全 文 ：武汉植物学研究 2001, 19 (2) : 149～ 152
J ourna l of W uhan B otan ica l Resea rch
一种紫菜多糖的制备及
对淋巴细胞生长的影响Ξ
张伟云1　刘宇峰1　陈　颢2　谭仁祥2　侯亚义1
(1. 南京大学医学院, 南京　210093; 2. 南京大学生命科学学院, 南京　210093)
摘　要: 用D EA E2纤维素和 Sephadex G2200 柱层析法分离纯化条斑紫菜的热水提取物, 从
中得到多糖 PY2, 并测出其分子量为 2. 0×104。用紫外和红外光谱对 PY2 的性质进行了鉴
定。进一步测定了 PY2 对体外培养的小鼠骨髓细胞及淋巴细胞生长的影响。结果表明, PY2
是一种少见的紫菜多糖, 它不含有大多数紫菜多糖具有的 3, 62内醚2半乳糖和硫酸基, 它对
小鼠脾脏淋巴细胞、胸腺淋巴细胞以及混合淋巴细胞的增殖有一定的抑制作用, 而对骨髓细
胞的增殖没有明显的影响。
关键词: 多糖; 条斑紫菜; 淋巴细胞生长
　　中图分类号: Q 946; R 967　文献标识码: A 　文章编号: 10002470X (2001) 0220149204
Prepara tion of Polysacchar ide from P orp hyra yezoens is
Ueda and Its Effects on Growth of L ym phocytes
ZHAN G W ei2Yun1, L IU Yu2Feng1, CH EN H ao 2, TAN R en2X iang2, HOU Ya2Y i1
(1. M ed ica l S chool, N anj ing U n iversity , N an jing　210093, Ch ina;
2. D ep artm en t of B iolog ica l S cience and T echnology , N anj ing U n iversity , N an jing　210093, Ch ina)
Abstract: T he pu rif ied po lysaccharide PY2 w as ob ta ined by D EA E2cellu lo se
and Sephadex G2200 co lum n ch rom atography from P orp hy ra y ez oensis. T he
average mo lecu lar w eigh t w as determ ined to be 210×104 by u sing co lum n ch ro2
m atography. PY2 w as also iden t if ied by UV and IR spectra. T he resu lts
show ed that PY2 is a k ind of infrequen t po lysaccharide from P orp hy ra , w h ich
cou ld inh ib it the p ro lifera t ion of m u rine sp leen cells, thym u s cells and m ixed
lymphocyte react ion. T here w ere no dist inct effects of PY2 on bone m arrow
cells.
Key words: Po lysaccharide; P orp hy ra y ez oensis; L ymphocyte p ro lifera t ion
多糖是重要的生物大分子物质, 在生命现象中参与细胞的各种活动, 因其具有多种
多样的生物功能, 近年来人们对它的各种生理、药理作用很感兴趣, 多糖作为免疫调节剂,Ξ 收稿日期: 2000205219, 修回日期: 2000207231。基金项目: 中国科学院海洋生物学开放实验室课题 (N o. 973005a)。作者简介: 张伟云 (1964- ) , 女, 博士, 讲师, 主要从事天然产物中生物大分子的研究。
还具有毒副作用小的特点。紫菜是营养价值较高的海洋藻类植物, 紫菜多糖是紫菜中的重
要组成部分, 不同的紫菜所含的多糖种类及生物学活性也有所区别。条斑紫菜是我国的主
要养殖品种之一, 已有研究发现条斑紫菜多糖提取物有多种生物功能[1 3 ]。笔者对条斑紫
菜多糖 PY2 进行了分离纯化和初步的性质鉴定, 并采用细胞培养法测定了它对小鼠骨髓
细胞、脾脏以及胸腺淋巴细胞增殖的影响。
1　材料与方法
111　实验材料
条斑紫菜 (P orp hy ra y ez oensis) , 来自江苏赣榆。8 周龄BALB öc 小鼠, 购自南京军区
