全 文 ：植物科学学报　 ２０１３ꎬ ３１(６): ６１６~ ６２２
Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｊｏｕｒｎａｌ
　 　 ＤＯＩ:１０􀆰 ３７２４ / ＳＰ􀆰 Ｊ􀆰 １１４２􀆰 ２０１３􀆰 ６０６１６
东亚砂藓组织培养技术方法研究
张梅娟１ꎬ 沙 伟１ꎬ２∗
(１. 东北林业大学生命科学学院ꎬ 哈尔滨 １５００４０ꎻ ２. 齐齐哈尔大学生命科学与农林学院ꎬ 黑龙江齐齐哈尔 １６１００６)
摘　 要: 以东亚砂藓(Ｒａｃｏｍｉｔｒｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ)配子体为外植体ꎬ 比较了不同消毒液对消毒效果的影响ꎬ 对接种
消毒外植体的培养基进行了尝试性筛选ꎬ 并研究了蔗糖浓度对东亚砂藓配子体生长的影响ꎮ 结果显示ꎬ 将东亚
砂藓配子体用 ２％洗洁精溶液浸泡数分钟后ꎬ 再用 ０􀆰 ０２％的升汞处理 ４５~６０ ｓ的消毒效果最佳ꎻ 有机培养基是
无菌外植体接种的最佳培养基ꎻ ３％的蔗糖更有利于无菌外植体产生的原丝体团和幼嫩配子体的生长ꎮ
关键词: 东亚砂藓ꎻ 外植体ꎻ 消毒方法ꎻ 培养基ꎻ 蔗糖浓度
中图分类号: Ｑ９４３􀆰 １　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ２０９５￣０８３７(２０１３)０６￣０６１６￣０７
　 　 　 收稿日期: ２０１３￣０６￣０９ꎬ 修回日期: ２０１３￣１０￣０５ꎮ
　 基金项目: 国家自然科学基金资助项目(３１０７０１８０ꎬ ３１２７０２５４)ꎮ
　 作者简介: 张梅娟(１９８２－)ꎬ 女ꎬ 山东省海阳人ꎬ 博士研究生ꎬ 从事苔藓植物分子生物学研究( Ｅ￣ｍａｉｌ: ｚｈａｎｇｍｅｉｊｕａｎ＿００２＠
１６３􀆰 ｃｏｍ)ꎮ 沙伟(１９６３－)ꎬ 女ꎬ 黑龙江省齐齐哈尔人ꎬ 教授ꎬ 博士生导师ꎬ 研究方向为苔藓植物遗传学和分子生物学ꎮ
　 ∗通讯作者(Ａｕｔｈｏｒ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ􀆰 Ｅ￣ｍａｉｌ: ｓｈｗ１１２９＠２６３􀆰 ｎｅｔ)ꎮ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｒａｃｏｍｉｔｒｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ
ＺＨＡＮＧ Ｍｅｉ￣Ｊｕａｎ１ꎬ ＳＨＡ Ｗｅｉ１ꎬ２∗
(１. Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｈａｒｂｉｎꎬ １５００４０ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ
２. Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔｒｙꎬ Ｑｉｑｉｈａｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｑｉｑｉｈａｒꎬ Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇꎬ １６１００６ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｄｉｓｉｎｆｅｃｔａｎｔｓ ｏｎ ｅｘｐｌａｎｔｓ ｏｆ Ｒａｃｏｍｉｔｒｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ ｗｅｒｅ
