全 文 ：武汉植物学研究 2006，24(6)：541～545
Journa／oi"Wuhan Botanical Research
一 株产紫杉醇的南方红豆杉内生真菌的分离及分类研究
田仁鹏，杨 桥，周国玲，谈静泉，张珞珍，方呈祥
(武汉大学生命科学学院，武汉 430072)
摘 要：从生长在湖北的南方红豆杉树皮中韧皮部分离出一批内生真菌，从中获得一株能产紫杉醇的菌株 TPF6。
对其形态特征的研究以及生理生化特性的测定 (bilog)结果表明，菌株 TPF6与链格孢属有很大的相似性；与 18S
rDNA分析比对表明，菌株 TPF6属于链格孢属，并与链格孢属其他种共享 95％ -99％的保守序列 ，其中与交链格孢
(Ahernaria alternata)18S rDNA的保守度高达99％ ；全细胞脂肪酸分析结果显示，18：2 CIS9、12／18：Oa为 TPF6的主
要脂肪酸组分，该菌株与链格孢属(Alternaria)相似度最高，SIM值为 59．8％。根据分类学研究结果，菌株 TPF6属
于半知菌门链格孢属，定名为交链格孢(A．dternata)。应用高压液相色谱技术测定结果表明，菌株 TPF6发酵液中
紫杉醇含量为 84．5 g／L。
关键词：紫杉醇；交链格孢；18S rDNA分析；脂肪酸分析
中图分类号：Q949．331 ．3 文献标识码：A 文章编号：1000-470X(2006)06-0541-05
Taxonomic Study on a Taxol Producing Fungus Isolated from
Bark of Taxus chinensis Var ．mairei
TIAN Ren—Peng，YANG Qiao，ZHOU Guo—Ling，TAN Jing—Quan，ZHANG Luo—Zhen，FANG Cheng-Xiang’
(Colege ofIge＆ ，Wuhan University，Wuhan 430072，China)
Abstract：Taxonomic studies were preformed on the strain TPF6，which was isolated from the bark of
Taxus chinensis Vff．mairei growing in Hubei Province．Phenotypic analysis and biolog analysis indicated
that strain TPF6 show high similarity with genus Alternaria．Phylogenedc analysis based on 18S rDNA
gene sequence indicated that the strain belongs to the genus Alternaria，sequ ence similarity values with its
nearest neighbors are between 95％ 一99％ ．and share more than 99％ with strain A．alternata．The pre—
dominant fatty acid components are 18：2 CIS9．12／18：0a and shares 59．8％ the same celular fatty acid
composidon with other membel~ in Alternaria．On the base of taxonomic data．the strain was named as A．
ahernata．Th e taxol producing ability was determ ined by HPLC and MS．Th e result shown that the taxol
concentration in ferm entation medium iS 84．5 g／L．
