全 文 ：第 16 卷 第 2 期
Vol. 16 No . 2
草地学报
ACTA AGRESTIA SINICA
2008 年 3 月
Mar . 2008
结缕草冷处理后可溶性蛋白的变化(简报)
宣继萍, 周志芳 , 刘建秀* , 程晓丽
(江苏省中国科学院植物研究所, 南京 210014)
关键词: 结缕草; 抗寒性; 冷驯化; 可溶性蛋白
中图分类号: S688. 4 文献标识码: A 文章编号: 1007-0435( 2008) 02-0208-03
Change of Soluble Proteins in Zoysia j ap onica after Cold-acclimation
XUAN J-i ping, ZHOU Zh-i fang, LIU Jian-x iu
*
, CHENG Xiao- li
( In st itute of Botany, Jiangsu Provin ce & Chin es e Acad emy of Sciences, Nan jing 210014)
Key words: Zoy sia j aponica; Low temperature to ler ance; Cold acclimation; Soluble protein
结缕草属( Zoy sia Willd. )为重要的暖季型草
坪草属之一, 很多优良特性[ 1]。对结缕草 ( Z. j a-
ponica)的抗寒性研究已有不少。Beard 等[ 2] 对 35
种暖季型草坪草的抗寒性研究表明,结缕草的抗寒
性最强。Dunn [ 3]研究表明结缕草属植物耐寒性存
在明显的种间差异, 而且与抗寒锻炼有关。李亚
等[ 4]采用改良电导法( EL)对中国 54种代表性种质
的抗寒性进行了研究。Ger loff [ 5] 证明低温下苜蓿
( Med icago sat iv a L. ) 的可溶性蛋白质增多。
Catschet 等[ 6] 指出杂交狗牙根( Cynodon. dacty lon
C. t ransv aalemsi s) 品种Midiron和T ifgr een
冷锻炼后,其根颈的 LT 50均明显降低,并且根颈中
均增加了数种冷调蛋白( COR)的合成,抗冻性强的
M idiron中 32~ 37 KD和 20~ 26 KD的冷调节蛋
白含量较抗冻性较差的T ifg reen高。Catschet
等[ 7]指出,杂交狗牙根Midir on和Tifgreen品种
冷锻炼后合成的低分子重量( LB) ( 20- 28 KD)的冷
调控蛋白中,两个品种根颈中 27 KD的基础冷调节
蛋白占主导地位, 这个冷调蛋白被命名为 COR27,
并通过蛋白测序确定为一种几丁质酶。结缕草属植
物作为最抗寒的暖季型草坪草之一,其抗寒机理至
今未见有报道。
本试验选择 2份分别代表极端抗寒性的结缕草
种源,研究其在正常生长条件下和经过一定时间低
温驯化后可溶性蛋白的合成, 为结缕草属植物抗寒
性的机理研究及抗寒分子标记提供依据。
1 材料与方法
1. 1试验材料
选择 Z125(抗寒性差, 叶片半致死温度( LT 50 )
= - 2. 2 )和 Z141(抗寒性强, 叶片 LT 50 = - 10.