ｓｔｕｄｉｅｄ ｈｅｒｅ. Ｓｕｉｔａｂｌｅ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｍｅｄｉａ ｗｅｒｅ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｔｅｎｔａｔｉｖｅｌｙꎬ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｕｃｒｏｓｅ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｎ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ｒ. ｊａｐｏｎｉｃｕｍ ｇａｍｅｔｏｐｈｙｔｅｓ ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ
ｔｈａｔ ａ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ０􀆰 ０２％ ＨｇＣｌ２ ｆｏｒ ４５－６０ ｓｅｃｏｎｄｓ ｗａｓ ｏｐｔｉｍａｌ ｆｏｒ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｆｒｏｍ
ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｏｆ ｇａｍｅｔｏｐｈｙｔｅｓ ｐｒｅ￣ｉｍｍｅｒｓｅｄ ｉｎ ２％ ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ ｆｏｒ ａ ｐｅｒｉｏｄ ｏｆ ｔｉｍｅ. Ｔｈｅ ｓｕｉｔａｂｌｅ
ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｓｔｅｒｉｌｅ ｅｘｐｌａｎｔｓ ｗａｓ ｏｒｇａｎｉｃ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ＭＳ. Ｐｒｏｔｏｎｅｍａｌ ｃｏｌｏｎｉｅｓ
ａｎｄ ｙｏｕｎｇ ｇａｍｅｔｏｐｈｙｔｅｓ ｔｈｅｎ ｇｒｅｗ ｗｅｌｌ ｗｈｅｎ ３％ ｓｕｃｒｏｓｅ ｗａｓ ａｄｄｅｄ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｒａｃｏｍｉｔｒｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍꎻ Ｅｘｐｌａｎｔｓꎻ Ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄꎻ Ｍｅｄｉｕｍꎻ Ｓｕｃｒｏｓｅ ｃｏｎ￣
ｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
　 　 苔藓植物是由水生向陆生过渡的植物类群ꎬ 是
现存高等植物中最原始的类群之一ꎬ 总数仅次于被
子植物[１]ꎮ 东亚砂藓(Ｒａｃｏｍｉｔｒｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ)属
紫萼藓科砂藓属(Ｒａｃｏｍｉｔｒｉｕｍ)ꎬ 生于低海拔地区
的岩面、 岩面薄土或沙土上ꎬ 广泛分布于中国的黑
龙江、 吉林、 辽宁、 河南、 江西等南北各省ꎬ 日
本、 朝鲜、 俄罗斯(西伯利亚东南)、 越南、 澳大
利亚等地也有分布[２]ꎮ 东亚砂藓在群落、 茎叶及
假根结构、 生理上都具有对旱生环境适应的特征ꎬ
为典型的小型耐旱藓类ꎬ 是较好的抗旱基因资源ꎬ
也是从基因水平上研究藓类植物耐旱分子机理的重
要实验材料ꎮ 然而从野外采集的藓类材料往往来源
于不同的母本ꎬ 给实验带来了不便ꎬ 通过组织培养
的方法可以获得均一、 优质化的藓类材料ꎬ 这是进
行分子试验的最佳选择ꎮ
苔藓植物是进行组织培养最先选用的材料[３]ꎬ
