全 文 ：文章编号: 1007-0435( 2004) 04-0298-05
鲁梅克斯 k-1杂交酸模及野生酸模遗传多态性分析
张玉玲1,鞠晓峰1,杨青川2 ,李柏林3,杨茁萌1
( 1.新疆农业大学草业工程学院 ,乌鲁木齐 830052; 2.中国农业科学院畜牧研究所,北京 100094;
3.北京市农林科学院, 北京 100089 )
摘要: 利用 RAPD技术对鲁梅克斯 k-1杂交酸模的 3 个繁育世代和野生酸模进行遗传多态性分析,结果表明: 3 个世代
之间不存在多态性位点差异, 3 个世代是稳定遗传的; 不同种和不同地点的同一个野生种之间存在着多态性位点差异;
在合格种的 12 个单株间具有明显的遗传多态性;采用混合取样可消除品种内的个体遗传差异性,较好地代表群体遗传
特征; 从 OPA 组选出 7 个能扩增出清晰且稳定带谱的引物, 7 个引物共检测出 45 个位点, DNA 片段的大小在 300～
2500 bp 之间。
关键词: 草原学; 鲁梅克斯 k-1杂交酸模 ; 野生酸模; 遗传多样性; RAPD
中图分类号: Q813. 1; Q31　　　文献标识码: A
Genetic Diversity of Rumex k-1( Rumex patientia×R. tianschanicus
cv.Rumex k-1) and Wild Rumex spp.
ZHANG Yu-ling
1
, JU Xiao-feng
1
, YANG Qing-chuan
2
, L I Bo-lin
3
, YANG Zhuo-meng
1
( 1. Dept. of G rassland Science , Xinjiang Ag ricultura l Univ ersity, U rumqi, Xinjiang Uygur Autonomous Reg ion 830052, China;
2. I nstitute of Animal Science, Chinese Ag ricultur al Acdemy , Beijing 100094 China;
3. Beijing Agr icult ur al and Fo rest ry Acdemy, Beijing 100089 China)
Abstract: T he genet ic polymorphisms of three cont inued gener at ions o f Rumex k-1 ( R . patientia× R .
tianschanicus cv. Rumex k-1) and sever al w ild Rumex spp. w ere analysed, using r andom amplified polymorphic
DNA markers ( RAPD ) . The resul t shows that there ar e no dif ferent po lymo rphic lo ci among the thr ee
successiv e generat ions of Rumex k-1, show ing genetic stabil ity , except fo r the 12 plants of the cert if ied seed of
Rumex k-1; while among the dif ferent populat ions o f the same wild Rumex species g row ing in different sites,
there appear abundant g enet ic polymorphisms loci. Seven pr imer s selected fr om OPA tw enty primers ampl if ies
45 RAPD fragments. T he leng th of most of the amplified fr agments range from 300 bp to 2500 bp.
Key words : Grassland science; Rumex k-1; W ild Rumex spp. ; Genet ic polymorphism; Random amplif ied
po lymo rphic DNA markers
　　RAPD 技术是在 PCR 技术基础上形成的一种分
子标记技术[ 1]。RAPD技术具有操作简单、费用低、无
放射性、实验周期短 [ 2]等优点, RAPD 技术在揭示物
种的遗传多态性、遗传图谱构建、物种识别和品种鉴定
以及在育种研究中具有较大的应用潜力, 已在许多植
物遗传多态性的研究中得到广泛应用。
目前,利用 RAPD 技术对鲁梅克斯 k-1杂交酸模
和野生酸模种质资源遗传多态性的研究尚未见报道。
鞠晓峰 [ 3]对鲁梅克斯 k-1杂交酸模的三个连续世代进
行了同工酶和种子储藏蛋白标记,结果表明 3个世代
间是稳定遗传的。本试验利用RAPD 技术从DNA 分
子水平上研究了鲁梅克斯 k-1杂交酸模和几种野生酸
模的遗传多态性,并对野生酸模的不同种和不同采集
地的同一个野生种进行比较, 分析鲁梅克斯 k-1杂交
酸模及其它野生种的遗传变异和遗传关系,为酸模属
植物资源评价利用提供依据。
收稿日期: 2003-05-22;修回日期: 2004-10-21
作者简介:张玉玲( 1977-)女, 内蒙古赤峰人, 硕士, 讲师, 主要研究方向为牧草生物育种
第 12卷　第 4期
　Vo l. 12　　No. 4
草　地　学　报
ACT A AGRESTIA SIN ICA
　2004 年　12 月
　Dec. 　2004
1　材料与方法
1. 1　供试材料
供试材料分别为:鲁梅克斯 k-1 3 个连续世代的
原原种、原种和合格种; 狭叶酸模 ( R. stenop hy llus
Ldb. ) 2 份; 皱叶酸模( R. cri spus L. ) 1份; 长叶酸模
( R. longif olius DC. ) 1 份; 天山酸模( R . t ianschanicus
A. Los. ) 1份;巴天酸模( R. pat ientia L. ) 5份,共计 13
份,种子来源见表 1。试验样品采于中食产业集团鲁梅
克斯有限公司北京昌平基地和通州基地,均取混合样。
表 1　供试材料及其来源
T able 1　Mater ial and o rigin
编号
No.
