全 文 ：武汉植物学研究 2007，25(5)：462—466
Journal of Wuhan Bomnwal Research
甘草悬浮细胞的玻璃化法超低温保存研究
余 露，杨 英，李 硕，付春华，余龙江
(华中科技大学生命科学与技术学院，资源生物学与生物技术研究所 ，武汉 430074)
摘 要：以甘草悬浮细胞为材料，进行了超低温保存技术的研究。高产黄酮的甘草悬浮细胞是一种极具价值但又
难于保存的材料，为解决甘草细胞超低温保存中存在的关键问题，即如何减少渗透压的突然改变对细胞造成损伤，
通过优化预培养时间、细胞年龄、预处理时间、脱水时间、洗涤液蔗糖浓度等影响因素，建立了一套适合于甘草悬浮
细胞的保存方法。采用改良的2，3，5-氯化三苯基四氮唑(arc)法检测，此法存活率可达82．9％。将保存后的细胞
进行恢复培养，其恢复生长率可达80．4％。
关键词：甘草；悬浮细胞；玻璃化；超低温保存
中图分类号：Q943．1 文献标识码：A 文章编号：1000．470X(2007)05．0462—05
Studies叩 the Cryopreservation of Suspension Culture Cell in
Glycyrrhiza inflata Batal by Vitrifcation Approach
YU Lu，YANG Ying，LI Shuo， FU Chun-Hua， YU Long-Jiang
(Institute ofResource Biology and Biotechnology，ColegeofLife Science and Technology，Huazhong Universityof
Science and Technology，Wuhan 430074，China)
Abstract：A procedure had been developed for cryopreservation of Glycyrh~a inflata Batal suspension
cultures by vitrifcation．High flavonoid-yield G．inflata Batal suspension cultures are valuable materials
but hard to be preserved．The key point of this research is how to reduce the damage of cell caused by the
sharp change of pressure．So setting up a suitable method must depend on various important factors such
as the duration of regrowth，the harvest time，the duration of dehydration，the sucrose concentration of
washing solution．etc．Survival rate of G．inflata Batal suspension culture cel was 82．9％ by TYC exami-
nation．and regeneration rate reached to 80．4％ ．
Key words：Liquorice(Glycyrrhiza inflata Bata1)；Suspension culture cel；Vitrification；Cryopreserva-
tion
甘草(Glycyrhiza inflata Bata1)享有“中药之王”
的美誉，近年来，人们大量的采挖导致甘草资源的极
度匮乏 】¨。采用植物细胞大规模培养等现代生物
技术方法，科学利用甘草资源目益显示出优越性，可
以不受季节、地点限制，因而 日异受到人们重视。但
悬浮细胞的继代培养具有一定的变异性 ，每次传
代都有可能导致甘草有效成分含量下降，这使细胞
大规模培养应用受到阻碍，因此，需要减少传代次
数。将细胞系进行种质保存在一定程度上能够减少
传代次数，缓解细胞系的快速变异。
目前，植物种质资源长期稳定保存的最好方法
是液氮超低温保存法 。液氮环境下，活细胞内的
物质代谢和生长活动几乎完全停止，而 2O世纪 8O
年代才发展起来的玻璃化法是其中最简便易行的方
收稿日期：2007—02—13，修回13期：2007—04—30。
作者简介：余露(1984一)，女，硕士，研究方向为中药生物技术。