但在很长时间内的相关研究极少ꎬ 直到 ２０世纪 ５０
年代末才开始增加这方面的工作ꎬ 并取得了一定进
展[４]ꎮ 然而ꎬ 由于苔藓植物个体微小ꎬ 叶片一般
由单层细胞组成ꎬ 对其消毒很困难ꎬ 成功率低ꎻ 但
孢子外有一层孢子壁的保护ꎬ 消毒较易ꎬ 成功率
高ꎮ 所以苔藓植物组织培养的材料大多是通过孢子
培养获得的[５－９]ꎮ Ｄｕｃｋｅｔｔ等[１０]认为ꎬ 进行苔藓植
物组织培养时若没有获得孢子体ꎬ 配子体就可作为
外植体进行消毒培养ꎬ 以便获得配子体再生体系ꎮ
目前ꎬ 国内外已有一些成功报道ꎮ Ｓａｂｏｖｌｊｅｖｉｃ
等[８]用芦荟藓(Ａｌｏｉｎａ ａｌｏｉｄｅｓ)、 角齿藓(Ｃｅｒａｔｏ￣
ｄｏｎ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ)和垫丛紫萼藓(Ｇｒｉｍｍｉａ ｐｕｌｖｉｎａ￣
ｔａ)等几种藓类的茎尖作为培养物ꎬ 成功培育出了
配子体ꎮ Ａｈｍｅｄ 等[１１] 以 Ｃｒａｔｏｎｅｕｒｏｎ ｄｅｃｉｐｉｅｎｓ
的茎尖和叶片为原始培养物ꎬ 获得了无菌原丝体ꎬ
并成功得到了无菌配子体ꎮ 在国内ꎬ 高永超等[１２]
用牛角藓(Ｃｒａｔｏｎｅｕｒｏｎ ｆｉｌｉｃｉｎｕｍ)的幼嫩茎尖成功
获得了无菌材料ꎬ 并培养得到了疏松易碎的愈伤组
织ꎮ 李晓毓等[１３] 对尖叶匍灯藓 ( Ｐｌａｇｉｏｍｎｉｕｍ
ｃｕｓｐｉｄａｔｕｍ) 配子体进行了组织培养ꎬ 初步建立
了其再生体系ꎮ Ｃｈｅｎ等[１４]以暖地大叶藓(Ｒｈｏｄｏ￣
ｂｒｙｕｍ ｇｉｇａｎｔｅｕｍ)茎尖为试验材料ꎬ 研究了组织
培养的条件ꎬ 并获得了无菌原丝体ꎮ 目前ꎬ 国内外
还未见利用东亚砂藓孢子体或配子体作为外植体进
行组织培养的研究报道ꎮ 在野外采集中ꎬ 东亚砂藓
的孢子体很难采到ꎬ 故我们以东亚砂藓配子体为材
料ꎬ 通过对其消毒方法、 接种培养基和蔗糖浓度进
行探索研究ꎬ 以期建立成熟的东亚砂藓配子体再生
体系ꎬ 为苔藓植物生理生化和分子生物学研究提供
充足的纯正试验材料和奠定理论基础ꎬ 从而使苔藓
植物资源得到更好的开发利用ꎮ
１　 材料和方法
１􀆰 １　 材料
东亚砂藓(Ｒａｃｏｍｉｔｒｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ)配子体于
２００９年 ６月末采自黑龙江省五大连池老黑山ꎬ 采
集后用封口袋保存带回实验室ꎬ 放入培养箱中培养
(培养条件: ２０℃±１℃、 光照 １２ ｈꎬ 光强 ３０００ ｌｘ)ꎮ
凭证标本(２００９０６２７)存放于齐齐哈尔大学生命科
学与农林学院标本馆ꎮ
１􀆰 ２　 试验方法
１􀆰 ２􀆰 １　 培养基的配置
基本培养基为: ＭＳ＋０􀆰 ９％琼脂ꎻ 改良的 Ｂｅ￣
ｎｅｃｋ＋０􀆰 ９％琼脂ꎻ 改良的 Ｋｎｏｐ＋０􀆰 ９％琼脂ꎮ ｐＨ
值均调至 ５􀆰 ８~６􀆰 ２ꎮ
改良的 Ｋｎｏｐ培养基配方: Ｃａ(ＮＯ３)２􀅰４ Ｈ２Ｏ
１ ｇ / Ｌꎬ ＭｇＳＯ４􀅰７Ｈ２Ｏ０􀆰２５ ｇ/ ＬꎬＫＨ２ＰＯ４ ０􀆰 ２５ ｇ / Ｌꎬ
(ＮＨ４) ２ＳＯ４ ０􀆰 ５ ｇ / Ｌꎬ Ｚｎ ＳＯ４􀅰７Ｈ２Ｏ 微量ꎻ 改良
的 Ｂｅｎｅｃｋ培养基配方: ＮＨ４ＮＯ３０􀆰 ２ ｇ/ Ｌꎬ ＭｇＳＯ４􀅰
７ Ｈ２ Ｏ ０􀆰 １ ｇ/ Ｌꎬ ＫＨ２ＰＯ４ ０􀆰 １ ｇ/ Ｌꎬ ＣａＣｌ２ ０􀆰 １ ｇ / Ｌꎬ
ＦｅＳＯ４􀅰７Ｈ２Ｏ微量ꎮ
１􀆰 ２􀆰 ２　 消毒方法和接种培养基的筛选
选取长势较好的东亚砂藓配子体ꎬ 在自来水下
洗掉泥土杂物ꎬ 放入空培养瓶中ꎬ 用纱布盖好ꎬ 放
在水龙头下用自来水冲洗数小时ꎻ 用洗洁精浸泡
１０ ｍｉｎ左右(同时设置对照: 不用洗洁精溶液浸
泡)ꎬ 再于流水下冲洗 ３０ ｍｉｎ左右ꎬ 转入超净工作
台ꎬ 分别用 ７０％酒精、 升汞、 次氯酸钙溶液进行
