全 文 ：第 4
V o l
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卷 第 2 期
N o
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2
草 地 学 报
A C T A A G R E S T IA S IN IC A
1 9 9 6 年
1 9 9 6
发根农杆菌介导的百脉根的基因转化
陈 燕 李 聪 苏加楷 黄文惠
(中国农业科学院畜牧研究所 , 北京 1 0 0 0 9 4)
吕德杨 赵广宇
(中国科学院遗传研究所 , 北京 1 0 0 0 1 2)
摘要 : 本文报道 了豆科植物简单有效的转化再生实验系统 。 百脉根子叶外植体被含发根
性 Ri 质粒载体的发根农杆菌感染 , 该载体带有一个 n Pt 一 皿基因和一个甘露碱合成酶基因 。 在
含卡那霉素的筛选培养基 上 , 外植体能诱导 出毛根 , 并不断生长 , 毛根诱导频率为 45 . 5 % 。 切
取毛根根段在筛选培养基 上培养 , 毛根能膨大 , 并分化再生成苗和植株 , 其再生率为 7 . 9 % 。
抗性植株形态正常 , 浅层根系发达 。 D N A 斑点杂交与 So ut her n 杂交证明外源基因 已整合到百
脉根基因组上 。 甘露碱测 定结果表明外源甘露碱合成酶基因 已在百脉根植株水平上表达 。
关键词 : 发根农杆菌 ; 基 因转 化 ; 百脉根 ; 再生植株
1 前言
Ri 质粒作为一种新型载体 , 近年来引起国内外越来越多研究者的兴趣 。 Ri 质粒的转化
机理与 Ti 质粒相似 , 但其 T 一D N A 不影响植株的再生且能使受体植物在浸染点生成许多毛
状根 , 而一条毛根则起源于一个细胞 (张毅等 , 1 9 8 9 ;倪德祥等 , 1 9 9 1 ) 。 对发根农杆菌 A g、
ba te 二m rh lz嗯℃n e: (A . : . )Ri 质粒的应用主要有以下几个方面 : ¹ 建立药用植物的发根培养
系统 , 合成次生代谢物质 ; º 以 A . r . 感染植物 , 诱发大量毛根 , 继而与根瘤菌共生固氮 (J or -
群n H an se n 等 , 19 8 9 ) ; » Ri 质粒可以作为一种潜在的载体将外源基因导入那些仅能从根得
到再生植株的植物种或用 Ti 质粒不易转化的植物伸 , 从而扩大用于遗传操作的受体植物的
范围 。资料表明 , 多数以 Ri 质粒转化得到的再生植株属于茄科 。尽管对豆科牧草的转化研究
也不 少 , 但 得到转 化 植株 的仅 限 于百 脉根 (五沉: ‘s corn ic u la t u s ) ( p e t it A
·
198 7 ; Jo r g e n s e n
,
19 8 8 )
、紫花首蓓 (M e d lc a g o sa r沁 a ) ( S u k ha p in d a , 19 8 7 ; G o ld s , 1 9 9 1 )和矮柱花草 ( S t夕los a n t h e s
hu m il ls) ( Man ne r S
, 198 9 )
。 目前国内在该领域的研究工作尚属空白。
百脉根是温带地区重要的豆科牧草和常见的庭院观赏植物 。 具有营养丰富 、耐膺薄 、耐
寒和饲用安全等优点 。特别是细胞的全能性表现优 良 , 从它的花药 、根 、分生组织和原生质体
都可以得到高频率的再生植株 。 因此百脉根是研究外源基因对豆科植物转化 、 生物 固氮 、品
质改 良等理想的受体材料 。 本文以 Ri 质粒为载体 ,通过 A . r . 介导 , 对百脉根进行基 因转 化
研究 , 开辟 由毛根转化系统对豆科植物进行基因转移的新途径 , 从而为今后进一步开展豆科
植物的转化研究打下基础 。
, 本研究 由国家科委 8 6 3 计划资助
第 2 期 陈 燕等 : 发根农杆菌介 一导的百脉根的基 因转化 1 1 7
2 材料与方法
2
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1 菌种及其培养
