全 文 ：武汉植物学研究 2007，25(3)：217—221
Journal oi"Wuhan Botanical Research
基因枪介导小麦成熟胚遗传转化的影响因素
丁莉萍，高 莹，李圣纯，汪 成，汪越胜，何光源
(华中科技大学中英 HUST．RRes基因工程和基因组学联合实验室，武汉 430074)
摘 要：小麦成熟胚作为转化受体可克服小麦幼胚存在的受季节和幼胚发育阶段限制的缺点。以湖北省小麦品种
‘鄂麦 12’和模式品种‘Bobwhite’为材料，成熟胚为转化受体，优化基因枪转化法的轰击压力、轰击距离、选择剂等
因素，建立以小麦成熟胚为转化受体的高效转化系统。结果表明：小麦成熟胚作为转化受体时，适宜轰击压力和轰
击距离组合是900 psi、6 em；成熟胚对选择剂 G418的敏感性强于幼胚，轰击后需要延长恢复时间，选择剂 G418的
适合浓度为2O一40 mg／L。在以上优化条件下小麦成熟胚转化频率达0．3％一0．9％，已初步建立基因枪介导的小
麦成熟胚遗传转化系统。
关键词：小麦 ；成熟胚 ；遗传转化
中图分类号：Q943 文献标识码：A 文章编号：1000·470X(2007)03—0217—05
Study on Influencing Factors of M ature Embryos
of W heat by Particle Bombardment
DING Li-Ping，GAO Ying，LI Sheng-Chun，WANG Cheng，WANG Yue-Sheng，HE Guang-Yuan’
(China—UK HUST-RRes Genetic and Genomics Jiont Laboratory，Hnazhong Un~rsity of
Science＆Technology，Wuhan 430074，China)
Abstract：Mature embryos of wheat as explan~ have many advantages for transformation．They can over．
come some of the immature embryos’disadvantages。which is difficult to obtain throu out the year and
strictly limited by their suitable stage for culture．Mature embryos of wheat from cultivar EM12 in Hubei
province an d mode varietv Bobwhite were used as target mateHals．The efects of bombardment pressure．
bo mbardment distance。geneticin etc．on mature embryos of wheat by particle bombardment have been op．
timized in order to obtain a high~equency of plant tran sformation system．Th e results show that optimal
values of bo mb ardment parameters were found to be a bo mbardment pressure of 900 psi at a distance of
6 am for mature embryos．Mature embryos were more sensitive to genetlcin G4 1 8 than immature embryos．
and they had to be grown for longer time before application of the selectant．The optimal selective concen．
tration of G4 1 8 for mature emb ryos iS 20—40 mg／L．Under these optimum conditions．the~equency of
transform ation for mature embryos of wheat was up to 0．3％ 一0．9％ ． e transform ation system of mature
wheat emb ryos using particle bo mbardment has been set up preliminarily．
Key words：Wheat(Tdt&um aestivum L．)；Mature embryos；Transformation
小麦(Tdt&um aestivum L．)是重要的粮食作物
之一，基因工程技术已发展成为其遗传改良的重要
手段。自Vasil等首次报道利用基因枪法获得 gus
和 bar基因的转基因植株以来⋯，基因枪法已广泛
应用于小麦的遗传改良，已成功获得抗病、优质、雄
性不育的转基因小麦 。 。以往通常采用幼胚作为
转化受体，但幼胚具有受季节和时间限制、难以重复
试验的不足。而小麦成熟胚则能克服幼胚的缺点，
具有取材方便，周期短，不同个体问生理状态相似，
实验重复性强等优点 ，有望发展成为较理想的转
化受体。小麦以成熟胚为外植体进行植株再生的报
道已有不少_o J，但以成熟胚为转化受体获得转基
因植株的例子尚未见报道。我们在已建立的小麦成
熟胚高频植株再生系统的基础上 J，以湖北省主栽
品种‘鄂麦 l2’和模式品种‘Bobwhite’为材料，以成