Key words：Taxol；Ahernaria alternata：18S rDNA；Whole cel fatty acids
紫杉醇(Taxo1)是一种抗肿瘤的特效药物，广泛
被应用于转移性卵巢癌与转移性乳腺癌、肺癌、结肠
癌以及支气管癌等疾病的临床治疗。它主要来源于
植物组织中提取、红豆杉(Taxus)细胞组织培养、化
学合成和微生物发酵等途径。红豆杉细胞组织培养
需要的条件严格且产量低而化学合成成本昂贵，因
此这两种途径均不适合大量获取紫杉醇。目前获得
这种特效药物的主要途径是从红豆杉植物组织中提
取。据初步统计，制备 1 g紫杉醇需要 6棵 6o年龄
以上的红豆杉的树皮，才能达到一个病人的治疗用
量。但红豆杉已经作为濒危物种被列为国家一级保
护植物。显然从红豆杉植物组织中提取已受到极大
的限制，寻找获取紫杉醇的新途径具有十分重要的
意义。
植物内生真菌是寄生于植物组织内的真核微生
物，经过长时间的进化，植物内生真菌和寄主植物体
形成了一定程度的共生关系，相互依赖 ，很多内生真
菌带有植物体的酶系，可以产生和寄主植物体相同
的次生代谢产物。1993年，美国化学家 Stiede和植
物病理学家 Strobel【l2 最早从短叶红豆杉 (Taxus
brevifolia)的韧皮部分离出一株产紫杉醇的内生真
菌，通过采用质谱、色谱(TLC／HPLC)和放射性化学
收稿日期：2006-04-13，修回日期：2006-06-06。
基金项 目：国家自然科技资源平台项目(2005 DKA 21208)资助。
作者简介：田仁鹏(1981一)，男，硕士研究生，主要从事微生物遗传学研究。
{ 通讯作者(E-mail：cxfang@whu．edu．cn)。
维普资讯 http://www.cqvip.com
武 汉 植 物 学 研 究 第 24卷
标记证明了其培养物中存在紫杉醇，虽然产率较低，
但是给人们很大的启示，为通过微生物发酵产生紫
杉醇带来了希望。相继分离产紫杉醇真菌的研究逐
渐活跃。目前报道产紫杉醇的真菌有紫杉霉属
(Taxomyces)、盘单毛孢属(Monochaetia)、镰刀霉属
(Fusarium)、链格孢属(Alternaria)等数十个属 ．4 J，
经过培养优化，得到了许多高产的菌株。其中王建
峰等 从福建地区的南方红豆杉中分离出一株紫
杉醇产生菌，发酵产量达到了 185．4 g／L。
红豆杉这种古老的树种分布于我国境内的主要
有东北红 豆杉 ( cuspidata)、中国红豆杉 (
chinensis)、云南红豆杉( yunnanensis)、西藏红豆
杉( walichiana)和南方红豆杉( chinensie var．
mairei)等品种，它们的组织中寄生有种类丰富的内
生真菌。我们从生长在湖北地区的南方红豆杉组织
中分离出内生真菌，并对其进行了分类和代谢的研
究，以期丰富红豆杉内生真菌的种群资源，为寻找更
高产或更适合人工修饰的产紫杉醇真菌奠定基础。
1 材料和方法
1．1 实验材料
南方红豆杉(Taxus chinensis var．mairei)树皮，
采于湖北地区，样品采集后迅速装入无菌塑料袋中，
4~C保存。
1．2 实验方法
(1)菌株的分离与纯化 将南方红豆杉树皮置
于无菌条件下，切割成边长为 0．5 cm的正方形小
块，用75％的乙醇表面消毒2—3 min，然后用无菌
水漂洗 3次；用无菌滤纸吸干水分，然后嵌入水一琼
脂培养基中，30~C培养3—10 d，待菌丝体长出后，挑
取菌丝体尖端于 PDA培养基中，28~C培养 3—4 d
后，再挑取菌丝分离单个菌落，直至为纯培养。
(2)菌株的形态特征 取菌株 TPF6孢子涂布
于 PDA平板上，置28~C培养；待刚长出菌丝时，将无
菌的盖玻片斜插入平板内(插片法)，继续培养至孢
子成熟时，将玻片取出在显微镜下观察其特征。
(3)生理生化特性的测定 使用 Biolog自动微
