全 文 ：武汉植物学研究 2007，25(1)：102—104
lo蚋 证 越 Wuhan Botanical Research
DNA超甲基化在小麦耐盐胁迫中的作用
钟兰，王建波
(武汉大学生命科学学院，植物发育生物学教育部重点实验室，武汉 430072)
摘 要：运用高效液相色谱技术测定小麦(T"r~um aestivum L．)耐盐品种‘德抗 961’和盐敏感品种‘豫麦 34’盐胁
迫后叶片和根 DNA中5．甲基胞嘧啶百分含量的变化，结果表明，经 150 mmoL／L NaCI处理 6 d后，‘德抗 961’叶片
和根DNA中的5．甲基胞嘧啶的百分含量显著下降，但经 150 mmol／L NaCI处理10 d后，耐盐品种‘德抗961’叶片
和根DNA中的5．甲基胞嘧啶的百分含量都比盐敏感品种‘豫麦34’的高。由此推测 DNA超甲基化可能是植物耐
盐机制的一部分。
关键词：盐胁迫 ；小麦；DNA甲基化
中图分类号：Q945 文献标识码：A 文章编号：1000-470X(2007)O1-0102-03
The Role of DNA Hypermethylation in Salt Resistence of
Triticum aestivum L．
ZHONG LarI．WANG Jian-Bo’
(Keylaboratory o，MOEfor Plant Lk~ rnental Biology，Colege ＆ ，Wulmn University，Wuhan 430072，China)
Abstra~：The content of 5-methyl cytosine in two cuhivars of wheat(Triticum aestivum L．)exposed to
salt stress WaS measured by high pressure liquid chromatography． e result indicated that the degree
of 5-methyl cytosine in the leaf as well as in the root of‘Dekang 961’decreased after 6 days treatment
with 150 mmol／L NaC1．but higher than that of‘Yumai 34’after 10 days treatm ent with 150 mmol／L
NaC1．We suggested that hypermethylafion could be a part of the resistant mechan ism of plants to salt．
Key words：Salt stress；Triticum aestivum L-；DNA methylation
世界上存在着大面积的盐渍化土地，据不完全
统计 ，全世界共有 3．8亿 不同程度的盐渍化土
壤，中国有盐渍化和次生盐渍化土地4000万 hm 以
上，占我国耕地的10％左右，严重影响了粮食产量，
成为限制农业生产的主要因素⋯。高盐可以对植
物造成渗透胁迫和离子胁迫，前者导致土壤水势下
降，使植物吸水困难，甚至迫使细胞脱水，后者影响
植物的正常生理代谢，从而抑制植物的生长发育，严
重时可以导致植物死亡。植物为了能在盐渍环境中
生存，在进化的过程中逐渐发展了一套保护措施，如
调节离子的区域化分布，或增加脯氨酸等代谢物质
在细胞质内的积累等，以提高植物的耐盐性。
近年来，有关表观遗传学的研究已愈来愈成为
基因表达调控研究的热点之一。生物的表观遗传学
变化主要包括 DNA甲基化、x染色体剂量补偿、组
蛋白密码和基因组印记等方面。最近的研究结果证
明：5-甲基胞嘧啶(5-MeC)在基因表达和表观遗传
调控中起重要作用 。Cao和 Jacobsen等认为，在
植物中对称的 cG序列的甲基化与基因表达调控有
关，CNG的甲基化在转座子的失活 中起作用，而
CNN的甲基化在表观遗传沉默中起作用【3 J。
关于植物的盐害和抗盐机理从生理学的角度已
有许多研究，但是有关盐胁迫和表观遗传的关系方
面的信息却很少。小麦(Tr／t／cum aestivum L．)是我
国目前盐碱地主要栽培作物之一【4 J，在耕地有限、
人口不断增长的今天，开发和有效利用盐渍化土壤
资源具有重要的现实意义，而研究小麦的耐盐机理