消毒ꎬ 接种到不同培养基上ꎬ 形成多种组合ꎮ ７０％
酒精设置 ４ 个时间梯度 ( １０ ｓ、 ２０ ｓ、 ３０ ｓ、
４０ ｓ)ꎻ 升汞设置 ４ 个浓度 ( ０􀆰 ０１％、 ０􀆰 ０２％、
０􀆰 ０５％、 ０􀆰 １％)和 ４ 个时间梯度 ( １５ ｓ、 ３０ ｓ、
４５ ｓ、 ６０ ｓ)ꎻ 次氯酸钙设置 ４ 个浓度 ( ０􀆰 １％、
０􀆰 ５％、 １％、 ２％)和 ４ 个时间梯度(３０ ｓ、 ６０ ｓ、
９０ ｓ、 １２０ ｓ)ꎮ 各种消毒液消毒完后均于无菌水下
冲洗 ７~８次ꎬ 每次至少停留 １ ｍｉｎ以上ꎬ 尽可能洗
掉残留的液体ꎬ 减少对配子体的损害ꎮ 用刀片将外
植体切成 ５~１０ ｍｍ左右的小段ꎬ 分别接种于 １􀆰 ２􀆰 １
所述培养基上ꎬ 于培养箱中进行培养(培养条件:
２０℃±０􀆰 ２℃、 光照 １２ ｈ、 光强 ３０００~５０００ ｌｘ)ꎮ 每
个组合接种 １０瓶ꎬ 每瓶接种 １０个外植体段ꎬ 做 ３
次重复ꎮ 接种完后ꎬ 每天观察其情况ꎬ 记录污染个
数和死亡个数ꎬ 将未染菌的外植体段继代到新培养
基上继续培养ꎬ 每种组合需继代数次ꎻ １０ ｄ 后计
算其污染率、 成活率和死亡率ꎮ
１􀆰 ２􀆰 ３　 蔗糖浓度筛选
将无菌的外植体继代到 ＭＳ 与不同蔗糖浓度
(０、 １％、 ２％、 ３％、 ４％)组配的培养基上ꎬ 观察
不同蔗糖浓度对外植体生长状况的影响ꎮ
１􀆰 ３　 数据处理和分析
外植体的污染率、 成活率和死亡率[１５]计算公
式为:
污染率＝污染外植体数 /接种外植体数×１００％ꎻ
成活率＝返绿外植体数 /接种外植体数×１００％ꎻ
７１６　 第 ６期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 张梅娟等: 东亚砂藓组织培养技术方法研究
死亡率＝死亡外植体数 /接种外植体数×１００％ꎮ
用 ＳＰＳＳ １９􀆰 ０ 统计软件进行单因素方差分析
得出最佳方案ꎮ
２　 结果与分析
２􀆰 １　 不同消毒液和接种培养基对东亚砂藓配子体
的影响
试验结果显示ꎬ ７０％酒精处理的外植体无论接
种到何种培养基上都无污染ꎬ 随着培养时间的延长
均未见返绿现象ꎬ 所接种个体全部死亡ꎮ 说明
７０％酒精对东亚砂藓外植体的杀伤力特别大ꎬ 不适
合作为东亚砂藓的消毒液ꎮ 在后续结果分析不再考
虑此消毒液的影响ꎮ
洗洁精的主要成分是十二烷基苯磺酸钠ꎬ 是一
种表面活性剂ꎬ 能够使蛋白质变性ꎬ 起到一定的杀
菌作用ꎮ 试验结果表明ꎬ 未用洗洁精溶液浸泡的外
植体在接种到上述所有培养基上后第 ２天就有部分
染菌ꎬ 约 ３ ｄ后基本上全部染菌ꎻ 而用洗洁精溶液
浸泡过的外植体在 ３ ｄ后开始部分染菌ꎬ 说明洗洁
精对细菌起到了一定的抑制作用ꎮ
在以往的试验中ꎬ 消毒完的外植体一般接种于
某单一培养基上用于筛选最佳消毒方法ꎬ 但是无机
和有机培养基是否都可作为接种东亚砂藓消毒材料
的培养基并不知晓ꎬ 因此本试验对此进行了尝试性
的筛选ꎮ 结果发现ꎬ 用次氯酸钙和升汞处理的外植
体接种到改良的 Ｂｅｎｅｃｋ 和 Ｋｎｏｐ 培养基上ꎬ 在培
养到第 ６ 天时外植体染菌率很高ꎬ 为 １００％(图
１)ꎬ 在此基础上加大消毒液浓度和消毒时间ꎬ 也
得到同样结果ꎻ 而消毒时间太长、 消毒液浓度太高
时外植体则基本死亡ꎬ 故我们认为以改良的 Ｂｅ￣
ｎｅｃｋ和 Ｋｎｏｐ为基础的无机培养基不适合作为东
亚砂藓消毒外植体的接种培养基ꎮ 而接种到有机
ＭＳ培养基上的外植体染菌率相对较低ꎬ 当培养
１０ ｄ左右时发现ꎬ 无菌外植体基本不会再染菌ꎮ
故最终确定 ＭＳ培养基为接种东亚砂藓消毒外植体
的最佳培养基ꎮ
试验结果表明ꎬ 不同消毒液浓度和消毒时间对
接种到 ＭＳ培养基上外植体的影响是不同的ꎮ 次氯
酸钙因所含氯气很容易挥发ꎬ 对材料的毒害作用