生物分析仪(BIOLOG公司)对 11PF6的生理生化特
性进行测定。操作方法根据 Biolog操作指南进
行 。培养基为 2％的 ME固体培养基，加样悬浮
液浊度为75％。
(4)全细胞脂肪酸组分分析 全细胞脂肪酸组
分分析使用安捷伦 GC 6890 series(安捷伦公司生
产)。全细胞脂肪酸的制备与测定按照安捷伦 GC
6890脂肪酸测定仪操作手册进行。培养基为沙堡葡
萄糖液体培养基(Sabouraud Dextrose Broth)，28~C扩
大培养 3 d，待培养物变成褐绿色时离心收集菌体，经
过皂化和甲脂化处理后，抽提脂肪酸甲脂上样分析。
色谱条件：检测器，氢火焰 (FID)；检测器温度
300oC，色 谱 柱 为 19091B一102UL TRA2，固 定 相
DEGS，汽化室温度 250 oC，柱温 170 oC，载气(N )
60—65 mL／min，H2 50 mL／min，空气 500 mL／min，
进样量 0．5 L。
(5)18S rDNA测定 菌株 11PF6的 18S rDNA
序列的测定参照White等的方法 进行。PDA培养
基 28~C培养 TPF6至对数期，收集菌体，用酶一CTAB
法破菌株TPF6细胞壁抽提染色体 DNA 】，从琼脂
糖凝胶电泳检测并 回收染色体 DNA。PCR扩增菌
株 TPF6的 18S rDNA序列与测序根据其通用引物
NS1，NS8进行。
NS1：5’一GTA GTC ATA TGC TrG TCT C一3’：
NS8：5’一TCC GCA GGT TCA CCT ACG GA 3’。
PCR反应总体积 为 50 L(其 中 Taq premix
25 L，上游引物 1 L，下游引物 1 L，模板 DNA
3 ，无菌去离子水 20 L)。PCR反应条件为：
94。I=5 Ilin一个循环，94oC 1 min，60oC 1 min。72oC
1．5 min，共35个循环；最后在72~C下 延伸10 min。
PCR反应产物用 0．8％琼脂糖凝胶电泳检测，回收
(使用 OMEGA公司胶回收试剂盒)。序列测定由博
亚公司完成。根据测序结果，应用 PHYLIP软件建
立系统发育树 引¨。
(6)紫杉醇的检测 将菌株 TPF6接于200 mL
液体 PDA培养液中28~C振荡培养2—3周，破壁。滤
掉固状物，滤液经冻干机浓缩至 1／10，然后用等体
积氯O／甲醇(10：1)抽提，取有机相 ；再抽干至粉
状，并溶于 1 mL甲醇，用0．22 m微孔过滤器(Mil—
lipore，Bedford，MA，USA)过滤除杂质。
紫杉醇标准样品(SIGMA产品)用甲醇配成
0．07—0．7 mg／mL的梯 度，绘制 标 准 曲线 ¨ 。
HPLC检测条件：C8色谱柱，梯度洗脱：1—15 min，
甲醇含量从 80％ 一100％，流速为0．2 mL／min，检测
波长为 228 nm，进样量为 20 L，每份样重复 3次。
质谱分析用 ESI离子源 ful ms scan±502000进行。
2 结果
2．1 菌株 TPF6的形态特征
共从南方红豆杉树皮中分离出了6株内生真
维普资讯 http://www.cqvip.com
第6期 羽仁鹏等：一抹产紫杉醇的南方红昆杉内生真菌的分离及分类研究 543
菌 菌株TPF6在 PDA平板上生长迅速．其形态特
征见图 1 菌落呈圆型．边缘不规则，菌落厚实；菌
落表面初期呈白色，3～4 d左右逐渐由灰变为献褐
绿色 显微镜下菌丝有隔膜，未见核．菌丝直径 2～
5 pan不 等 舒牛孢子梗 从苗鲐 l十 (见图 l：a)，
1
毒
结构简单有少量分支，分生孢子梗上形成分生孢子；
分生孢于呈倒棒状。无喙或喙短，直径4～8 m．长
l0—30 btm．颜色由金黄色逐渐加深至褐 色．成链
状．具有明显的环状孢痕(见图1：b)。图I：c~vPr6
产孢子后菌落矗而 描}U镜 J