种名
Variety n ame
学名
S cient ific n ame
采集地点
Origin
采种时间
Tim e
1 Rumex k-1原原种 R . pat ient ia×R . t ianschanicus 乌克兰 Ukraine 1995
2 Rumex k-1原种 R . pat ient ia×R . t ianschanicus 新　疆 Xinjiang 1997
3 Rumex k-1合格种 R . pat ient ia×R . t ianschanicus 新　疆 Xin jiang 1999
4 狭叶酸模 R . st enophyl lus Ldb. 八一农场 Bayi Farm 1997
5 皱叶酸模 R. cri sp us L . 伊　犁 Yil i 1997
6 长叶酸模 R . longif olius DC. 伊　犁 Yil i 1997
7 天山酸模 R . t ianschanicu s A. Los. 伊　犁 Yil i 2000
8 巴天酸模 R . p atient ia L. 青　海 Qing h ai 1998
9 巴天酸模 R . p atient ia L. 伊　犁 Yil i 1997
10 巴天酸模 R . p atient ia L. 伊　犁 Yil i 2000
11 巴天酸模 R . p atient ia L. 伊　犁 Yil i 2000
12 巴天酸模 R . p atient ia L. 伊　犁 Yil i 2000
13 狭叶酸模 R . st enophyl lus Ldb. 伊　犁 Yil i 2000
　　注:野生种均由中国科学院植物研究所李安仁研究员鉴定定名。其中 1号材料由熊军功; 2、3、4、5、6、8、9号材料由杨茁萌; 7、10～13号材料由安
沙舟分别提供
Notes : W ild species were appraised and nam ed by LI Ren-an, res earch fellow of Chin ese Academy of Sciences; No. 1 w ere pr ovided b y XIONG
Jun-gong; No. 2、3、4、5、6、8、9 by YANG Zhuo-meng and No. 7、10、11、12、13 by AN Sha-zhou respect ively
1. 2　提取总 DNA
1. 2. 1　采用 CT AB法, 从供试叶片中提纯总 DNA。
取鲜叶片 3 g , 置入液氮中冰冻, 研磨后, 加入
65℃的 2×CT AB ( 2% CT AB 2 M trisHCl、0. 5 M
EDT A、5 M NaCl)提取液 900 ul。65℃水浴 15～20
min,冷却后加入 500 ul氯仿:异戍醇溶液( 1∶24) , 轻
摇 5 min,在 6000～8000 r/ m in 下离心 10 min。
1. 2. 2　取上清液,冷却后加入 500 ul氯仿: 异戍醇溶
液( 1∶24) ,轻摇 5 m in, 在 6000～8000 r/ min 下离心
10 min;取上清液,加入 1/ 10体积的 3 M 醋酸钠和等
体积的异丙醇,摇匀至出现絮状沉淀, 在 12000 r/ min
下离心 5 min,倒掉上清液, 用 75%酒精清洗, 在室温
下干燥 1 h后,溶于 T E 缓冲下保存备用。
1. 3　引物筛选
引物由 OPEROR公司提供。实验选用OPA 组的
20个引物,进行扩增筛选,选出 7个扩增产物清晰、稳
定的引物(表 2)。
表 2　7 个引物碱基序列
Table 2　Sequence of the seven screen primers
Operor 编号 Operor No 序列 Sequence
OPA7 GAAACGGGT G
OPA8 GT GACGT AGG
OPA11 CAAT CGCCGT
OPA12 TCGGCGATAG
OPA15 TT CCGAACCC
OPA19 CAAACGTCGG
OPA20 GT TGCGATCC
1. 4　扩增条件
整个体系为 25 ul。
体系的组成成份　ddH2O　15. 7 ul
buf fer 2. 5 ul( 10×buffer )
Mg
2+
4. 5 ul( 15 mM / L)
dNT P 0. 4 ul( 10 mM / L)
Taq酶 2 U ( 1 ul= 5 U )
引物 0. 5 ul