小ꎬ 已成为苔藓植物组织培养材料常用的消毒剂ꎮ
但从本试验结果也可看出ꎬ 用次氯酸钙消毒ꎬ 当培
养到第 １０天时ꎬ 尽管外植体死亡率很低ꎬ 但污染
率极高ꎬ 达 ６０％以上(表 １)ꎬ 说明次氯酸钙不适
合作为东亚砂藓的消毒液ꎬ 故不做方差分析ꎮ 而升
汞的整体消毒效果较好ꎬ 用 ０􀆰 ０２％升汞处理 ４５~
６０ ｓ的外植体ꎬ 在第 １０天时存活率最高ꎬ 且差异
不显著ꎬ 污染率显著降低(表 ２)ꎮ 随着升汞浓度的
增加和处理时间的延长ꎬ 污染率和成活率显著降
低ꎬ 而死亡率显著升高ꎬ 甚至全部死亡ꎮ 所以东亚
砂藓的最佳灭菌方法是: 将外植体用 ２％洗洁精溶
液预先浸泡 １０ ｍｉｎꎬ 再用 ０􀆰 ０２％的升汞处理 ４５~
６０ ｓꎮ
２􀆰 ２　 蔗糖对东亚砂藓配子体的影响
蔗糖是藓类植物组织培养中最重要的碳源ꎮ 本
试验结果表明ꎬ 蔗糖浓度对东亚砂藓配子体的生长
产生了重要的影响ꎮ 无菌配子体在 ＭＳ与不同蔗糖
浓度(０、 １％、 ２％、 ３％、 ４％)组配的培养基上培
养约 ２０ ｄ时ꎬ 大部分开始返绿ꎬ 当蔗糖浓度为 ４％
图 １　 改良的 Ｂｅｎｅｃｋ培养基(Ａ )和改良的 Ｋｎｏｐ培养基(Ｂ)上东亚砂藓染菌状况
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ Ｒａｃｏｍｉｔｒｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ ｏｎ ｍｏｄｉｆｉｅｄ
Ｂｅｎｅｃｋ ｍｅｄｉｕｍ (Ａ) ａｎｄ Ｋｎｏｐ ｍｅｄｉｕｍ (Ｂ)
８１６ 植 物 科 学 学 报 第 ３１卷　
表 １　 次氯酸钙对东亚砂藓配子体的消毒效果(培养 １０ ｄ)
Ｔａｂｌｅ １　 Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｃａ(ＣｌＯ) ２ ｏｎ ｅｘｐｌａｎｔｓ ｏｆ Ｒ􀆰 ｊａｐｏｎｉｃｕｍ (ｃｕｌｔｕｒｅｄ １０ ｄ)
次氯酸钙(％)
Ｃａｌｃｉｕｍ ｈｙｐｏｃｈｌｏｒｉｔｅ
消毒时间(ｓ)
Ｄｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ
污染率(％)
Ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ ｒａｔｅ
成活率(％)
Ｓｕｒｖｉｖａｂｉｌｉｔｙ ｒａｔｅ
死亡率(％)
Ｄｅａｔｈ ｒａｔｅ
０􀆰 １
３０ １００􀆰 ００ ±０􀆰 ００ ０􀆰 ００ ±０􀆰 ００ ０􀆰 ００ ±０􀆰 ００
６０ １００􀆰 ００ ±０􀆰 ００ ０􀆰 ００ ±０􀆰 ００ ０􀆰 ００ ±０􀆰 ００
９０ ９６􀆰 ６７ ±１􀆰 １５ ３􀆰 ３３ ±１􀆰 １５ ０􀆰 ００ ±０􀆰 ００
１２０ ９３􀆰 ３３ ±１􀆰 １５ ６􀆰 ６７ ±１􀆰 １５ ０􀆰 ００ ±０􀆰 ００
０􀆰 ５
３０ ９４􀆰 ００ ±２􀆰 ００ ６􀆰 ００ ±２􀆰 ００ ０􀆰 ００ ±０􀆰 ００
６０ ９２􀆰 ６７ ±１􀆰 １５ ７􀆰 ３３ ±１􀆰 １５ ０􀆰 ００ ±０􀆰 ００
９０ ８８􀆰 ６７ ±１􀆰 １５ １１􀆰 ３３ ±１􀆰 １５ ０􀆰 ００ ±０􀆰 ００
１２０ ８３􀆰 ３３ ±３􀆰 ０６ １６􀆰 ６７ ±３􀆰 ０６ ０􀆰 ００ ±０􀆰 ００
１􀆰 ０
３０ ８４􀆰 ６７ ±１􀆰 １５ １５􀆰 ３３ ±１􀆰 １５ ０􀆰 ００ ±０􀆰 ００
６０ ７８􀆰 ００ ±２􀆰 ００ ２０􀆰 ００ ±２􀆰 ００ ２􀆰 ００ ±０􀆰 ００
９０ ７４􀆰 ００ ±２􀆰 ００ ２２􀆰 ６７ ±３􀆰 ０６ ３􀆰 ３３ ±１􀆰 １５
１２０ ７０􀆰 ００ ±２􀆰 ００ ２５􀆰 ３３ ±１􀆰 １５ ４􀆰 ６７ ±１􀆰 １５