发根农杆菌菌株为 A . : . Y 一 1 1 2( 由中国科学院遗传研究所吕德杨先生提供 ) 。 该菌株
在发根性 Ri 质粒载体上 含有 一个抗卡那霉素的 nP t一 亚基因和一个有功能时 甘露碱 合成酶
基因 。
菌种在附加卡那霉素 50 m g / L 的 Y M B 培养基上培养 。 在 26 C 下振荡培 养过夜至细菌
生长对数期 , 即可用于转化试验 。
2
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2 植物材料
里奥百脉根 (L (,t u , 。or; 流u la tl 、 L . C V . L eo )种子 由本所饲料室提供 。
种子用 70 %的酒精表面消毒 10 分钟 , 。. 1%的升汞消毒 30 分钟 . 无菌水洗 4 次后播种
于 M S 培养基上 。 萌发后 5一 8 天 , 取展开的子叶进行转化 。
2
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3 转化与培养
取 5 ~ 8 日龄的百脉根无菌苗子 叶 , 横切两半浸入以 M S 液体培养基 3 : 1 稀释的发根
农杆菌菌液 中 , 轻摇 30 分钟后 , 用滤纸吸干子 叶表面多余的菌液 , 接于 M S 固体培养基中 。
共培养 3 天后 , 转入选择培养基 1 (M s + K a n a m y e il 2 5m g / L + C e fo ta x im 。 3 0 0 m g 几 )中进行
筛选培养与毛根的诱导 , 诱导再生植株 。
切取毛根幼嫩部分接入选择培养基 I (M s+ 6一B A 0 . lm g /l 矛 + K a na m y’a l 2 5 m g l 一 c e -
fo ta xi m e IOo m g / I
J
)中进行筛选培养 , 每 4 周 1 次转入新鲜培养基中 , 培养条件为 26 一 2 8 C ,
每 日光照 12 小时 , 光照强度 Zo 0 lu x 。 再生苗长超过 3c m 时 , 切下转入无激素 M S 培养基以
诱导生根 , 生根植株进行移栽 。
2
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4 转化体 D N A 的提取与分子杂交
提取百脉根转化再生植株的核 D N A 进行点杂交和 S ou t h er n 杂交 。探针 D N A 为完整的
Ps LTP Zo 21 质粒 (含 T n s) , 由康耀卫同志赠送 。 以缺 口翻译法进行 3 2P 探针标记 。 点杂交 : 分别
提取样品核 D N A 以点膜器点样于 N C 膜上 , 真空干燥后 , 预杂交 、杂交 、洗膜 、放射 自显影 。
S o ut h er n 杂交 : 分别提取祥品总 D N A , 以 E co R I 酶切 , 阳性对照 P阳 p 2 o 21 质粒以 B a m H I 酶
切 , 低压凝胶电泳后 , 将胶板上 D N A Sou t h e m 转移至 N C 膜上进行预杂交 、杂交 、洗膜 、放射
自显影 (M a n ia t is 等 . 2 9 8 竺) 。
2
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5 甘露碱的检测
分别从百脉根抗性植株及转化毛根的无性繁殖系中随机取 12 份植物组织 , 以纸 电泳 的
方法进行甘露碱合成酶基因表达产物甘露碱的检测并统计阳性率 。取样品植物组织加入。. 1
N H CI 进行匀浆 , 抽提 。 离心后取清液点样于 w ha t m an 3拜拼滤纸上 , 以 2 0v/ 七m 进行 电泳 , 缓
冲液为 (甲酸 sv : 乙酸 1 5 v : H ZO 80 v) 。 电泳完毕 , 吹干滤纸 , 进行染色 、 显色 、定形 (入lor g a 。
等 , 1 98 7 ; 李宝愁丰 . 1 ; 9 1 、
3 结果与分析
3
.