总医院实验动物中心。
112　多糖的制备
1. 2. 1　提取和纯化　新鲜的条斑紫菜切碎后经乙醇脱脂, 再用蒸馏水煮沸提取, 提取物按
Sevag 法进行脱蛋白[4 ] , 冻干得粗多糖。粗多糖首先经阴离子交换纤维素D E223 (W hat2
m an 产品)柱分离, 苯酚2硫酸法检测[5 ]。得D a 和D b 两个组分, 冷冻干燥。再用 Sephadex
G2200 (Pharm acia 产品)层析柱 (2. 6 cm ×60 cm )进一步纯化D a, 苯酚2硫酸法检测, 得到
两个多糖组分, 其中分子量较小的样品称为 PY2, 透析脱盐并冷冻干燥, 得其纯品。
1. 2. 2　纯度鉴定　将上述 PY2 约 5 m g 溶解在少量 0102 mo löL N aC l 溶液中, 在
116 cm ×50 cm 的 Sephadex G2200 层析柱上以 0102 mo löL N aC l 溶液洗脱, 流速为
6 mL öh, 每 20 m in 收集 1 管, 用苯酚2硫酸法检测, 结果只出现单一对称峰。
113　紫外和红外光谱测定
将少量多糖样品溶解于蒸馏水, 在U 23000 型 (H itach i) 紫外可见分光光度计上记录
190～ 400 nm 之间的紫外吸收。将纯化的多糖干燥后经溴化钾压片, 用 170SX FT 2IR 仪
记录红外光谱。
114　分子量测定
分别将标准葡聚糖 (分子量分别为 11 500、41 000、71 000、267 000 和 580 000) 和蓝色
葡聚糖上 Sepharo se 6B (Pharm acia 产品)层析柱 (1. 1 cm ×85 cm ) , 以 011 mo löL N aC l 溶
液洗脱, 测出它们的洗脱体积V e 及外水体积V 0, 以分子量的对数值对V eöV 0 作标准曲
线。然后以 PY2 上柱, 同法洗脱, 得V eöV 0 为 21150。
115　紫菜多糖对小鼠骨髓细胞及淋巴细胞体外生长的影响
1. 5. 1　小鼠骨髓细胞和淋巴细胞悬液的制备　将小鼠经眼眶放血处死后于无菌条件下取
出脾脏、胸腺及骨髓, 分别用完全培养液DM EM 制成细胞悬液, 计数。
1. 5. 2　小鼠骨髓细胞增殖　将小鼠骨髓细胞置 24 孔培养板中培养 2 h, 离心去上清, 加入
含 20% L 929 培养上清的DM EM 完全培养液, 使细胞终浓度为 5×105ö孔, 加入 PHA
(终浓度 30 ΛgömL ) , 再加入 PY2, 分成 3 个浓度组, 使其最终浓度分别为 40 ΛgömL ,
80 ΛgömL 和 160 ΛgömL。每个浓度设 6 个相同样本, 对照组不加 PY2。置 5% CO 2 培养箱
中 37℃培养 3 d, 从每孔吸取 100 ΛL 细胞悬液, 进行M T T 检测[6 ]。
1. 5. 3　脾脏和胸腺淋巴细胞增殖　分别取小鼠脾脏细胞和胸腺细胞加到 24 孔培养板中,
用量为 2×106ö孔, 加 PHA 30 ΛgömL , 再加入 3 个不同浓度的 PY2, 同时设对照组。置
CO 2 培养箱中培养 3 d, 进行M T T 检测。
051 武 汉 植 物 学 研 究　　　　　　　　　　　　　　　　第 19 卷　　
1. 5. 4　混合淋巴细胞反应　取BALB öc 小鼠脾细胞, 加到 96 孔培养板中 (2×106ö孔) , 再
加入相同数量的N IH 小鼠的脾细胞, 同样加入 3 个不同浓度的 PY2, CO 2 培养箱中培养
3 d, 进行M T T 检测。
2　结果
211　多糖的性质及分子量
由离子交换柱层析及凝胶柱层析纯化得到多糖PY2, 再经 Sephadex G2200 柱层析鉴
定 PY2 纯度, 由洗脱曲线可知, 只有单一对称峰 (图 1) , 说明 PY2 为均一多糖组分。
图 1　紫菜多糖 PY 2 的纯度鉴定
F ig11　Purity iden tification of po lysaccharide PY2 图 2　紫菜多糖 PY 2 的红外吸收光谱F ig12　T he infrared spectrum of po lysaccharide PY2
　　从紫外检测结果可知, 在 260 nm 和 280 nm 无吸收峰, 说明多糖样品中没有核酸和
蛋白质等杂质。从红外光谱可以看出, 在 3 600～ 3 200 cm - 1、3 000～ 2 800 cm - 1、1 400～
1 000 cm - 1处有多糖特征吸收峰存在 (图 2)。此多糖无 3, 62内醚的吸收峰 (930 cm - 1)和硫
酸基的吸收峰 (1250 cm - 1) , 这两种基团是大多数紫菜多糖所具有的[7 ] , 由此可见, 多糖
PY2 是一种特殊的紫菜多糖。