２􀆰 ０
３０ ７５􀆰 ３３ ±２􀆰 ３１ ２０􀆰 ６７ ±１􀆰 １５ ３􀆰 ３３ ±１􀆰 １５
６０ ６８􀆰 ００ ±２􀆰 ００ ２７􀆰 ３３ ±１􀆰 １５ ４􀆰 ６７ ±１􀆰 １５
９０ ６０􀆰 ００ ±２􀆰 ００ ３１􀆰 ３３ ±１􀆰 １５ ８􀆰 ６７ ±１􀆰 １５
１２０ ５９􀆰 ３３ ±２􀆰 ３１ ３０􀆰 ６７ ±１􀆰 １５ １０􀆰 ００ ±２􀆰 ００
表 ２　 升汞对东亚砂藓配子体的消毒效果(培养 １０ ｄ)
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ＨｇＣｌ２ ｏｎ ｅｘｐｌａｎｔｓ ｏｆ Ｒ􀆰 ｊａｐｏｎｉｃｕｍ (ｃｕｌｔｕｒｅｄ １０ ｄ)
升汞 (％)
Ｍｅｒｃｕｒｉｃ ｃｈｌｏｒｉｄｅ
消毒时间(ｓ)
Ｄｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ
污染率(％)
Ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ ｒａｔｅ
成活率(％)
Ｓｕｒｖｉｖａｂｉｌｉｔｙ ｒａｔｅ
死亡率(％)
Ｄｅａｔｈ ｒａｔｅ
０􀆰 ０１
１５ ８８􀆰 ００ ±２􀆰 ００ ａ １２􀆰 ００ ±２􀆰 ００ ｈ ０􀆰 ００ ±０􀆰 ００ ｉ
３０ ７４􀆰 ６７ ±３􀆰 ０６ ｂ ２５􀆰 ３３ ±３􀆰 ０６ ｇ ０􀆰 ００ ±０􀆰 ００ ｉ
４５ ５４􀆰 ００ ±２􀆰 ００ ｃ ４６􀆰 ００ ±２􀆰 ００ ｅ ０􀆰 ００ ±０􀆰 ００ ｉ
６０ ４４􀆰 ００ ±３􀆰 ４６ ｄ ５６􀆰 ００ ±３􀆰 ４６ ｄ ０􀆰 ００ ±０􀆰 ００ ｉ
０􀆰 ０２
１５ ４３􀆰 ３３ ±１􀆰 １５ ｄ ５６􀆰 ６７ ±１􀆰 １５ ｃｄ ０􀆰 ００ ±０􀆰 ００ ｉ
３０ ２３􀆰 ３３ ±１􀆰 １５ ｅ ６６􀆰 ６７ ±１􀆰 １５ ｂ １０􀆰 ００ ±０􀆰 ００ ｈ
４５ １２􀆰 ００ ±４􀆰 ００ ｆ ７６􀆰 ００ ±６􀆰 ００ ａ １２􀆰 ００ ±０􀆰 ００ ｈ
６０ ６􀆰 ００ ±０􀆰 ００ ｇ ７６􀆰 ００ ±０􀆰 ００ ａ １８􀆰 ００ ±０􀆰 ００ ｇ
０􀆰 ０５
１５ １２􀆰 ６７ ±３􀆰 ０６ ｆ ６６􀆰 ００ ±２􀆰 ００ ｂ ２１􀆰 ３３ ±２􀆰 ３１ ｆ
３０ １２􀆰 ００ ±２􀆰 ００ ｆ ６０􀆰 ６７ ±１􀆰 １５ ｃ ２７􀆰 ３３ ±２􀆰 ３１ ｅ
４５ ２􀆰 ６７ ±１􀆰 １５ ｇｈ ４９􀆰 ３３ ±２􀆰 ３１ ｅ ４８􀆰 ００ ±２􀆰 ００ ｄ
６０ ２􀆰 ００ ±０􀆰 ００ ｈ ３２􀆰 ６７ ±３􀆰 ０６ ｆ ６５􀆰 ３３ ±３􀆰 ０６ ｃ
０􀆰 １
１５ １􀆰 ３３ ±１􀆰 １５ ｈ １４􀆰 ６７ ±４􀆰 １６ ｈ ８４􀆰 ００ ±４􀆰 ００ ｂ
３０ １􀆰 ３３ ±１􀆰 １５ ｈ １􀆰 ３３ ±１􀆰 １５ ｉ ９８􀆰 ００ ±２􀆰 ００ ａ
４５ ０􀆰 ００ ±０􀆰 ００ ｈ ０􀆰 ００ ±０􀆰 ００ ｉ １００􀆰 ００ ±０􀆰 ００ ａ
６０ ０􀆰 ００ ±０􀆰 ００ ｈ ０􀆰 ００ ±０􀆰 ００ ｉ １００􀆰 ００ ±０􀆰 ００ ａ
　 　 注: 同列数据后不同小写字母表示在 ｐ<０􀆰 ０５水平差异显著ꎬ 下同ꎮ
Ｎｏｔｅ: Ｍｅａｎｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｍａｌｌ ｌｅｔｔｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｃｏｌｕｍｎ ａｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｔ ｔｈｅ ０􀆰 ０５ ｌｅｖｅｌ􀆰 Ｔｈｅ ｓａｍｅ ｂｅｌｏｗ􀆰