熟胚为转化受体，优化基因枪转化法的轰击压力、轰
击距离、选择剂等因素，旨在建立以小麦成熟胚为转
化受体的高效转化系统。
收稿13期：2006—10-27，修回13期：2006—11-23。
基金项目：国家重点基础研究发展计划(973计划)(2002CBI11302)资助。
作者简介：丁莉萍(1979一)，女，博士研究生，从事小麦遗传转化和分子生物学研究(E-mail：dip—tracy@sohu．com)。
· 通讯作者(E-m~il：helD@mail．hust．edu．cn)。
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218 武 汉 植 物 学 研 究 第25卷
1 材料与方法
1．1 材料
植物材料 转化受体品种为湖北省小麦(Triti—
tun aestivum L．)品种‘鄂麦 12’和遗传转化的模式
品种‘Bobwhite’(由英国洛桑研究所的Peter Shewry
教授提供)。
质粒 应用基 因枪法将含有 目的基 因 (如
1Axl5)、报告基因(如 gus)、选择基因(如 npt I)的
不同质粒共转化小麦的研究较多 ’1oJ，也有将上述
单个基因导人小麦的研究报道 J。本研究用于
转化的质粒 pCal—neo，只含有选择标记基因 聊。基
因 (编码新霉素磷酸转移酶 NPTⅡ)，由CaMV35S
启动子所驱动，全长4630 bp(图 1)。
H BN HB E
35s promoter Adh1 intron Deo Nos terminator
B，BamH I；E，EcoR I；H，H／ndⅢ ；N，Nco I
图 1 质粒 pCal-neo酶切图谱
Fig．1 The restriction endonuclease of pCal—neo
1．2 方法
1．2．1 受体材料的准备
成熟胚 ：取颜色、大小一致的小麦种子 ，0．1％
Hgcl 消毒 10 min左右，无菌蒸馏水洗涤3次，放置
在无菌装有吸水海绵的平皿中，25~C黑暗培养 12 h，
使种子吸胀露白。次 13，再将种子进行消毒处理。
70％乙醇消毒 5 min，无菌蒸馏水洗涤 1—3次，再用
0．1％ HgC1 消毒 1O一15 min，无菌蒸馏水漂洗
3—5次，将消毒好的种子置于无菌空皿中，剥取成
熟胚，直径 9 cm培养皿平均每皿 20—3O个完整胚。
幼胚：取供试小麦开花后 12—17 d的幼嫩种
子。用70％乙醇消毒30 S，无菌蒸馏水洗涤 1次，再
用 0．1％的 HgCI 消毒 6 min，无菌蒸馏水漂洗 3—5
次。在超净工作台上剥离盾片，盾片组织向上放人
诱导培养基中，9 cm培养皿平均每皿 3O一4O个盾
片。
成熟胚、幼胚轰击之前分别在 25~C、黑暗条件
下在诱导培养基上预培养 3—5 d和 1—2 d。预培
养可以使外植体在被基因枪轰击前从分离过程中得
到恢复，并且若有任何污染可以在轰击前被检测到。
1．2．2 基因枪转化法
将 1 g／ L质粒 pCal-neo包裹在直径 0．6 m
金粉微粒上，采用 PDS-1000／He system基因枪(美
国BIO—RAD公司生产)轰击靶材料。每个处理质粒
和金粉的使用量为5 g／mg，每个处理轰击 8枪 ，即
每枪的质粒和金粉用量为0．625 Ixg／125 P．g。每皿
轰击 1次。同时设计了轰击压力为 900、650 psi，轰
击距离为3、6、9 cm共 6个组合对基因枪转化效果
的影响。
1．2．3 轰击后材料的培养、选择及植株再生
基因枪轰击后 的材料分别置 于诱 导培 养基
MSSP，(成熟胚)和 MSSP (幼胚)上 ¨，诱导出愈伤
组织，每2周继代 1次。以G418作为 r／．eo基因的选
择剂，G418浓度设置为 2O、3O、4O、50 mg／L共 4个
处理。将恢复培养后的愈伤组织转至含 G418的诱
导培养基上，筛选出抗性愈伤组织。然后在含 G418
的分化培养基 R。 上筛选出抗性芽苗。待壮苗后转
入不添加 G418的生根培养基 R 上进行生根培
养，当幼苗长至 6—8 cm时炼苗盆栽。各培养基成
分详见表 1。
表 1 诱导、分化培养基成分
Table 1 The component of induction．regeneration
c~ture medium
茎Cu lture —or储存a l液_i cruStge qid oo L medjm ⋯一
MSMaCFOSa】ts(1O×) 10omL
LMicrosalts(1000×) 1 mL
MS FeNaEDTA (100 x 1OmL
MS(一Gly)Vitamins(1000×) 1 mL
诱导培养基 Myo Inositol 100 mg
‘ )=0r 3从(25 20 mL
sucro6e 30 g
Hormones Picloram(1．0 mg for
mature embryos cul—
ture and 2．0 mg for
immature embry08一cu1一
ture)
L7 Macrosalts(1O×) 100mL
L Microsalts(1000×) 1 mL
分化培养基 Ms FeNaEDTA(10o ) lO L
RDz Vitamirts／Irtositol L(200 x) 5 mL
Maltose 30 g
H0nn0nes 2．4
．
-
．
D 0·1 mg+
注：调节 pH值为5．7o+，如果依次加入3种氨基酸，分别为：
L一谷氨酰胺 1．5 g，L-脯氨酸0．3 g，L-天冬酰胺 0．2 g。
Notes：pH adjust 5．7． +，If adding 3AA separately：L-Glutamine