n I~．F6苗 津 ．廿生推子证＆廿生孢千：b Tm 饱 ．c 11JF6苗悼击 f扫描 『 链
a Myedi~ 日¨d pholomicrograph ’n PI)A m ⋯ “28t bT 3 d；b Phdomle~3gralah of 腊 of b
c SEM Phot~ icmgTophfrom Ihe ur ⋯ r t n FPF6
围 1 菌株TPF6的形态特征(x100)
Fig 1 PhenoBpie data of st~in TPF6f×1000)
2 2 生理生 化特性
经用Biolog 96孔真菌鉴定板(FF)和微生物自
动鉴定仪测定菌株 讦F6的生理生化特征，结果表
明，菌株TPF6可利用的碳源有：N-乙酰基一B—D一葡萄
糖胺、L一阿拉伯糖、熊果苷、D一纤维二糖、糊精、龙胆
二糖、乳果糖 、麦芽糖、麦芽三糖、D一甘露糖、B一甲基一
D一葡萄糖苷、D一棱糖、蔗糖、D嗨 藻糖、松二糖、D木
糖等碳水化合物，以及·一赤藓糖醇、甘油等有机醇和
D葡萄糖一l—磷酸、D一葡萄糖醛酸、演化琥珀酸、延
胡索酸、 一酎戊二酸、I，乳酸、L苹果酸、奎尼酸、L丙
胺酸、L一丙氨酰甘氨酸、L一天门冬酰胺、一L一谷氨酸、
L广苯丙氨酸等有机酸，而不能利用阿东糖醇、葡萄醛
酰胺 、肌醇、麦芽糖醇、D-蜜二糖等物质。
一 i
Bio[og测定结果与其真菌库比对结果显示菌株
n r6与互 格链 格孢 [Altemaria alZer~ta(Fr)
Keissler]最为相似。
2 3 全细胞脂肪酸的测定结果
TPF6的全细胞脂肪酸组分主要为 18：2 CIS9．
I2／I8：0a；16：0；I7：0 30H；17：I Cis 9(W 8)；I 8：0；
I9：0 ISO等，其中 18：2 CIS9，12／18：Oa含量最高，
占总脂肪酸的63 17％(见图2)。Sherlock软件配
有真菌脂肪酸数据库，可以和TPF6全细胞脂肪酸
成分分析结果进行比对．根据该数据库的比对结果
显示：菌株TPF6的脂肪酸组分与链格孢属(Alterna—
ria species)的相似性(Sim值)最高．为0 589．其中
与交链 格孢(A n⋯ a)的 Sim 值为 0 530
囤2 TPF6全细胞脂肪醯GC分析圈
Fig 2 Whole ceilfaty髓ld~ alysls ofTPF6
、
咔
维普资讯 http://www.cqvip.com
武汉 植 物学 研 究 第24卷
2．4 18S rDNA序列的测定结果
以TPF6染色体 DNA为模板，使用丝状真菌
18S rDNA通用引物 NS1、NS8进行 PCR扩增，获得
一 条 1．8 kb左右大小的片断(见图3)，经过测序，
得到的 1834 bp的片段在 GenBanks数据库比对，其
结果见图4
^ 4 ， l
1—4 18S rDNA ·订 TPF6；5． ·Fa l4 DNA m~ker：6．DI2000
marker(Pu B m r Ⅱ1
圈 3 18S rDNA扩增 片段琼脂糖凝胶 电泳图
Fig 3 0 7％ gel eleetraphoresis patern of
TPF6 l8S rDNA
圈 4 菌株 TPF6依据 18S rDNA序列的系统发育树
Fig 4 Phyle~enetie tree between strain TPF6 and relaled
stralns bs~ed∞ 18S rDNA 8 quelIce(The18S rDNA
8e~ euce we from NCBI
根据比对结果表明菌株TPF6与链格孢属内各
种之问含有95％ 一99％的序列高度保守。其中交链
格孢的18S rDNA序列与菌株1]PF6的同源性为99％．
只有3个碱基的差别；萝 h链格孢霉(A．raphani)，番
薯生链格孢霉(A．brassicicola)，芥链格孢霉(A．bra—
ssicae) 等与11~F6的相似度都大干98％，可认定在
进化地位上与TPF6的亲缘关系较近。