将为培育耐盐小麦品种提供重要的理论依据。本工
作旨在研究 DNA甲基化与小麦耐盐性之间的联系。
1 材料与方法
1．1 材料培养与处理
选用小麦(Triticum aestivum L．)‘豫麦 34’和
‘德抗961’两个品种，‘豫麦34’由河南农业大学提
供，‘德抗961’由山东省德州市农科所提供。选籽
粒饱满的小麦种子，用自来水将种子冲洗干净，70％
收稿日期：2006-08-08，修回日期：2006—11-24。
作者简介：钟兰(1980一)，女，在读博士生，现从事植物逆境分子生物学研究。
} 通讯作者(Author for correspondence．E—mail：jhMg@whu．edu．cn)。
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第 1期 钟 兰等：DNA超甲基化在小麦耐盐胁迫中的作用 1O3
酒精消毒 3O s,0．1％ HgCI2处理7 rain，然后用蒸馏
水洗3～4次；在蒸馏水中浸泡 5 h后，置于培养皿
中湿润滤纸上，并在 25~C的恒温培养箱中黑暗条件
下萌发3 d。挑选生长基本一致的幼苗，采用1／8 X
Hoagland溶液培养 5 d。培养箱温度白天 25qC，夜
间20~C，每天光照时间为 12 h，幼苗长到第 9 d时，
被放置到 150 mmol／L NaCl(用 1／8 X Hoagland溶液
配制)溶液中，分别处理0、2、4、6、8、10 d，对照用
1／8 X Ho~lnnd溶液继续培养。
1．2 DNA提取
分别提取‘豫麦 34’和‘德抗 961’品种叶片和
根的DNA。DNA提取采用修改了的 CTAB法 J。
用紫外分光光度法检测 DNA的纯度和浓度。
1．3 DNA的水解
参照 Demeulemeester等 ]的方法稍作 改动。
向装有30 vLg DNA粉末的管中加人 70％的高氯酸
5O ，沸水浴 1 h进行水解，然后用 1 mol／L KOH
将 pH值 调整到 3～5，在形成 KCIO 沉淀后于
12 000 r／min下离心5 rain，取上清液进行高效液相
色谱(HPLC)分析。
1．4 HPLC分析
将水解后的DNA水解液室温下通过 自动进样
器加到Agilent LC 1 100型高效液相色谱仪的ZORB—
AX SB Cl8柱(5 wm，250 nlnX4．6 mm)中，柱温箱
温度为40c【=，以 10％的甲醇、5 mmol／L的戊烷磺酸
钠和0．2％的三乙胺的混合液(pH值为4．0)为洗
脱液，以0．8 mIJmin的流速进行洗脱，所用检测器
为紫外检测器，检测波长273 rtrn。采用外标法确定
胞嘧啶(C)和5一甲基胞嘧啶(5一MeC)的峰位。采用
外标法，以C和 5-MeC的标样作对照，通过计算 5一
MeC摩尔数 ／(5-MeC摩尔数 +C摩尔数)的百分
比检测总基因组 DNA中5-MeC的含量即DNA甲基
化的水平，重复 3次测定。
2 结果
2．1 DNA甲基化水平测定
将胞嘧啶(c)、鸟嘌呤(G)、5-MeC、胸腺嘧啶
(T)、腺嘌呤(A)5种碱基的混合液进行 I-IPLC碱基
分析，碱基分离见图1。从图中可以看出，混合液经
过色谱柱后，c、G、5-MeC、T和A被先后洗脱出来，
它们洗脱峰的保留时间分别为4．575、5．110、5．558、
6．313、7．006 min。5种碱基分离完全，无混杂。
1
1
墨
0 2 5响应 时间5 (min) 5 lO
Respometime
图 1 DNA碱基 HPLC分离图
Fig．1 HPLC seperation ofDNA bases
2．2 盐处理后小麦叶片 DNA中5-MeC含量的变
化
‘德抗961’和‘豫麦34’经 150 mmo~LNaC1分
别处理 0、2、4、6、8、10 d后，叶片 DNA中5-MeC
摩尔数占总胞嘧啶摩尔数百分含量的变化情况见
图2。从图中可以看出，150 mmol／L NaCI处理后，
‘豫麦34’叶片 DNA中 5-MeC百分含量持续上升，
直到盐处理第 8 d达到 22．15％，随后 5一MeC百分
含量下降，至第10 d基本又回到初始水平；而‘德抗
961’叶片 DNA中5-MeC百分含量先稍有上升，后
下降至 9．45％，随后又开始持续上升，盐处理第
10 d上升到22．9％。对照与处理 0 d时相似(未在