模板 240～360 ng
1. 5　扩增程序
299第 4期 张玉玲等:鲁梅克斯 k-1杂交酸模及野生酸模遗传多态性分析
1. 6　扩增产物电泳检测
用 T AE 电泳缓冲液溶解琼脂糖粉,等溶液冷至
60℃时,加入 EB,灌胶,凝固后, 点样。对扩增产物电
泳,在紫外灯下检测、照相。
1. 7　多态性位点统计分析
对电泳带谱进行统计时, 把某一位点出现带者记
为 1, 未出现带者记为 0,计算多态性位点比例[ 4]。
2　结果与分析
2. 1　RAPD扩增结果
对 OPA 组的 20个引物进行 4次筛选, 20个引物
对 13个样品均有带谱出现。经筛选只有 7个引物的带
谱较清晰且稳定,即 OPA -7、OPA-8、OPA-11、OPA-
12、OPA-15、OPA-19、OPA-20。用选出的 7个引物 ,
对 13份酸模属材料进行扩增,共扩增出 45条清晰的
带谱,平均每个引物扩增 6. 5条带,每份材料平均扩增
出 3. 5 条带, 变幅为 1～8 条, 扩增出的 DNA 片段大
小为 300～2500 bp之间。
2. 2　杂交酸模合格种 12个单株 RAPD 分析
鲁梅克斯 k-1杂交酸模合格种 12个单株DNA 的
扩增结果差异显著。说明鲁梅克斯k-1属常异花授粉植
物,在同品种或群体内的个体多为杂合体, 个体间存在遗
传差异。因此,品种间进行比较时, DNA 要取混合样,以
此来降低单株对品种(群体)造成的差异性(图 1)。
图 1　OPA18 引物扩增带谱
F ig . 1　Banding pattern of primer No . OPA18
注:从左向右, 1道: Marker; 2～13道:合格种的 12个单株
Notes: From lef t to right No. 1 is m aker; 2～13 is tw elve
in dividuals of R umex k-1( R . p atient ia×R . tianschanicus)
2. 3　杂交酸模和 10种野生酸模 RAPD 分析
2. 3. 1　鲁梅克斯 k-1的 3个世代间没有多态性位点
出现, 多态位点比例均为 44. 4%, 以此可以确定 3 个
世代间的遗传是稳定的。其它野生种及采于不同地点
的同种之间均存在着多态性位点(表 3、图 2、3、4)。
图 2　OPA15 引物扩增带谱
F ig . 2　Banding pattern of primer No . OPA15
图 3　OPA11 引物扩增带谱
F ig . 3　Banding pattern of primer No . OPA11
图 4　OPA12 引物扩增带谱
F ig . 4　Banding pattern of primer No . OPA12
注:图 2、3、4 从左到右 1道: m aker; 2道:鲁梅克斯 k-1原原种; 3
道:鲁梅克斯 k-1原种; 4道:鲁梅克斯 k-1合格种; 5、14道:狭叶酸模; 6
道:皱叶酸模; 7道:长叶酸模; 8道:天山酸模; 9～13道:采于不同地点
的巴天酸模
Notes : Fig. 2、3、4 f rom lef t t o right No. 1 is m ak er; 2～4 are
Rumex k-1 ( R . p atie ntia×R . tiansch anicus) ; 5、14 are R. st enop hyl lus
Ldb. ; 6 is R. c risp us L. ; 7 is R. l ong if ol ius DC. ; 8 is R. t ianschanicus
A. Los. ; 9～13 are R . p atient ia L. of dif feren t origins
2. 3. 2　除鲁梅克斯 k-1杂交酸模以外的 10份野生酸
模之间均有多态位点出现。2份狭叶酸模的多态位点
比例均值为 P = 45. 6%; 皱叶酸模为P = 44. 4%; 长叶
酸模为 P = 40%; 5份巴天酸模均值为 P = 42. 2%; 而
300 草　地　学　报 第 12卷
天山酸模多态位点比例只有 P = 24. 4%, 这可能与天
山酸模是一个起源较为原始的、二倍体种( 2n= 20)有
关。相比较而言,巴天酸模的体细胞染色体数为 2n=
60[ 3] (表 3)。
表 3　RAPD 标记遗传参数
T able 3　RAPD genetic parameter
材料
Material
编号
No.
