全 文 ：第 19 卷
第 2 期

Vol. 19
No. 2
草
地
学
报
ACTA AGRESTIA SINICA



2011 年
3 月

M ar.

2011
提高甘草原生质体游离产量及分裂频率的研究
刘
昕1 , 余
斌1 , 陈晓燕3, 王
清1, 2*
( 1. 甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室, 兰州
730070;
2. 甘肃农业大学生命科学技术学院, 兰州
730070; 3. 兰州大学生命科学学院, 兰州
730070)
摘要: 为探讨影响胀果甘草( Gly cy r rhiz a inf lata Batal. )原生质体游离的因素, 提高原生质体游离产量和分裂频
率,试验采用纤维素酶、果胶酶、离析酶不同浓度组合的酶解液,在 3 种酶解方式下对甘草叶片、下胚轴、愈伤组织
进行了原生质体游离。结果表明: 苗龄 11 d 的甘草叶片、下胚轴及继代 5 次的愈伤组织是原生质体游离的良好材
料,三者均在 2. 0%纤维素酶+ 0. 5%果胶酶和 2. 0%纤维素酶+ 0. 25% 离析酶+ 0. 5% 果胶酶的酶解液中原生质
体游离频率最高,其产量和活力分别为 1. 25
105~ 1. 26
105个
g- 1 , 65. 7% ~ 70. 5% ; 1. 43
105~ 1. 44
105个

g - 1 , 69. 5% ~ 72. 8% ; 1. 10
105~ 1. 16
105个
g- 1 , 61. 9% ~ 69. 4% ;纵向切割的下胚轴平均原生质体产量和
活力高于叶片和愈伤组织,分别为 1. 19
105个
g - 1 , 65. 2%。此外, 在40 r
min- 1摇床上处理7 h 的酶解混合物
中原生质体产量最高;而先静置后缓慢震荡( 40 r
min- 1 )的酶解方式可得到最佳原生质体产量和活力。将原生质
体密度调整到 1
105个
g - 1并培养于 KM8P 培养基中,能获得最高频率的原生质体分裂频率( 2. 34% )。试验获
得了较好的甘草原生质体游离及分裂体系。
关键词:甘草; 原生质体游离;原生质体产量; 原生质体活力;分裂频率
中图分类号: Q943. 1



文献标识码: A




文章编号: 1007-0435( 2011) 02-0294-05
Improving Protoplast Dissociation Yield and Division
Frequency of Glycyrrhiz ia inf lata Batal.
LIU Xin1 , YU Bing 1 , CHEN Xiao-yan3 , WANG Qing1, 2*
( 1. Gansu Key Laboratory of Crop Genet ic Im provement and Germplasm Enhan cem ent , Lanzhou, Gan su Pr ovin ce 730070, China;
2. College of Life Science and T ech nology, Gansu Agricul tural U nivers ity, Lanzhou, Gansu Province 730070, China;
3. College of Life Science, Lanzh ou U nivers ity, Lanzhou, Gan su Pr ovince 730000, China)
Abstract: T his study repor ts inf luencing factors of pr otoplast isolat ion, pro toplast y ield and division f re-
quency of Gly cy r rhiz ia inf lata Batal. . Five enzyme combinat ions w ith dif ferent concentrations of cellu-
lase, pectolase, macerozyme and three enzymoly sis methods w ere used to dissociate the protoplast of leav-
es, hypocotyl and calli from Gly cy r rhi z ia inf lata Batal. . Results show that the best materials for pro to-
plast isolat ion are leaves and hypocotyls f rom 11-day seedlings as w ell as calli subcultured f ive t imes. The
highest fr equency of protoplast iso lat ion is obtained by using either 2. 0% cellulase+ 0. 5% pectolase, o r
2% cellulase+ 0. 25% macero zyme+ 0. 5% pecto lase. Pr otoplast yield and v iability fo r each of thr ee meth-
ods are 1
25
105~ 1. 26
105 individual
g- 1 and 65. 7% ~ 70. 5%; 1. 43
105 ~ 1. 44
105 individual

