
进行 同 源 性 比 较,其 与 玉 米 的 同 源 性 最 高。
PvF5H1与PvF5H2基因受机械伤害处理后表达
量及其变化相差较大;但其变化趋势一致,都快速响
应,并且在一定时间内,这种响应呈现正相关。推测
它们在柳枝稷应答伤害胁迫的过程中起重要作用,
为今后进一步深入研究柳枝稷F5H 家族基因的功
能奠定了基础。
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草 地 学 报 第20卷
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(责任编辑 李美娟
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)
更正声明
《草地学报》2012年第20卷第4期701页中的公式(1)出现误排,特此更正。
现将:R′(λ1)=R
(λi+1)-R(λi-1)
λi+1-λi-1
更正为:R′(λi)=R
(λi+1)-R(λi-1)
λi+1-λi-1
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