时配子体则不返绿而褐化死亡ꎮ 随着培养时间的延
长(约 ４０ ｄ)ꎬ 可观察到 ２ 种生长情况: 在切口处
产生鲜绿的原丝体ꎬ 成团生长ꎻ 在叶腋处分化出新
的嫩绿配子体(图 ２)ꎮ 不添加蔗糖时ꎬ 所分化出的
原丝体和配子体生长状况最差ꎻ 当蔗糖浓度为 ３％
时ꎬ 原丝体团直径、 原丝体长度和分化出的配子体
数最大ꎻ 其余蔗糖浓度对其影响差异不大(表 ３)ꎮ
另外ꎬ 在本试验过程中发现ꎬ 部分无菌配子体
茎段周围会产生一种粉红色的细菌(图 ３)ꎮ Ｌｕｒｅｔｔａ
等[１６]曾从苔藓植物原丝体中分离出该种细菌ꎬ 并
认为是一种甲烷氧化菌ꎻ Ｈｏｒｎｓｅｈｕｈ 等[１７]在研究
葫芦藓原丝体发育时也发现有此菌ꎬ 且这种细菌在
少量分泌时会促进原丝体分化出芽体ꎮ 高永超
等[１２]报道ꎬ 在牛角藓的愈伤组织培养中分离出一
９１６　 第 ６期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 张梅娟等: 东亚砂藓组织培养技术方法研究
图 ２　 ＭＳ＋３％蔗糖培养基上东亚砂藓生长状况(Ａ: 原丝体ꎻ Ｂ: 配子体)
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｇｒｏｗｔｈ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ Ｒ. ｊａｐｏｎｉｃｕｍ ｏｎ ＭＳ ｍｅｄｉｕｍ ｗｉｔｈ ３％ ｓｕｃｒｏｓｅ
(Ａ: Ｐｒｏｔｏｎｅｍａｌ ｃｏｌｏｎｙꎻ Ｂ: Ｇａｍｅｔｏｐｈｙｔｅｓ)
表 ３　 蔗糖对东亚砂藓外植体生长的影响
Ｔａｂｌｅ ３　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｕｃｒｏｓｅ ｏｎ ｐｒｏｔｏｎｅｍａｌ ｃｏｌｏｎｙ
ｄｉａｍｅｔｅｒｓ ±ＳＤ ｉｎｄｕｃｅｄ ｆｒｏｍ ｇａｍｅｔｏｐｈｙｔｅｓ ｏｆ
Ｒ. ｊａｐｏｎｉｃｕｍ ｉｎ ｉｎｉｔｉａｌ ｃｕｌｔｕｒｅ
蔗糖(％)
Ｓｕｃｒｏｓｅ
原丝体直径(ｃｍ)
Ｐｒｏｔｏｎｅｍａ
ｄｉａｍｅｔｅｒ
原丝体长度(ｃｍ)
Ｐｒｏｔｏｎｅｍａ
ｌｅｎｇｔｈ
配子体数(个)
Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ
ｇａｍｅｔｏｐｈｙｔｅｓ
０ ０􀆰 ４８±０􀆰 ０２ｃ ０􀆰 ４３±０􀆰 ０３ｃ １􀆰 ６７±０􀆰 ５８ｃ
１ ０􀆰 ６８±０􀆰 ０２ｂ ０􀆰 ６６±０􀆰 ０２ｂ ５􀆰 ６７±０􀆰 ５８ｂ
２ ０􀆰 ７１±０􀆰 ０６ｂ ０􀆰 ６８±０􀆰 ０１ｂ ６􀆰 ００±０􀆰 ００ｂ
３ １􀆰 ０５±０􀆰 ０３ａ ０􀆰 ８６±０􀆰 ０２ａ １０􀆰 ６７±１􀆰 １５ａ
图 ３　 本试验中观察到的粉红色细菌
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｔｈｅ ｐｉｎｋ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
种粉色细菌ꎬ 初步认定为一种杆状菌ꎮ 周甜甜[１８]
在对毛尖紫萼藓(Ｇｒｉｍｍｉａ ｐｉｌｉｆｅｒａ)进行组织培养
时也分离出该粉红色的细菌ꎬ 但未鉴定ꎮ 本试验
所观察到的究竟是不是同一种菌ꎬ 尚待进一步
鉴定ꎮ
３　 讨论
植物组织培养成功的重要一步就是材料的消
毒ꎬ 苔藓植物也是如此ꎮ 由于苔藓植物茎、 叶仅
有一层或几层细胞组成ꎬ 消毒不彻底染菌率高ꎬ
消毒过度会褐化死亡ꎬ 因此选择合适的消毒液种
类、 浓度和消毒时间是关键ꎮ Ｓａｂｏｖｌｊｅｖｉｃ 等[７]发
现ꎬ 密枝尖喙藓(Ｅｕｒｈｙｎｃｈｉｕｍ ｐｒａｅｌｏｎｇｕｍ)茎尖
在次 氯 酸 钙 浓 度 为 ９％ 时 存 活 率 最 高 (为