g
- 1
and 69. 5% ~ 72. 8% ; 1. 10
105~ 1. 16
105 individual
g - 1 and 61. 9% ~ 69. 4% , respect iv ely . The
aver age yield and viability o f pro toplast from hypoco tyls cut longitudinally ( 1. 19
105 indiv idual
g- 1 and
65
2%) w as higher than from leaves and calli. Furthermore, the highest pro toplast yield w as obtained by
shaking ( 40 r
min- 1 ) 7h af ter enzymolysis. How ever, bo th opt imizing pr otoplast yield and viability w ere
reached af ter standing a w hile then shaking ( 40 r
min- 1 ) . T he highest rate of protoplast division
( 2. 34%) w as obtained by adjust ing the protoplast density to 1
105 individual
g- 1 then cultured in KM 8P
medium.
Key words: Licor ice ( G ly cy r r hi z ia inf late Batal. ) ; Protoplast iso lat ion; Protoplast f ield; Protoplast via-
bility; Division rate
收稿日期: 2010-12-20;修回日期: 2011- 02-24
基金项目:甘肃省自然基金项目( 0803RJZA032)资助
作者简介:刘昕( 1986- ) ,女,甘肃永靖人,硕士研究生,研究方向为生物技术育种, E-m ail: liux in121812@ 163. com; * 通讯作者 Author for
Correspondence, E-m ail : w angqing@ gsau. edu. cn
第 2期 刘昕等:提高甘草原生质体游离产量及分裂频率的研究


胀果甘草( Gly cy rr hiz ia inf late Batal. )为豆科
甘草属( Gly cy r rhiz a Linn. )多年生草本植物, 具有
极高的药用价值和生态价值。然而,甘草野生资源
日益匮乏、病害 [ 1]、药效成分的不稳定及种子市场的
混乱成为影响其产量和质量的限制因素[ 2, 3] 。因
此,对栽培甘草进行遗传改良十分重要。可是,甘草
小孢子发育过程中存在着各种败育形式, 甘草从播
种到自然开花年限较长, 限制了其常规育种, 使育种
效率大幅度降低 [ 4]。原生质体培养和体细胞融合是
细胞工程技术的重要组成部分, 己广泛应用于生物
科学的众多领域,尤其在作物品种改良和创造远源
杂种方面已取得了可喜的成果[ 5] , 而甘草原生质体
分离与培养的研究尚未见报道。本研究以甘草不同
外植体为材料进行提高原生质体游离产量的研究,
为今后通过体细胞杂交获得甘草新品系奠定基础。
1
材料与方法
1. 1
材料
甘草无菌苗的获得按照马文芳 [ 6] 的方法进行。
以种子接入培养基第 10~ 15 d的无菌苗叶片、下胚
轴作为原生质体游离的材料。甘草愈伤组织的获得
按照马文芳[ 6]的方法进行。每 15 d继代一次,以继
代 5 d后的愈伤组织作为原生质体游离的材料。
1. 2
方法
1. 2. 1
甘草原生质体的游离、纯化和培养
分别称取无菌苗下胚轴、叶片及愈伤组织 1. 0 g,
其中下胚轴以横切和纵切方式剪成小段, 叶片剪成
小块,愈伤组织取继代 5 d的表层部分,置于经过滤
灭菌、pH5. 6、渗透压为 0. 3 mo l
L - 1的 10 mL 酶
解液中。酶液组成: 纤维素酶( Ono zuka R-10)、离
析酶 ( Yakult R-10 )、果胶酶 ( Yakult Y-23 )、
0. 7 mo l
L - 1 KH 2 PO 4、10 mmo l
L - 1 CaCl2

2H 2O。采用静置( 12 h)、缓慢震荡( 40 r
min- 1 )
及先静置( 12 h)后缓慢震荡( 40 r
min- 1 ) 3种方式
对材料进行原生质体游离, 游离温度控制在 ( 28

1)
。游离结束后,利用血球计数板测定原生质体
的产量。将游离混合物于 50目不锈钢网过滤,转移
原生质体悬浮液至 10 mL 细颈离心管中,加入比酶
液高0. 1 mo l
L - 1渗透压的洗液至离心管口, 在室
温下以800 r
min- 1离心 10 m in。用吸管将漂浮在
细颈离心管上部的原生质体吸出,置于 10 mL 尖头
离心管并加入 4 mLCPW 洗液清洗 2次, 再次放入
离心机中以 1200 r
min- 1离心 10 min, 弃上清液
后获得纯化的甘草原生质体。采用荧光素双醋酸酯
( F luorescein Diacetate, FDA)法在荧光显微镜下检
测原生质体活力[ 7] 。
调整原生质体密度达 1
104个
g- 1 , 1
105
个
g- 1和 1
106个
g- 1 , 在附加 1. 0 mg
L- 1 6-
BA和 1. 5 mg
L- 1NAA 的 MS, KM 8P 培养基中
进行浅层培养。
原生质体产量 ( 1 mL 悬浮液中的原生质体个
数) = 1个大方格悬浮液( 0. 1 mm 3 ,即 0. 1
L)中的
细胞数
10
1000。
原生质体活力= 暗视野下发荧光的原生质体
数/明视野下原生质体数。
试验设置 5种酶解液组合:
1. 5%纤维素酶+
0. 25%离析酶;
2. 0%纤维素酶+ 0. 25%离析酶;