全部位点数
T otal loci
多态位点比例
Polymorphic loci( % )
R umex k-1原原种 1 45 44. 4%
R umex k-1原种 2 45 44. 4%
R umex k-1合格种 3 45 44. 4%
狭叶酸模 4 45 42. 2%
皱叶酸模 5 45 44. 4%
长叶酸模 6 45 40. 0%
天山酸模 7 45 24. 4%
巴天酸模 8 45 37. 7%
巴天酸模 9 45 40. 0%
巴天酸模 10 45 42. 2%
巴天酸模 11 45 48. 9%
巴天酸模 12 45 42. 2%
狭叶酸模 13 45 48. 9%
　　注:供试材料学名(拉丁文)见表 1
2. 3. 3　某一种质资源遗传变异的大小和遗传结构与
材料的来源和地理分布也有直接关系, 如: 2份狭叶酸
模多态位点比例分别为 P = 42. 2% (八一农场)和 P =
48. 9%(伊犁) ; 5份巴天酸模分别为 P = 37. 7% (青
海)、P = 40% (伊犁)、P = 42. 2% (伊犁)、P = 48. 9%
(伊犁)和 P = 42. 2%(伊犁) , 表现出了种内遗传上的
多样性。
2. 4　13份材料 Neis相似系数和遗传距离
根据 RA PD多态性测试结果,计算出 Neis 相似
系数 I 和遗传距离D(表 4)。从表4的相似系数可以看
出,鲁梅克斯 k-1杂交酸模的 3个世代之间相似系数
为 1,表明 3个连续繁殖的世代间不存在差异,是稳定
遗传的;来自不同产地的 5份巴天酸模与鲁梅克斯 k-
1的 3个世代之间相似系数都在 0. 79以上, 表明它们
之间有较近的亲缘关系;鲁梅克斯 k-1 与其父本天山
酸模之间的相似系数在 0. 61以下,表明它们之间的亲
缘关系较远; 2份狭叶酸模之间的相似系数在0. 7以
下,表明遗传上有一定差异,这可能与材料的来源和地
理分布有关; 来自不同产地的 5份巴天酸模与鲁梅克
斯 k-1的 3个世代之间相似系数有差异,结果表明地
理分布对遗传也有直接关系。
表 4　13 份材料遗传相似系数( I)及遗传距离( D)矩阵
Table 4　Mat rix o f pairw ise similar ity and genetic distances
N1 N 2 N3 N4 N5 N6 N 7 N8 N9 N10 N11 N 12 N13
N1 1. 0000 1. 0000 0. 6271 0. 7165 0. 7165 0. 6065 0. 8669 0. 7939 0. 9355 0. 8825 0. 8187 0. 8669
N2 0. 0000 1. 0000 0. 6271 0. 7165 0. 7165 0. 6065 0. 8669 0. 7939 0. 9355 0. 8825 0. 8187 0. 8669
N3 0. 0000 0. 0000 0. 6271 0. 7165 0. 7165 0. 6065 0. 8669 0. 7939 0. 9355 0. 8825 0. 8187 0. 8669
N4 0. 4667 0. 4667 0. 4667 0. 8669 0. 6514 0. 6347 0. 6807 0. 7165 0. 6514 0. 6271 0. 6514 0. 6807
N5 0. 3333 0. 3333 0. 3333 0. 1429 0. 7515 0. 7613 0. 7939 0. 7165 0. 7515 0. 7165 0. 7515 0. 6807
N6 0. 3333 0. 3333 0. 3333 0. 4286 0. 2857 0. 5292 0. 7939 0. 7165 0. 7515 0. 7165 0. 7515 0. 7939
N7 0. 5000 0. 5000 0. 5000 0. 4545 0. 2727 0. 6364 0. 6703 0. 7165 0. 6347 0. 7165 0. 7613 0. 5488
N8 0. 1429 0. 1429 0. 1429 0. 3846 0. 2308 0. 2308 0. 4000 0. 9131 0. 9260 0. 8669 0. 7939 0. 8465
N9 0. 2308 0. 2308 0. 2308 0. 3333 0. 3333 0. 3333 0. 3333 0. 0909 0. 8465 0. 7939 0. 8465 0. 6347