６７􀆰 ５％)ꎮ Ｒｏｗｎｔｒｅｅ[８]在研究几种藓类植物的新
消毒方法时发现ꎬ 用 ０􀆰 ５％ ＮａＤＣＣ 对苔藓植物
的配子体消毒具有较好的效果ꎮ 郎玉卓等[１９]采用
正交法对大羽藓(Ｔｈｕｉｄｉｕｍ ｃｙｍｂｉｆｏｌｉｕｍ)消毒方法
进行了筛选ꎬ 结果显示最佳消毒方法为: ０􀆰 ５％
ＮａＣｌＯ＋０􀆰 ０５％ ＨｇＣｌ２消毒 ６０ ｓꎮ 梁红柱等[２０]认
为ꎬ 适度的 ＮａＣｌＯ溶液消毒外植体 ３０ ｓ 有利于大
叶藓 ( Ｒｈｏｄｏｂｒｙｕｍ ｒｏｓｅｕｍ) 配子体组织培养ꎮ
Ｃｈｅｎ等[１４]用 ０􀆰 １％的 ＨｇＣｌ２对暖地大叶藓的茎尖
消毒 ８ ｍｉｎ时存活率最高ꎮ 苔藓植物因长期生长于
野外ꎬ 茎段上所带杂菌较多ꎬ 容易使消毒不彻底ꎬ
Ｄｕｃｋｅｔｔ等[１０]曾用洗洁精作为表面活性剂对孢子体
进行消毒ꎬ 起到很好的作用ꎮ 本试验在消毒前加入
数滴洗洁精作为表面活性剂也得到了较好的效果ꎮ
本试验确定最佳消毒液浓度和消毒时间为: ０􀆰 ０２％
升汞消毒 ４５~６０ ｓꎮ 另外ꎬ 本试验除了从东亚砂藓
外植体的切口处得到原丝体外ꎬ 有些在叶腋处还直
接分化形成了配子体ꎬ 这与 Ｃｈｅｎ 等[１４]所得的结
０２６ 植 物 科 学 学 报 第 ３１卷　
果一致ꎮ
Ｂａｓｉｌｅ认为[２１]在进行苔藓植物的组织培养
时ꎬ 应至少尝试 ３ 种大量元素培养基以便挑选最
佳培养基ꎮ 不同苔藓植物对培养基质的要求是不
同的ꎬ 一直以来ꎬ 寻找每种苔藓植物的合适培养
基已成为研究的重点ꎮ 本试验选择 ＭＳ、 改良的
Ｋｎｏｐ、 改良的 Ｂｅｎｅｃｋ培养基用于东亚砂藓组培
的初始试验ꎮ 其中 ＭＳ 培养基为有机培养基ꎬ 改
良的 Ｋｎｏｐ 和 Ｂｅｎｅｃｋ 培养基为无机盐培养基ꎮ
经过一系列的试验发现ꎬ 消毒完的配子体接种到
无机盐培养基上时几乎所有材料都染菌ꎬ 而在有
机培养基 ＭＳ 上染菌率低ꎬ 生长状况较好ꎮ 分析
其原因可能是东亚砂藓所含基因及代谢机制不同
于其他苔藓植物ꎬ 存在一套独特的细胞分化机
制ꎬ 能在有机培养基上长势良好ꎬ 也可能是有机
物质调控了基因的表达ꎬ 抑制了其他有害菌的滋
生ꎬ 而促进了东亚砂藓配子体的生长ꎮ 目前ꎬ 还
未见有这种现象的相关报道ꎬ 有待进一步的深入
研究ꎮ
糖能为苔藓植物的生长提供碳源ꎬ 且对不同苔
藓植物的影响是不同的ꎮ Ｓａｂｏｖｌｊｅｖｉｃ 等[２２]指出果
糖能促进真藓(Ｂｒｙｕｍ ａｒｇｒｎｔｅｗｕｍ)原丝体的生长
和配子体的分化ꎬ 但抑制了波叶仙鹤藓(Ａｔｒｉｃｈｕｍ
ｕｎｄｕｌａｔｕｍ)的生长ꎮ Ａｈｍｅｄ 等认为[１１] １％蔗糖对
Ｃｒａｔｏｎｅｕｒｏｎ ｄｅｃｉｐｉｅｎｓ 配子体的生长起作用ꎬ 而
高浓度蔗糖(４％)会对配子体的生长产生负作用ꎮ
张楠等[２３]研究发现ꎬ 蔗糖对细叶小羽藓(Ｈａｐｌｏ￣
ｃｌａｄｉｕｍ ｍｉｃｒｏｐｈｙｌｌｕｍ)植株生长的促进作用不明
显ꎬ 并抑制原丝体的生长ꎮ 本试验中ꎬ 高浓度的蔗
糖会使东亚砂藓无菌配子体褐化至死亡ꎬ ３％蔗糖
对促进配子体分化出新的原丝体和配子体效果明
显ꎮ Ｓｍｅｅｋｅｎｓ等[２４ꎬ２５]提出ꎬ 糖类在植物的整个生
活史中有很重要的信号转导功能ꎬ 糖类信号控制基
因的表达ꎮ 因而ꎬ 在东亚砂藓组织培养过程中ꎬ 糖
类也很有可能参与了信号转导ꎬ 从而调控配子体的
生长ꎮ
总之ꎬ 本研究虽然从技术方面看并不十分复
杂ꎬ 却成功解决了以东亚砂藓配子体为试验材料消
毒难的问题ꎬ 该方法具有操作简单ꎬ 成本低ꎬ 省时
省力等优点ꎬ 可为其它苔藓植物组织培养提供一定
的参考ꎮ
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(责任编辑: 张 平)
２２６ 植 物 科 学 学 报 第 ３１卷