1. 5%纤维素酶+ 0. 5%果胶酶;
2. 0%纤维素酶
+ 0. 5%果胶酶;
2. 0%纤维素酶+ 0. 25%离析酶
+ 0. 5%果胶酶。缓慢震荡的摇床转数分别为 30,
40, 50, 60, 70, 80 r
min- 1。
2
结果与分析
2. 1
酶解液对甘草原生质体游离的影响
纤维素酶、果胶酶及离析酶的不同酶液组合对
甘草原生质体游离效果具有显著影响(表 1)。在离
析酶浓度为 0. 25%的酶液
和酶液
中, 随着纤维
素酶浓度的增加, 下胚轴、叶片、愈伤组织原生质体
产量和活力均有所增加,三者的平均值从酶液
的
6. 7
104个
g- 1和 48. 87%提高到酶液
的 7. 5

104个
g- 1和 58. 13%。同样, 在果胶酶浓度为
0
5%的酶液
和酶液
中, 2. 0%的纤维素酶获得
的原生质体产量和活力明显高于 1. 5% 的纤维素
酶,两者分别为 1. 26
105个
g- 1和 70. 90%, 1. 16

105个
g - 1和 65. 07%, 且优于酶液
和
,说明
果胶酶对甘草原生质体游离的影响大于离析酶。而
在酶液
中,纤维素酶、果胶酶、离析酶三者综合作
用能够有效提高原生质体产量 ( 1. 26
105个

g- 1 ) ,但其活力差于酶液
。
2. 2
不同外植体材料及生长状态对甘草原生质体
游离的影响
供试的 3种外植体均能游离出原生质体,但以
下胚轴原生质体的产量和活力最高(表 1) , 为 1. 19

105个
g - 1和 65. 2%; 叶片次之, 为 1. 02
105个
295
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g- 1和 61. 16%; 愈伤组织最差,仅为 8. 64
104个

g- 1和 58. 84%。下胚轴、叶片及愈伤组织的生长
状态对原生质体的游离频率也具有明显影响。种子
接入培养基 10~ 15 d的幼苗叶片原生质体游离结
果表明(图 1) , 11 d的叶片(子叶平展真叶初露)原
生质体产量最高为 1. 25
105个
g - 1 ,随着苗龄的
增加,叶片原生质体产量逐渐降低。
表 1
不同酶液组合对甘草原生质体游离的影响
Table 1
Effects of differ ent enzyme combination on pro toplast dissociation o f Gly cy rrhiz ia inf late Bata l.
酶液组合
Combina tions of enzyme solut ion
原生质体产量
Prot olpast y ield,
105 individual
g- 1
原生质体活力
Pro toplast viablity , %
下胚轴
Hypoco ty l
叶片
Leaf
愈伤组织
Callus
平均
Average
下胚轴
Hypocoty l
叶片
Leaf
愈伤组织
Callus
平均
A verage

1. 5%纤维素酶+ 0. 25%离析酶

1. 5%Cellulase+ 0. 25% Macero zyme 0. 85
0. 16 0. 66
0. 21 0. 49
0. 05 0. 67
0. 14dD 53. 30
4. 53 47. 6
3. 22 45. 7
4. 53 48. 87
4. 09dD

2. 0%纤维素酶+ 0. 25%离析酶

2. 0% Cellulase+ 0. 25% Macerozyme 0. 90
0. 11 0. 81
0. 13 0. 54
0. 18 0. 75
0. 14cC 62. 10
3. 20 57. 7
2. 01 54. 6
4. 88 58. 13
3. 36cC

1. 5%纤维素酶+ 0. 5% 果胶酶

1. 5% Cellulase + 0. 5% Pecto lase 1. 34
0. 09 1. 13
0. 18 1. 02
0. 25 1. 16
0. 17bB 68. 30
6. 33 64. 3
4. 85 62. 6
3. 74 65. 07
4. 97bB

2. 0%纤维素酶+ 0. 5% 果胶酶

2. 0% Cellulase + 0. 5% Pect olase 1. 44
0. 12 1. 25
0. 20 1. 1
0. 30 1. 26
0. 21aA 72. 80
4. 75 70. 5
3. 73 69. 4
7. 25 70. 90
5. 24aA