N10 0. 0667 0. 0667 0. 0667 0. 4286 0. 2857 0. 2857 0. 4545 0. 0769 0. 1667 0. 8187 0. 8669 0. 7939
N11 0. 1250 0. 1250 0. 1250 0. 4667 0. 3333 0. 3333 0. 3333 0. 1429 0. 2308 0. 2000 0. 8187 0. 7515
N12 0. 2000 0. 2000 0. 2000 0. 4286 0. 2857 0. 2857 0. 2727 0. 2308 0. 1667 0. 1429 0. 2000 0. 7939
N13 0. 1429 0. 1429 0. 1429 0. 3846 0. 3846 0. 2308 0. 6000 0. 1667 0. 4545 0. 2308 0. 2857 0. 2308
　　注: N1:鲁梅克斯 k-1原原种; N2:鲁梅克斯 k-1原种; N3:鲁梅克斯 k-1合格种; N4、N13:狭叶酸模; N5:皱叶酸模; N6:长叶酸模; N 7:天山酸模;
N8-N12:采于不同地点的巴天酸模
Notes : N 1～N3 are Rumex k-1 ( R . p at ientia×R . t ianschanicus) ; N4、N13 are R . stenop hy llus Ldb. ; N5 is R . cr isp us L. ; N6 is R. l ong if ol ius
DC . ; N7 is R. t ianschanicus A. Los. ; N8～N12 are R . pat ient ia L. of diff erent origins
2. 5　聚类结果
聚类结果表明: 13份材料的种属关系除 N 4为狭
叶酸模外,其余的与形态分类一致。在相似系数0. 7939
水平上,分为五类。鲁梅克斯 k-1 3个世代之间在遗传
上没有变异;鲁梅克斯 k-1与巴天酸模之间亲缘关系
较近,其中亲缘关系最近的是N10。试验结果显示鲁梅
克斯 k-1与巴天酸模之间有较高的相似系数, 聚类结
果表明: 相似系数非常接近,因此, 从 DNA 水平上显
示出鲁梅克斯 k-1的遗传背景与巴天酸模较近。天山
酸模独为一类,与其它材料之间的亲缘关系较远;在杂
交种的育成中,天山酸模常用作父本, 如巴天酸模×天
山酸模就是一对具有强杂交优势的组合, 比供试野生
酸模增产 10倍以上。杂种优势的产生在于两亲本之间
的遗传性差异, 从 RAPD多态性方面上反映出天山酸
模与其它酸模的差异,但其分化上的独特性尚需从各
方面加以确证。试验结果表明:在酸模属植物中具有非
常丰富的 RAPD多态性,不仅在种间而且在种内都表
301第 4期 张玉玲等:鲁梅克斯 k-1杂交酸模及野生酸模遗传多态性分析
现出不同的变异,对不同种及品种进行广泛的多态性
分析,可为酸模的系统学研究、配置杂优组合及遗传育
种提供更多的信息(表 4、图 5)。
图 5　13 份材料的 UPGMA 系统树
Fig. 5　Dendrogr am of 13 ma terials
3　讨　论
通过对鲁梅克斯 k-1和几种野生酸模总基因组
DNA 的 RAPD 分析结果表明: 鲁梅克斯 k-1 杂交酸
模 3个连续世代的 DNA 分子多态性位点比例是稳定
的,说明采用空间隔离的三级良种繁育体系是科学合
理的,遗传是稳定的,利用该繁育体系可以保证合格种
子的质量。另外, 其DNA分子多态性位点比例均值
( P = 44. 4%)比其父本天山酸模( P = 24. 4% )和母本
巴天酸模( P = 42. 7%)多,表明鲁梅克斯 k-1品种内的
变异幅度较大,品种的杂和性较高,也表现出其遗传复
杂性。但野生狭叶酸模 DNA 分子多态性位点比例
( P = 45. 6%)比鲁梅克斯k-1杂交酸模还高,说明野生
狭叶酸模的遗传多样性更为复杂,在自然条件进化程
度更高。某一种质资源遗传变异的大小和遗传结构除
受繁育体系影响较大外,与材料的来源和地理分布也
有直接关系。巴天酸模为优良的野生牧草, 是早春返青
最早的牧草之一, 根据本试验的初步测定, 其多态位点
比例变化幅度为 P = 37. 7% (青海)和 P = 48. 9%(伊
犁) ,平均为 P = 42. 7% ,表现出种内遗传上的多样性,
在新品种选择上存在巨大的遗传潜力。在其它种中是
否也存在这一现象,尚有待进一步研究。
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302 草　地　学　报 第 12卷