2．5 菌株 TPF6产生紫杉醇的检测结果
高压液相色谱分析紫杉醇标准样在 RT=2．210
左右有较强的一个吸收峰(见图5：A)．根据0 07～
Rmentioa time(mln)
。 。
& t n 1)
A．0．14 m mL的紫杉醇标准样品渣相图；B．TPF6细胞拄酵提
取藏样品液相图
A Ttxol~tandard sample(0．14 m mL)；B．Fe~entation metabo一
]lie and cell extract 0fTPF6
田 5 HPLC检测紫杉醇的图谱
Fig．5 HPLC Chromatogram of laxoI detection
0．7 m昏／mL的紫杉醇标准样流出线性方程用来 十算
样 品的浓度 (Y=7135．92027x 一51．5674 (P<
0．0OO1，r=0．99886)。图5：B为菌株 _rIJF6细胞发
酵提取物样品液相色谱圈，在保留时间 RT=2．209
左右有一个较强的吸收峰。在同样的色谱条件下，
可以初步判定与标准样品峰为同一物质．并可根据
峰面积551．4推算出原始发酵液中紫杉醇含量为
s4．5 g／L。选择性离子质谱(MS)分析得到分子量
为854紫杉醇分子离子峰和876．5的钠离子加台峰
(见图6)，确定该分子为紫杉醇分子。
600 8110 I(X)fl j!(X1 I400 l600 I 800 vO01i
Ill-Z
围6 菌株 TPF6产生紫杉醇的质谱围
Fig．6 MS chromatogram of t且】￡nl from sa"~in TPF6
m 0 m ” 0 m”Ⅺ
【f一《 i qJ0 cl (『]《一3目七0上
一
盟 皿
m
一
山
髓
～
广 ]
一
维普资讯 http://www.cqvip.com
第6期 田仁鹏等：一株产紫杉醇的南方红豆杉内生真菌的分离及分类研究 545
3 讨论
通过对分离获得的菌株 1PF6的显微镜观察和
BIOLOG微生物生理生化鉴定，从菌丝、孢子的形
态，产孢子的特征，代谢特性等发现菌株 1PF6株与
链格孢属特征相似。以丝状真菌 18S rDNA的通用
引物，以菌株 TPF6染色体 DNA为模板扩增出菌株
1PF6的 18S rDNA进行测序，并在 NCBI上进行 比
对及建立系统进化树，可以确定菌株 TPF6与属内
其他种的亲缘关系，从而更准确的对其进行定位。
全细胞脂肪酸组分在系统微生物学占有重要的地
位。细菌的脂肪酸组分测定较多，丝状真菌分析较
少，链格孢属中尚未见报道。本研究的全细胞脂肪
酸组分分析结果可补充这方面数据。在对菌株
1PF6的分类学研究中，Biolog生理生化特征的测
定、全细胞脂肪酸组分测定和 18S rDNA序列测定
取得了一致的结果。国内外研究者在对产紫杉醇真
菌的研究中多为形态特征和生理生化特性的检测以
及产紫杉醇特性的分析，尚未见对产紫杉醇真菌进
行全面分类学分析的报道，我们将 18S rDNA序列
分析和全细胞脂肪酸组分测定用于产紫杉醇真菌的
分类研究中，丰富了对产紫杉醇真菌的鉴定手段，使
我们能更全面更准确地将其定位。
链格孢属真菌大多兼性寄生于植物体，作为一
种植物的内生物(endophyte)；它们大多可以产生很
多有用的代谢产物，是经济上重要的真菌属之一，也
是真菌学研究热点之一。红豆杉属植物全世界约有
11种，分布于我国的有 4个种和 1个变种，即东北
红豆杉、云南红豆杉、西藏红豆杉、中国红豆杉和南
方红豆杉。目前这几种红豆杉都有报道分离出产紫
杉醇的内生真菌，且它们有着丰富的多样性。累计
研究结果表明，红豆杉组织中紫杉醇的含量与其种
属没有明显的相关性，而与红豆杉的产地和生态环
境密切相关 ¨。葛菁萍[1 、项勇等[1 曾分别报道
从东北红豆杉树皮中分离出产紫杉醇的链格孢属真
菌，而从南方红豆杉分离获得产紫杉醇的链格孢属
真菌国内尚未见报道。我们从生长在湖北地区的南
方红豆杉树皮中分离获得了产紫杉醇的链格孢，同