+ 通讯作者(E—mail：yulongjiang@mar1．hust．edu．cn)。
法之一 ’5 J。该法在保存过程中整个系统快速降温
使得植物材料中的液态水以玻璃化的形式存在，玻
璃态的物质结构与组分可长期不变，因而可长期保
存。与传统的方法相 比，玻璃化法不需要昂贵的程
序降温仪，操作简单且重演性好。1989年 Langis
等[6 和Uragami 相继证实了玻璃化法冻存植物材
料的可行性。
已有一些研究者根据不同植物材料之间的遗传
特性差异，优化冷冻条件，成功地保存了柑桔茎尖、
欧柑愈伤组织细胞等一百多种材料 ，但目前尚
未见到有关甘草种质保存的相关报道。我们以如何
减少渗透压的突然改变对细胞造成损伤为研究重
点，优化预培养时间、细胞年龄、预处理时间、脱水时
间、洗涤液蔗糖浓度等影响因素，以期建立起甘草悬
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第5期 余 露等：甘草悬浮细胞的玻璃化法超低温保存研究
浮细胞的超低温保存体系，为长期稳定保存高产甘
草细胞提供技术支持。
1 材料与方法
1．1 实验材料
胀果甘草(Glycyrhiza inflata Bata1)悬浮细胞
(由本实验室诱导)，采用改良MS液体培养基悬浮
培养，其中6-BA 0．5 mg／L、NAA 0．5 mg／L、2，4一D
0．5 mg／L，蔗糖 3O L，pH 6．0，培养温度 (25±
2)℃，连续光照16 h／d，光照强度2000 lx。
1．2 实验方法
1．2．1 细胞的保存
预培养：取不同年龄的悬浮细胞(分别培养 6、
1O、14、18、22、26 d)为实验材料，转至含有 6O L
蔗糖的改良MS液体培养基上，预培养不同天数(0、
1、2、3、4、5、6 d)，分别比较细胞的年龄及不同预培
养时间对超低温保存后悬浮细胞存活率的影响。
预处理：将预培养后的悬浮细胞取出，在 25％
玻璃化试剂 PVS2中处理不 同时间 (0、5、10、15、
20 min)。PVS2的成分参照Sakai等的配方 ¨。
脱水处理：将 25％ PVS2去除，加入预冷至 0~C
的 100％ PVS2，在0~C下脱水不同时间(0、5、10、15、
20 min)。
冷冻：将脱水后的悬浮细胞分装于7 mL冷冻管
中，装入新鲜 100％ PVS2，密度约为40％，然后将冷
冻管迅速投入液氮中。
化冻：悬浮细胞在液氮中保存 48 h后 ，取出冷
冻管，37~C水浴60 s内迅速化冻。
洗涤：用含有不同蔗糖浓度(O．4、0．8、1．2、1．6、
2．0 molfL)无激素 MS培养液洗涤冻后 的悬浮细
胞，室温下洗涤 3次，每次 10 min。
1．2．2 细胞存活率的检测
活力测定采用文献L】 中报道的改良2，3，5一氯
化三苯基四氮唑(，I，I’C)法。
标准曲线的绘制：吸取0．25 mL 0．4％，I，I’C溶液
至10 mL容量瓶，加少许低亚硫酸钠粉末，摇匀后立
即产生红色的三苯基甲唑(TF)。再用丙酮定容至
刻度，摇匀。然后 分别取此液 0．25、0．5、1、1．5、
2 mL置 10 mL容量瓶中，用丙酮定容至刻度，即可
得到含 TF25、50、100、150、200 L的标准比色系
列，以空白做对照，485 nm测吸光度，绘制标准曲
线。以吸光度 与 TF浓度 C做回归处理，得 回归
方程 T=0．0032C一0．0037，线性 相关 系数 r2=
0．9998。
脱氢酶活性的测定：取一定量鲜重细胞，加入
0．4％TIC溶液，37~C保温 1 h，加入少量硫酸以停止
反应。将细胞取出，加丙酮一起磨碎，以抽提出TF，
加入离心管，再倒少量的丙酮将剩余的 TF全移人
试管，加丙 酮定容 至 5 mL，离 心。取上 清液 至
485 nm分光光度计下比色，查标线，测得 ，I，I’c还原
量。
脱氢酶的活性 =还原，I，I’C(txg)／[反应时间(h)
×样品总量(g)]
存活率的计算：存活率 =保存后脱氢酶活性／保
存前脱氢酶活性 ×100％
2 结果与分析
2．1 甘草悬浮细胞的年龄对存活率的影响
植物细胞的抗冻能力与细胞的分裂和生长活动
等各种生理状态有密切关系-】 ，我们取不同年龄的
甘草悬浮细胞为材料，考察了悬浮细胞的培养时间
对甘草冻后存活率的影响。
从图 1可以看出，培养了4 d的细胞活性 比较
低，用 Trc法测存活率仅为 59．3％。细胞继续培
养，在第 10 d时达到一个最高值，存活率为79．8％。
但是随着细胞年龄的增加，细胞的存活率呈现一个
不断下降的趋势，原因可能是因为生长了10 d细胞