2. 0%纤维素酶+ 0. 25%离析酶+
0
5%果胶酶

2. 0% Cellulase+ 0. 25%
M acerozyme + 0. 5% Pecto lase
1. 43
0. 23 1. 26
0. 18 1. 16
0. 27 1. 28
0. 23aA 69. 50
2. 05 65. 7
4. 05 61. 9
4. 96 65. 70
3. 69bB
平均 Average 1. 19
0. 14aA 1. 02
0. 18bB 0. 86
0. 21cC 65. 20
4. 17aA 61. 16
3. 57bB 58. 84
5. 07cC


注: 大、小写字母分别表示 1%、5%的差异显著水平( P< 0. 01和 P< 0. 05)
Not e: Different capital let ters and small let ters express significant differences at 1% and 5% levels, respectively
图 1
苗龄对叶片原生质体游离的影响
F ig. 1
Effects of seedling age on leaf pro toplast iso lation
愈伤组织的生理状态对原生质体游离同样具有
显著影响,初形成的愈伤组织并不是游离原生质体
的最佳材料, 其产量仅为 5. 44
104个
g- 1 , 随着
愈伤组织继代次数的增加( 15 d 继代 1次) ,原生质
体产量呈先升高再下降的单峰曲线, 并于继代 5 次
的愈伤组织游离出的原生质体产量最高,为 1. 1

105个
g - 1 (图 2)。
下胚轴原生质体产量趋势与叶片相同, 也是以
11 d的幼苗最好, 但其切割方式明显影响产量(图
3) ;径向切割(纵切)的下胚轴原生质体产量显著高
于横向切割, 平均为 1. 44
105个
g- 1 ,而横切仅
为 1. 11
104个
g- 1。
图 2
愈伤组织继代次数对原生质体游离的影响
F ig. 2
Effects of subculture t imes on calli
pro toplast iso lation
2. 3
酶解方式对原生质体游离的影响
2. 3. 1
摇床转数对原生质体游离频率的影响
将酶解液及酶解材料置于低转数摇床有利于原
生质体的游离。在供试范围内, 随摇床转数的增加,
下胚轴、叶片和愈伤组织的原生质体产量逐渐增加,
均在 40 r
min- 1时达到最高, 分别为 1. 44
105个

g- 1 , 1. 23
105个
g- 1和 1. 13
105个
g- 1 ; 随
摇床转数的继续增加, 原生质体破碎较多致使产量
下降,以下胚轴和叶片表现最为明显,而愈伤组织原
生质体的产量所受影响不大(图 4)。
296
第 2期 刘昕等:提高甘草原生质体游离产量及分裂频率的研究
2. 3. 2
酶解时间对原生质体游离频率的影响
将材料及酶解液混合物置于 28
摇床中, 黑暗
条件下以 40 r
min- 1进行酶解。随着酶解时间的
延长,下胚轴、叶片和愈伤组织原生质体总产量逐渐
增加,并于酶解 7 h达到最大,分别为 1. 44
105 , 1. 25

105和 1. 10
105个
g- 1。随酶解时间继续延长,
部分原生质体碰撞破碎致使产量下降(图 5)。
2. 3. 3
酶解方式对原生质体游离频率的影响
供试的 3种酶解方式显著影响原生质体的游离
效果(表 2) , 先静置后缓慢震荡及缓慢震荡的酶解
方式明显优于静置处理, 其原生质体平均产量分别
为 1. 35
105和 1. 26
105个
g- 1 ,比静置处理分
别高 24. 44%和 19. 05%。下胚轴和叶片在此 2种
酶解方式下的产量也明显高于静置处理, 并以静置-
缓慢震荡处理下的产量最高( 1. 51
105个
g- 1和
1. 37
105个
g- 1 ) ;而愈伤组织在 3种酶解方式下
获得的原生质体产量差异不大。
图 5
酶解时间对原生质体游离的影响
F ig. 5
Effects of iso lation time on pro toplast iso lation
表 2
酶解方式对甘草原生质体游离的影响
Table 2
Effect s o f enzyme dissociation way on protoplast isolation o f Gly cy r rhiz ia inf late Batal.
酶解方式
E nzyme dis sociat ion w ay
原生质体产量 Protoplast yield,
105个
g- 1
下胚轴
H ypocotyl
叶片
Leaf
愈伤组织
Callu s
平均
Average
静置 S tanding 1. 01
0. 11 1. 03
0. 05 1. 01
0. 13 1. 02
0. 10b
摇床 Shak ing 1. 44
0. 05 1. 25
0. 07 1. 10
0. 21 1. 26
0. 11a
先静置后摇床 Sh aking af ter standin g 1. 51
0. 08 1. 37
0. 04 1. 16
0. 18 1. 35
0. 10a