时暗示链格孢属真菌为红豆杉属植物的常见 内生
菌，含有紫杉醇生物合成酶系。本研究结果表明链
格孢属真菌的寄生特性与植物的种类有关，而与其
生长的地域性的关系不明显；而其产生紫杉醇的能
力是否也与宿主红豆杉生长的地理位置及其生态环
境存在相关性尚待进一步研究。
参考文献：
[1] Stierle A，Strobel G，Stierle D．Taxol and t㈣ e production by
Taxomyees and r~lulae。aIl endophytie fungus of pacifc yew[J]．
Sc／e／ts2~，1993，260(9)：214—216．
[2] Stierle A，Stierle D，Strobel G r Taxol production by a microbe
[P]．US patent 6013493，2000—01一l1．
[3] 周东坡，平文祥，孙建秋，周晓波，刘晓兰，张德柱，张建平，郑
喜群．紫杉醇产生菌分离的研究[J]．微生物学杂志，2001，21
(1)：18—23．
[4] 马玉超，赵凯，王世伟，张建 ，齐晓辉 ，周东坡．产紫杉醇内生
真菌的生物多样性[J]．菌物研究2003，1(1)：28—32．
[5] Wang J F，u G L，Lu H Y．Taxol from Tubercularia叩．strain
TF5，an endophytiefungus ofTaxusmairei[J]．FEMSMicrobiolo-
gY Letters．2000，193：249—253．
[6] Biolog MiemlogTM System，User Guide，Bolog Inc．，USA．
[7] White T J，Bruns T， S．Amplifcation and direct sequeneeing
offurI ribosomal RNA genes for phylogenetics[A]．In：Innins
M A，Gelf D H，Sninsky JJ，White T J eds．PCR Protocolsm[M]．
San Diego，Calif．Academic Pre88，1990．315—322．
[8] 陆悦健，Hollomon D W．由小麦赤霉病菌菌丝快速提取 DNA
用于 PCR扩增反应[J]．菌物系统，1997，16(1)：36—39．
[9] 杨莲茹，杨晓野，刘珍莲，考桂兰．少孢节丛孢菌 DNA提取及
18S rDNA基因序列扩增试验[J]．内蒙古农业 大学学报，
2003，24：41—44．
[10] 杭晓敏，杨虹．垃圾填埋场中厌氧真菌 18S rDNA的PCR扩增
及鉴定[J]．生物工程学报，2001，17(5)：515—519．
[11] 邱德有，黄美娟，方晓华，等．一种云南红豆杉内生真菌的分
离[J]．真菌学报，1994，13(4)：314—316．
[12] 戴芳澜，中国真菌总汇[M]．北京 ：科学出版社，1979．
[13] 朱旭祥，刘光明，傅美珍．红豆杉中紫杉醇含量与生态环境的
关系[J]．中草药，1997，28(增刊)：l7—20．
[14] Ge J P，PingW X，Zhou D P．Characterizationofa new speciesof
Taxol—producingfungus[J]．Nature，2004，2(1)：85—88．
[15] XliangY，Liu J，Lu A G，CuiI J X．Structure identifcation for
compound I separated and purified from taxoids-produced endo-
phytiefun#(A／ternar／a．a／ternata vat．taxi1011)[J]．JForestry
Res，2003，14(3)：217—220．
维普资讯 http://www.cqvip.com