处于指数生长期，这个时期的细胞冻存后保持分裂
能力的细胞密度比较大，并且大部分细胞体积较小、
细胞质浓度高、壁较薄、无液泡，这类细胞比含有液
泡、壁厚的细胞更耐冻。
图 1 细胞的不同培养时间对甘草悬浮细胞玻璃
化冻存后存活率的影响
Fig．1 Effects of diferent time of culture on the
survival rate of Glycyrrhiza inflata Bat．suspension
cultum cell cryopreserved by vitrification
2．2 预培养时间对甘草悬浮细胞存活率的影响
预培养的目的是提高分裂细胞的比例，减少细
胞内自由水含量，增强细胞对低温的抗性。常用的
预培养方法有高渗处理和低温锻炼等 。我们采
用高渗处理，即将悬浮培养 的甘草细胞在含有
鲫 ∞
∞一日 一日 一 =∞ |lJl^ d
一 一瓣魍接|) ．L
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武 汉 植 物学 研 究 第25卷
60 g／L蔗糖的改良MS培养基上悬浮培养数天，以
减少细胞内的含水量，达到提高存活率的目的。
从图2可看出，没有经过预培养的悬浮细胞，
细胞活性非常低，恢复生长的状态也很差，存活率
仅为22．6％，而经过含有60 g／L蔗糖的改良MS培
养基培养后，悬浮细胞的存活率有所上升，培养2 d
时的效果最好，存活率为79．8％，随着预培养时间
的增加，存活率有所降低，原因可能是因为渗透压
过大，不利于悬浮细胞的生长，导致冻后细胞活性
的下降。
预培养时间 (d)
Time of prectdture
图 2 不同预培养时间对甘草悬浮细胞玻璃
化冻存后存活率的影响
Fig．2 Efects of diferent time of preeulture on the
survival rate of￡infl,~ Bat．suspension culture
cel c~opreserved by vitrifcation
2．3 预处理时间对悬浮细胞存活率的影响
为了进一步降低悬浮细胞含水量，在玻璃化脱
水处理前还需要采用一个过渡性的预处理阶段。预
处理的作用是增加保护性成分向细胞渗入，减缓细
胞在脱水时的损伤，有利于提高冻后存活率 。我
们采用 25％ PVS2对悬浮细胞在室温下进行预处
理，比较不同预处理时间对悬浮细胞存活率的影响。
从图3可以看出，甘草悬浮细胞在 10 rain的预
处理中获得较大的存活率，达79．8％。预处理时间
少于 10 min，由于过渡时间过短而未能完全达到缓
冲的作用，材料不易存活；超过 10 min，则由于溶液
+
+ j +
毫 l
重 蠹 §l
毪
0 5 10 15 2O
预处理时间(mi n)
Time of Loading with 25％ PVS2
图 3 25％玻璃化试剂对甘草悬浮细胞处理
不同时间对其冻后存活率的影响
Fig．3 Ef ects of diferent time of loading with 25％
PVS2 on the survival rate of G．inflata Bat．suspension
culture cel c~opresed by vitrifcation
对材料 的毒 害而使成 活率又有所 下降。因此，
10 min的过渡时间最合适。
2．4 玻璃化试剂脱水时间对悬浮细胞存活率的影响
100％ PVS2处理的目的是脱去材料中过多的
水分，使材料能够完全达到玻璃化，并使冷冻保护液
渗入细胞，减轻在超低温保存过程中细胞所受到的
伤害。脱水时间的长短起着至关重要的作用，实验
发现，温度越低 PVS2的毒性越小，当处理温度低于
0o(=时，液泡会形成晶体而对细胞造成损伤，因而最
适宜在 0o(=用 PVS2处理。
从图4中可以看出，甘草悬浮细胞在 PVS2溶
液中脱水处理 l0～15 min，具有较高的存活率，为
79．8％ ～82．9％，脱水时间少于 10 min，则材料的脱
水程度不够，在降温过程中不能迅速达到玻璃化的
状态，因而不易成活，脱水时间超过 15 min，PVS2对
材料的化学损伤增加，因而存活率也会有所下降。
0 5 10 1 5 20
脱水时间(min)
Time of treatment with PVS2
图 4 玻璃化冷冻保护剂脱水不同时间对甘草悬浮
细胞玻璃化冻存后存活率的影响
Fig．4 Ef ects of diferent time of treatment with PVS2