4 ) 2份抗寒性的极端种源作为试验材料。
1. 2试验方法
1. 2. 1 材料培养 试验于 2006年的 8月- 12月
进行。将待试的盆栽材料在 28 / 22 (白天/晚
上)和 10 h光照条件下预培养 2个月。然后将试验
材料分成 2组,一组为对照, 培养条件同预培养; 另
一组进行低温驯化, 即将材料在 8 / 2 (白天/晚
上)和 10 h光照[ 6]条件下培养。处理后 2周和 4周
后,各取叶片、匍匐茎和地下茎, 提取其可溶性蛋白
质。试验材料具体编号见表 1。
1. 2. 2可溶性蛋白质提取 可溶性蛋白的提取,参
考 Gatschet[ 6] ,稍做修改。
分别称取叶片、匍匐茎和地下茎,用去离子水洗
净擦干后在液氮中研磨,按 1( g) : 4( mL)比例加入
冷的可溶性蛋白质提取缓冲液 ( 25 mM T ris-HCl,
pH7. 5, 0. 3 M 蔗糖, 0. 5% PVP, 1mM EDTA-Na2 ,
pH7. 5, PMSF 1 mM ),震荡均匀, 4 , 4000 r/ m 离心
15 min,取上清液,在 4 , 15000 r/ m 离心 15 min,取
上清液此即为可溶性蛋白样品。
收稿日期: 2007-10-11; 修回日期: 2007-12-17
基金项目: 国家自然基金( 30371011)、江苏省自然科学基金( BK2005073)资助
作者简介: 宣继萍(1976-) ,女,浙江东阳人,在职博士生,助理研究员,主要从事暖季型草坪草种质资源遗传多样性研究, E-mail: xuanjiping0077
@ yahoo. com. cn; * 通讯作者 Author for correspondence, E-mail: turfunit@ yahoo. com. cn
第 2期 宣继萍等: 结缕草冷处理后可溶性蛋白的变化
表 1 试验材料及其编号
Table 1 Mater ial and the code number
种源 Acces sion 器官 Organ 处理 Tr eat 编号 C ode
Z125(抗寒性差)
Z125( Poor low
temperatu re tolerance)
匍匐茎 Stolon 在 28 / 22 (白天/晚上) , 10 h光照条件下光照培养箱里培养为对照
Grow n und er 28/ 22 cycles w ith 10 h photoperiods for non-CA SS0
模拟低温驯化( 8 / 2 ,白天/晚上, 10 h光照)
Grow n und er 8/ 2 cy cles w ith 10 h photop eriods for CA SS1
同期在地里生长 Grow n in the f ield at th e same t ime SS2
叶片 Leaf 同 SS0 Same to SS0 SL0
同 SS1 Same to SS1 SL1
同 SS2 Same to SS2 SL2
地下茎 Rh izome 同 SS0 Same to SS0 SR0
同 SS1 Same to SS1 SR1
同 SS2 Same to SS2 SR2
Z141(抗寒性强)
Z141( St rong low
temperatu re tolerance)
地下茎 Rh izome 同 SS0 Same to SS0 RR0
同 SS1 Same to SS1 RR1
同 SS2 Same to SS2 RR2
匍匐茎 Stolon 同 SS0 Same to SS0 RS0
同 SS1 Same to SS1 RS1
同 SS2 Same to SS2 RS2
叶片 Leaf 同 SS0 Same to SS0 RL0
同 SS1 Same to SS1 RL1
同 SS2 Same to SS2 RL2
1. 2. 3 SDS-PAGE电泳 SDS-PAGE 凝胶电泳参
考 Laemmli[ 8] 方法, M ar ker 为大连宝生物工程有
限公司产品。
1. 2. 4染色银染步骤如下:
固定液中脱色 1 h或过夜敏化液中浸泡 0. 5 h
用纯水冲洗4次,每次 5 min银染 0. 5 h水快速
冲洗 3次 显色 2~ 10 min 中止(中止液中浸泡
10 min左右至条带清晰)。染色后用数码相机拍照。
2 结果与分析
2. 1处理 2周后可溶性蛋白变化
处理 2周后, SS0与 SS1的电泳谱带完全一致;
而 SL1与 SL0相比, 多了 1 条大约为 66 KD(如箭
头所示)的条带; SR1与 SR0相比多了 1条 44 KD
(如箭头所示)左右的条带(图 1)。
图 1 Z125 处理 2 周后可溶性蛋白变化
Fig . 1 Silver- stained proteins of Z125 SDS-PAGE
after 2 w eeks tr eat
注: M 为M ark er,下同。Note: M is marker, the s ame b elow
Z141在处理半个月后, RR1 与 RR0相比, 在
近 50 KD附近多了 1条带(如箭头所示) ,在 40 KD
附近处,少了 1条带(如箭头所示) ;叶片和匍匐茎的
可溶性蛋白合成没有发生变化(图 2)。