1 外植沐的 转 化 、 筛选与再生
5一 8 日龄的百咏根子叶外植体 , 经发根农杆菌感染并共培养 3 天后转入筛选培养基 。 三
天左右即有棍彼诱 导 随后转化毛根迅速生长 . 约 sm n 仁 日 . 恨白色 , 粗壮 . 向培养基的 各个
方向生长 , 多有分枝 而 <仲暇则无根被诱导现象 。 3 周后 , 统计毛根诱导频率 为 4 5 . 5 人 ( 9。

第 2 期 陈 燕等 : 发根农杆菌介导的百脉根的基因转化 1 1 9
3. 2. 2 甘露碱的检测
纸电泳结果显示 , 所测样品中 , 转化毛根与再生植株均有甘露碱的表达 。 而对照组则无
(图 3 ) 。 分别统计 , 其 阳性率均为 1 0 % 。 结果表明 Ri 质粒上 T 一D N A 已转入转化体中 , 并在
转化根与转化再生植株水平上得到表达 。
4 小结与讨论
4
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1 本文 以百脉根为受体植物 , 通过发根农杆菌 A . r . 介导法将 nP t 一 l 与甘露碱合成酶基
因导入百脉根中 ,进而 由转化毛根再生成植株 , 建立了毛根转化系统 。 该系统除转化频率明
显高于 A . t . 介导法外 , 另一个显著特点则是能以转化毛根为标记 , 从外观上对转化体进行
早期筛选与鉴定 。
4
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2 由于转化再生植株的浅层根系发达 。对某些组培不易诱导生根的植物种 , 若能以 Ri 质
粒转化成功 , 发根基因的表达则会促进转基因植株生根 , 从而克服这一难点 。 G ue rc h e P . 等
(1 9 8 7) 报道 由毛根再生的植株通常表现 为短节间 ,顶端优势弱和皱叶等特征 。但本实验转基
因植株则具有完全正常的表型 。 究其原因可能与存在 Ri 质粒 T 一D N A 上控制着转录表达
的基因有关 。 此外 , Tl 一 D N A 在植物中的转录表达有很大的变异性 , 各功能 区对于不同的
植物则有不同的效果 。 (张毅等 , 1 9 89 ) 。
4
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3 作者观察到 , 实验 中卡那霉素对转化体的长期培养 , 尤其对转化根的分化再生将不可
避免地产生不利影响 。 如转化根活力下降 、老化 、不易再分化等 。 因此 , 为消除抗生素的毒害
作用 , 提高其转化效率 , 可在转化根保存与再生过程中避免用抗生素筛选 , 仅 以转化根形态
作为筛选的标准等等 , 则值得今后继续探讨 。
参 考 文 献
李宝健 、 曾庆平 , 1 990 , 植物生物技术原理与方法 , 湖南科学技术出版社 , p 一42 9
张毅 、沈文辉 , 1 9 89 , 植物基因工程的新载体—农杆菌 Ri 质业 , 生物工程学报 , 5 (3 ) : 1 73倪德祥 、林峰 , 19 1 , 植物基因工程 Ri 质粒的研究和应用 , 自然杂志 , 9 : 6 7 4 一6 7 6
G o ld s T
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J
. ,
J
.
Y
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,
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H u s n a in et a l
. ,
1 9 9 1
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fo r a g e le g u m e s M
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.
4 2 (2 4 2 )
:
1 1 4 7
~ 1 1 5 7
Jo r g e n H a n s e n
,
Ja n
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E lo Jo r g e n s e n
,
Je n s S t o u g a a rd et a l
. ,
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一
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,
Je n ss t o u g a a r d
,
A n n e M
a r e k e r e t a l
. ,
1 9 8 8
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R o o t n o d a le s p e e ifie g e n e r e g u la t lo n
:
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.
N u e le ie A e id s R e
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:
3 9 ~ 4 9
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,
E ffie ie n t t r a n sfo r m a tio n w ith r e g e n e r a tio n o f th e t r o p ie a l p a s t u r e le g u m e
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Po r t s
:
3 4 1 ~ 3 4 5
M
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. ,
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.
S a m b r o o k
,
1 9 8 2
,
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.
A L a b o r a to ry M
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.
G o ld s p r in g
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.
N Y p 4 7 4
1 2 0 草 地 学 报 1 9 9 6 年
9 P e tit A
. ,
S t o u g a r d J
. ,
K u h le A
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1 9 8 7
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T r a n sfo r m a t lo n a n d r e g e n e r a t lo n o f th e L e g u m e L o t u s
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: a sys t e积 fo r m o le e u la r s t u d ie s o f s yrn bio tie n 、t r o g e n fix a tio n . M o l. G en , G e n et . 2 0 7 : 2 4 5 一
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3 7 ~ 4 9
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