注:小写字母代表 5%的差异显著水平( P< 0. 05)
Note: Different small letters mean signif icant dif f erences at the level of 0. 05
2. 3. 4
培养基类型及原生质体密度对分裂频率的
影响
不同类型的培养基对原生质体培养的效果不
同, KM 8P 培养基中的原生质体分裂频率明显高于
MS 培养基,为 2. 23% (图 6)。而在以 0. 5 M 蔗糖
为碳源的 KM8P 培养基中, 3 种密度的原生质体分
裂频率及分裂的早晚也不同, 1
105个
g - 1密度
下的原生质体在培养 4 d后出现第 1次分裂, 分裂
频率为 2. 34%,明显高于 1
104个
g- 1及 1
106
个
g- 1密度下的分裂频率(图 7)。
3
讨论
3. 1
试验材料对原生质体游离的影响
植株的苗龄对原生质体产量有很大影响。试验
中采用苗龄 10~ 15 d的叶片进行原生质体游离,发
现 11 d,即子叶平展、真叶初露时的叶肉原生质体产
量最高,成熟叶的原生质体产量较低, 这与周蓉[ 8] ,
陈喜文[ 9] 在花生、苎麻中的报道一致。说明幼嫩、生
长旺盛的植物组织更适合于进行原生质体的游离。
愈伤组织是原生质体游离的常用材料, 但愈伤
297
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地
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组织的继代时间和继代次数对原生质体的产量和活
力有很大影响。美味猕猴桃( A ci tinidia del iciosa
C. F. liang et A. R. Ferguson)愈伤组织继代第 4次
时,游离得到的原生质体不仅产量高,且后期培养中
破碎和解体的少 [ 10] ;早熟禾( Poa p r atensi s )午夜

号、阿尔冈金苜蓿( Medicago sat iv a)继代 10~ 12
次的愈伤组织游离出的原生质体更易分裂和形成愈
伤组织[ 11, 12]。本试验中初形成的愈伤组织原生质
体游离产量很低,但继代 5次后原生质体游离效果
较好,原因是愈伤组织经多次继代后, 处于质浓、等
径、璧薄、核大、旺盛繁殖的分生组织细胞逐渐增加,
从而游离出质量好、产量高的原生质体。
材料的处理方式同样影响原生质体的游离产
量,剪碎叶片、下胚轴有利于酶解液与材料充分结合
并获得大量的原生质体, 但剪切面及剪切面积却会
影响游离效果。试验中发现, 甘草无菌苗下胚轴以
横切面切割时(切割长度 0. 3~ 0. 5 cm ) , 酶液极难
进入到组织内部,即便解离 12 h原生质体产量依然
很低。而以纵轴面进行切割时, 即便切割成 0. 5~
0. 8 cm 的小段, 6 h后就会出现大量的原生质体, 其
原因是由于酶液更易进入细胞间隙,解离胞间层、初
生壁以释放原生质体的缘故。尽管下胚轴、叶片和
愈伤组织均获得了原生质体, 但对甘草而言, 幼嫩的
下胚轴和叶片其原生质体产量和活力远高于愈伤
组织。
3. 2
酶解方式对原生质体游离的影响
一般认为,摇床振荡酶解法有利于原生质体释
放,且原生质体的得率随酶解时间延长而增加[ 11]。
试验采用 40 r
min- 1摇床酶解 7 h 所得原生质体
产量最高,较静置酶解法加速了原生质体的游离进
程,但随着摇床转数和酶解时间的增加,原生质体在
连续震荡过程中产生破碎现象, 致使产量下降。而
先静置后缓慢震荡的酶解方式克服了以上困难, 在
静置期间使酶解液与材料组织充分接触, 而缓慢震
荡过程中,使原生质体大量释放出来,既提高了原生
质体的产量和质量, 又避免了原生质体长时间震荡
过程中由于碰撞出现的破碎现象; 故甘草原生质体
的游离应选择先静置后缓慢震荡的酶解方式。
4
结论
适宜于原生质游离的甘草叶片(苗龄 11 d)和下
胚轴(纵向切割) , 在含有 2. 0%纤维素酶+ 0. 5%果
胶酶的酶解液中以先静置( 12 h)后缓慢震荡( 40 r

min- 1 )的酶解处理方式下获得的原生质体产量和
活力最好;在 KM8P 培养基中调节原生质体密度为
1
105个
g- 1的分裂频率最高。试验建立了甘草
原生质体的游离及分裂体系,为下一步进行甘草体
细胞融合奠定了基础。
参考文献
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(责任编辑
李美娟)
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