1．5 g，L—Proline 0．3 g，L—Asparagine 0．2 g．
1．2．4 转基因植株的鉴定
用 CTAB法提取总基因组 DNA做模板，进行
PCR扩增。iteo基因上游引物序列为：5’一GAG GCT
A1r CGG CTA TGA CTG-3’；下游引物序列为：5’一
ATC GGG AGC GGC GAT ACC GTA-3’．扩增的产物
为679 bp的ir／eo基因片段。每个反应体积为20 ，
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第 3期 丁莉萍等：基因枪介导小麦成熟胚遗传转化的影响因素 219
上游引物和下游引物含量为20 pmol，4种 dNTP混
合物的量为：250 p~mol，2 ixL 10×Taq酶缓冲液，
1．5 mmol MgC1，，1U的 Taq酶(Takana产品)。PCR
的程序：(1)95℃ 5 rain；(2)95℃ 1 rain，57~C 30 S，
72oC 1 min，30个循环；(3)72℃ 10 min。取PCR产
物 5 L在 1．O％的琼脂糖凝胶电泳分离并观察。
2 结果与分析
2．1 不同轰击压力和轰击距离对小麦成熟胚转化
效果的影响
基因枪轰击压力和轰击距离是影响转化效率的
重要因素。以湖北省小麦品种 ‘鄂麦 12’为转化品
种，成熟胚 和幼胚 为转化受体，根据 以往研究结
果 ·H’ 】，选择轰击压力为900、650 psi，轰击距离为
3、6、9 am。综合不同选择剂处理的实验结果，分析
各轰击压力、轰击距离参数组合对小麦成熟胚转化
效果的影响(见表2)。
表 2 不同轰击压力和轰击距离对小麦成熟胚和
幼胚的转化效果
1址 le 2 The transformation efects of di岱erent combination of
bomb ardment pressure and distance On mature emb ryos and
immature embryos of wheat
轰击压力和距离 接种数 抗性愈伤组织 抗性愈伤组织
转
l~化受体 。 )of 鐾 l — r⋯An⋯tq C
D
o
res
mb
s
i
u
n
re
atio
arI
n
d
of
in0cu． resi arIt alli resis t uds
d／stance lation aquired produced
轰击后的小麦成熟胚和幼胚均能诱导出抗性愈
伤组织。与幼胚相比，成熟胚形成愈伤组织的时间
较长，形态多为乳白色，水浸状，胚性差。从表 2可
以看出，以成熟胚为转化受体，轰击参数为900 psi+
6 am时的抗性愈伤组织获得率为 27．6％，绿苗率为
19．8％，均比其它参数组合高；此外，以幼胚为转化
受体，轰击压力为900 psi+9 am的抗性愈伤组织获
得率为 35．3％，绿苗率为29．2％，比其它参数组合
转化效果好。
2．2 选择剂 G418对小麦成熟胚转化的选择效果
本试验所用的选择标记基因是 neo基因，其在
真核细胞中的表达产物能使卡那霉素、新霉素及
G418失活。Nehra等 和 Bower等 ¨认为卡那霉
素作为选择剂并不适合小麦转化子的筛选，因为它
会妨碍愈伤组织在早期阶段的再生能力，并对叶绿
素合成有抑制作用。因此，本研究探索 G418作为
选择剂的选择效果。
小麦成熟胚和幼胚经基因枪轰击后，诱导出愈
伤组织，每 2周继代 1次，分别在含有 2O、3O、4O、
50 mg／L G418的选择培养基中进行转化子筛选；以
未经基因枪轰击的成熟胚和幼胚所诱导的愈伤组织
作为对照。综合不同轰击参数下的实验结果，比较不
同浓度的 G418对小麦成熟胚转化效果的影响，结
果 n尢图 2。
口转化材料 Positive materials一刈 料Negative materials
1000 100．0 1000
A 3
7 1 1
_— —
48．2
_ _— —
： I
2O 3O 4O 5O
选择剂G418浓度 (mg／L)
The concentration of geneticin G4 1 8
100 0
B ● 8I )5
— —
50．2 51．9
，
．f ●
2O 3O 4O 5O
选择剂G418浓度 (mg／L)
The concentration ofgeneticin G4 1 8
图 2 小麦成熟胚 (A)和幼胚(B)愈伤组织在
含 G418选择培养基上的生长受阻率
Fig．2 The frequency between normal and abnormal
emb ryogenic calli of mature embryos (A)and
immature emb~os (B)cultured on medlLIm
containing geneticin G418
从图2可以看出，G418浓度为 20 mg／L时，小
麦成熟胚和幼胚的转化材料、对照材料(未经轰击
的材料)生长受阻率分别 为 7．5％、23．1％ 和 0、
9．3％，即成熟胚对 G418敏感性强，在低浓度选择
时成熟胚转化材料立即出现受抑制现象，而幼胚转
化材料生长未受到抑制。随着 G418浓度增加至
30 mg／L时，成熟胚反应强烈，转化材料受阻率增加
为48．2％，对照材料致死率 83．6％，只有少数存活；
而幼胚仅有 18．6％的转化材料生长受抑制，对照材
料受阻率增加为50．2％。当 G418浓度为 40 mg／L
0 O 0 O 0 O
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