图 2 Z141 处理 2 周后可溶性蛋白变化
F ig. 2 Silver- stained pro teins o f Z141 SDS-PAGE
after 2 weeks treat
2. 2处理 4周后可溶性蛋白质变化
Z125处理 4 周后, SS0 与 SS1, SL0 与 SL1 的
谱带完全一致;而 SR1与 SR0相比, 多了 2条带,两
条带都为 50 KD左右(如箭头所示) (图 3)。
图 3 Z125 处理 4 周后可溶性蛋白质变化
F ig. 3 Silver- stained pro teins o f Z125 SDS-PAGE
after 4 weeks treat
Z141经过 4周处理后,其匍匐茎和地下茎都比
对照多了 2条 60 KD左右的条带(如箭头所示) ;而
叶片却比对照少 2条带,大小分别为 60 KD 左右和
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草地学报 第 16卷
20 KD左右(如箭头所示) (图 4)。
图 4 Z141 处理 4 周后可溶性蛋白变化
Fig . 4 Silver- stained proteins of Z141 SDS-PAGE
after4 weeks t reat
3 讨论与结论
王毅等[ 9]认为植物细胞蛋白的变化主要表现在可
溶性蛋白和酶类的变化以及产生抗寒蛋白。本研究表明:
3. 1处理 2周后,结缕草的地下茎对低温做出了反
应;而匍匐茎的可溶性蛋白的合成没有发生变化;
Z125的叶片在 66 KD附近多了一条带, 而 Z141的
叶片可溶性蛋白没有任何的变化(表 2)。
处理 4 周后, Z125 的地下茎比对照多了 2 个
50KD左右多肽, Z141 的地下茎也比多了 2 个 60
KD左右多肽; Z125的匍匐茎没有变化, Z141的匍
匐茎则比对照多了 2个 60 KD 左右多肽; Z125 的
叶片没有变化,而Z141的叶片的比对照的少了 2个
多肽(分别是 60 KD和 20 KD左右)。
由此可见,低温敏感类型在低温胁迫下其叶片和
地下茎可溶性蛋白成分会迅速发生变化, 相比之下,
抗寒性强的种源的地下茎和匍匐茎则要在低温驯化
较长时间( 4周)后,其可溶性蛋白合成代谢才会发生
变化, Z141在处理 4周后,与对照相比( 3个器官) ,有
6条差异带,而 Z125与对照只有 2条差异带。
3. 2不同的器官对低温的反应也不相同,冷驯化过
程中地下茎很快就对低温做出了反应, 而匍匐茎则
只有抗寒性强的材料在处理 4周后其可溶性蛋白合
成才发生变化, 叶片的变化也很小。也就是说结缕
草在低温驯化期间, 蛋白质合成发生变化的主要是
匍匐茎和地下茎, 叶片对于结缕草适应低温逆境的
贡献很小,这与结缕草的匍匐茎和地下茎是其越冬
的主要器官相一致。
3. 3研究结缕草在真实低温条件下其可溶性蛋白
变化,发现两个低温处理的同一种源的同一器官的
可溶性蛋白的合成变化并不完全一致, 如 Z125在
处理 4周后,地里的试验材料其匍匐茎比模拟低温
的材料多了 3 条带, 大小分别为 44 KD、35 KD和
29 KD左右,而地下茎却比模拟低温处理的材料少
一条约 50 KD的带,造成这样的结果的原因是在地
里的材料和在光照培养箱内模拟低温处理的材料其
温度、光照、水分等的条件不完全相同, 大田条件下
其胁迫不仅是温度胁迫, 还有其他环境因子如干旱
等胁迫因子存在, 从而影响到蛋白质的合成的不同。
3. 4结缕草在低温驯化过程中其不同器官可溶性
蛋白成分均会发生变化,而且,抗寒性强的种源其蛋
白质成分可能会发生转移( Z141 在处理 4 周后, 叶
片中少了一条60 kD左右的条带) ,使结缕草越冬器
官能忍受较强的低温胁迫。
表 2 模拟低温处理后结缕草可溶性蛋白成分的变化
Table 2 Variat ion of so luble pr oteins components in Zoy sia j ap onica after simulated low temperate tr eat ment
模拟低温处理时间
Time of simulated low
temperature t r eatm ent
Z125 Z141
叶片 Leaf 匍匐茎 Stolon 地下茎 Rhizome 叶片 Leaf 匍匐茎 Stolon 地下茎 Rhiz om e
2周 T w o w eeks + 66 KD - + 44 KD - - + 50 KD- 40 KD
4周 Four w eeks - - + 50 KD( 2) - 60 KD- 20 KD + 60 KD( 2) + 60 KD( 2)
备注:+ 和- 表示与对照相比可溶性蛋白成分增加和减少
Note:+ and - represent increm ent and deplet ion of solub le protein com pon ents comparing to n on-CA
参考文献
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(责任编辑 梁艳萍)
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