on the survival rate of G． Bat．suspension
culture cel e~opreserved by vitrification
2．5 洗涤液蔗糖浓度对悬浮细胞存活率的影响
解冻后残留于细胞内外的冰冻保护剂仍对细胞
有毒害作用，会影响细胞的恢复和生长 引，因此，必
须采用含有一定浓度蔗糖的改良MS培养液对细胞
进行洗涤。这一过程不但可以除去高含量保护剂对
细胞的毒性，而且也是一个以防渗透压的突变对细
胞产生损伤的过渡过程。
从图 5可以看出，蔗糖浓度以 1．2 molfL为最
佳，过高或过低都不利于细胞的恢复。原因可能是
因为蔗糖浓度过低，使得清洗液的渗透压过低，细胞
由于膨胀而受到伤害，蔗糖浓度过高导致清洗液的
渗透压过高，从而使得细胞脱水死亡。
2．6 保存后细胞的恢复培养
将经过玻璃化法保存的细胞接种于固体 MS培
养基上，观察其恢复生长的状态，与对照进行比较。
从图6可以看出，保存后恢复生长的细胞与对
∞ ∞ ∞ ∞ ∞ ∞
∞葛 1^^Jns ulI-L
一0／0)瓣妲雉uLI．IJ
∞ ∞ ∞ ∞ ∞ O
∞ 1^Ens ulI-L
一0／0)瓣妲雉u IL
如∞ ∞∞∞∞∞ O
∞lB 1^Ens ulI-L
(0／0】瓣妲站ulLL
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第 5期 余 露等：甘草悬浮细胞的玻璃化法超低温保存研究
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图 |l ＼-
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蔗糖浓度 ftool／L】
Sucrose concentration
图 5 蔗糖浓度对甘草悬浮细胞玻璃
化冻存后存活率的影响
Fig．5 Efiects of sucrose concentration on the SUrvival
rate of G．irqTata Bat．suspension culture
cel cryopreserved by vitrification
图 6 保 存前正常生长细胞 (A)与
保存后恢复生长细胞 (B)对照图
Fig．6 Comparison between normal growing ceils(A)
prior to cryopreservation and regrowing
ceils(B)post cryopresen，ation
照相比在状态上并无明显差异，但存活率要略低于
正常生长的细胞，这可能是因为玻璃化保存过程对
细胞造成了损伤。
3 讨论
细胞的超低温技术保存实际上涉及3个过程：
一 是细胞的预冻；二是细胞在 一196~C的环境中长期
保存；三是细胞的化冻与再培养。正如前文中提到
的，在一196~C环境下，活细胞内的物质代谢和生长
活动几乎完全停止，所以，活细胞是安全的。如果细
胞在保存后有所死伤，那么一定是发生在预处理和
冷冻、化冻的过程中，与保存在液氮里的时间长短没
有相关性 J。
玻璃化法进行超低温保存，对实验材料有很高
的要求。在预实验中，也尝试用固体培养基上的愈
伤组织进行超低温保存，遇到了重复性差的问题，可
能是因为生长在固体培养基上的愈伤组织，接触培
养基的部分生长充分 ，而远离培养基的部分生长比
较缓慢，使得细胞的生长不均匀。悬浮培养则能解
决这个问题，使处于悬浮培养体系的细胞状态均一，
是用于玻璃化低温保存材料的好方法。
本文从预培养时间、细胞年龄、预处理时间、脱
水时间、洗涤剂中蔗糖的浓度等 5个方面对超低温
保存甘草悬浮细胞的效果进行了探讨。结果显示，
选取 10 d龄的甘草悬浮细胞在含有 6O g／L蔗糖的
MS液体培养基上预培养2 d，室温下 25％ PVS2预
处理 10 min，0~C条件下 100％ PVS2脱水 15 min，投
人液氮保存，48 h后再 37~C水浴迅速化冻，用含有
1．2 mol／L蔗糖的MS培养基洗涤 3次，每次10 min，
采用 红 氯 四氮 唑 (Trc)法 检 测，存 活率 可 达
82．9％。并且，融化后有活力的细胞并不一定能恢
复生长 ，因此，我们在此实验结果的基础上对保
存后的细胞进行 了恢复培养，其恢复生长率 (保存
前后细胞干重 比)也达到 80．4％，进一步验证了用
玻璃化法保存甘草细胞是可行的。
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