一般来说, 多糖的分子量大小是指它的平均分子量。本研究以凝胶柱层析法, 得出标
准曲线 Y = 7. 498 48- 1. 488 69X (R = - 0. 996 99) , Y 代表L gM , X 代表V eöV 0。由 PY2
的V eöV 0 计算出它的分子量约为 2. 0×104。
2. 2　PY 2 对骨髓细胞、脾脏细胞、胸腺细胞和混合淋巴细胞增殖的影响
由表 1 结果可以看出, 在骨髓细胞增殖试验中 3 个给药组与对照组之间均无明显差
表 1　紫菜多糖 PY 2 对淋巴细胞增殖的影响
T able 1　Effects of po lysaccharide PY2 on lymphocyte p ro liferation
组别　 Group 1 (CK) 2 3 4
给药浓度 (ΛgömL ) Do sage 0 40 80 160
小鼠数M ouse N um. 6 6 6 　6
骨髓细胞增殖
Bone m arrow cell p ro liferation (A ×100) 28. 50±0. 96 28. 50±1. 52 27. 33±1. 09 26. 33±1. 07
脾脏细胞增殖
Sp leen lymphocyte p ro liferation (A ×100) 23. 83±1. 17 19. 83±0. 83
3 18. 67±0. 493 3 16. 67±0. 213 3 3
胸腺细胞增殖
T hym us lymphocyte p ro liferation (A ×100) 43. 67±2. 42 37. 00±1. 79 33. 33±0. 95
3 3 37. 17±0. 413
混合淋巴细胞反应
M ixed lymphocyte reaction (A ×100) 43. 00±1. 71 36. 67±2. 26
3 31. 33±0. 803 3 3 28. 83±0. 913 3 3
注 (N o tes) : t 检验 (各组与对照组比较)〔t2test (compared w ith con tro l)〕: 3 P < 0. 05; 3 3 P < 0. 01; 3 3 3 P < 0. 001。
151　第 2 期　　　　　　　　　张伟云等: 一种紫菜多糖的制备及对淋巴细胞生长的影响
异 (P > 0105)。而脾脏淋巴细胞生长试验中, 当给药浓度为 40 ΛgömL 时, 给药组与对照组
即存在显著差异 (P < 0105)。在胸腺淋巴细胞增殖中, 40 ΛgömL 组与对照无显著差异,
80 ΛgömL组与对照组差异最大 (P < 0101) , 160 ΛgömL 组与对照组有显著差异 (P <
0105)。此外, PY2 对于混合淋巴细胞反应, 当浓度为 40 ΛgömL 时即有显著差异 (P <
0105) , 而当浓度达到 80 Λgöm l 时, 即存在非常显著差异 (P < 01001) , 与脾脏淋巴细胞增
殖相同, 对照组与给药组的差异性随浓度增大而增加。
3　讨论
PY2 是从条斑紫菜中获得的几种多糖中的一个。一般地, 典型的紫菜多糖是由琼胶
二糖和它的前体组成即[ (1→3) 2Β2D 2半乳糖2(1→4) 23, 62内醚2Α2L 2半乳糖 ]和[ (1→3) 2Β2
D 2半乳糖2(1→4) 262O SO 32Α2L 2半乳糖 ]组成[8 ]。而 PY2 是一种少见的紫菜多糖, 它不含
有 3, 62内醚2Α2L 2半乳糖和硫酸基, 由此说明它不是由这两种结构单元组成。因此PY2 可
能有一些独特的生物学活性。
许多研究报道, 多糖作为免疫调节剂可以促进机体的细胞免疫和体液免疫[9 ] , 本研究
所得到的多糖 PY2 对免疫系统主要具有负向的调节作用。从实验结果可以看出, 它对脾
脏细胞、胸腺细胞以及混合淋巴细胞增殖皆有显著的抑制作用, 尤其是对混合淋巴细胞抑
制程度最高。而骨髓细胞的对照组与给药组的增殖没有显著差异, 说明 PY2 对骨髓细胞
的增殖没有明显影响。对胸腺细胞增殖的影响还存在最适浓度的问题, 在 40 ΛgömL ,
80 ΛgömL , 160 ΛgömL 3 个不同浓度组中, 以 80 ΛgömL 组对胸腺淋巴细胞的增殖有最大
抑制效果 (P < 0101) , 其次为 160 ΛgömL 组 (P < 0105)。而 40 ΛgömL 组没有显著抑制作
用 (P > 0105)。本实验的结果提示紫菜多糖 PY2 有可能开发成为免疫抑制剂用于临床免
疫亢进的治疗。笔者仅就紫菜多糖对体外培养淋巴细胞的增殖作了一些初步的研究, 至于
PY2 抑制免疫细胞增殖的机理还有待于进一步的研究。
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