图中标出)。
釜蔓
— ．--Triticum aestivuraL ‘Dekang 961
---o-Triticum aestivuraL ‘Yumai 34’
盐胁迫时间(d)
Salt str0S$time
图 2 NaC!对小麦叶 DNA中5-MeC含量的影响
Fig．2 Efect of NaCI on the content of
5．MeC in DNA in wheat leat"
2．3 盐处理后小麦根 DNA中5-MeC含量的变化
‘德抗961’和‘豫麦34’经 150 mmol／L NaC1分
别处理0、2、4、6、8、10 d后，根 DNA中5-MeC摩
尔数占总胞嘧啶摩尔数百分含量的变化情况见
图3。从图中可以看出，150 mmo~L NaCI处理后，
‘豫麦34’根 DNA中 5-MeC百分含量持续下降，盐
处理第 10 d只有6．2％；而‘德抗 961’根 DNA中5一
MeC百分含量先下降，盐处理第 6 d只有 11．7％，随
后持续上升，盐处理第 10 d上升到比盐处理前稍高
水平。对照与处理0 d时相似(未在图中标出)。
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武 汉 植 物 学 研 究 第 25卷
誊堇
删
加
翦
图 3 NaCI对小麦根 DNA中 $-MeC含量的影响
Fig．3 Efect of NaC1 on the content of
5．MeC in DNA in wheat root
叶片和根 DNA发生了去甲基化，Steward等在受到
冷胁迫的玉米(Zea mays L．)幼苗根基因组 DNA中
也发现了此现象 引¨，去甲基化可能是作为受环境因
子调控的许多基因的公共开关，从而植物对环境变
化做出响应。盐处理 6 d后，‘德抗 961’叶片和根
DNA都发生了超 甲基化，耐盐植 物冰叶 日中花
(Mesembryanthemum crystalinum)在盐胁迫条件下
CCWGG序列也发生了超甲基化 ¨，超甲基化可能
是通过改变染色体的结构，调节基因表达，从而提高
植物的耐盐性。
3 讨论 参考文献：
同一物种在不同时期及不同组织中甲基化水平
是不一样的，如 Messeguar等测得小麦成熟叶片
DNA中5-MeC含量为 22．4％C7]，本实验测得未经
盐处理 的小麦幼 苗叶片 DNA 中 5-MeC含量为
14．4％，根 DNA中5-MeC含量为22．4％。Finnegan
等也在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中发现成熟的
叶片DNA甲基化水平高于幼苗 】。Demeulemeester
等测得在菊苣 (Cichorium intybus L．)根 DNA 中
5-MeC百分含量为 10．6％，而成熟植株的叶尖 DNA
中5-MeC百分含量为 16．6％C6]。
DNA甲基化是植物正常生长发育所必需的，甲
基化水平不足或过高，都会导致植物生长发育不正
常和形态结构异常 J。在植 物生长发育过程 中
DNA甲基化起着重要的作用，如可以抑制转座子以
及外来DNA和RNA的转录，降低由非等位基因之
间的转座和重组导致的基因组的破坏，并可免遭病
原的侵染 。¨。。Finnegan等对春化机理的研究结果
表明，春化是通过 DNA甲基化水平的降低促进开
花¨¨ 。从目前报道的情况来看，几乎所有的转基因
沉默现象都与转基因编码区和启动子的甲基化有
关。DNA甲基化状态的改变会影响 DNA的构象，
进而影响染色质的结构和 DNA与蛋白质的相互作
用，最终调节基因表达【】 。
有研究表明，逆境(如热胁迫，干旱)对 DNA的
甲基化水平会造成影响 ¨。如 Kovafik等发现渗透
胁迫使烟草(Nicotiana L．)组织培养细胞的异染色
质区重复序列发生 DNA超甲基化，当这些细胞重新
回到正常生长条件下时，DNA甲基化又回到对照水
平，他们认为 CpNpG三核苷酸的超甲基化使植物在
DNA水平缓冲了环境变化对它们的影响，并提出基
因组的超甲基化可能是植物适应非生物胁迫机制的
一 部分u引。在本研究中，盐处理前 6 d，‘德抗 961’
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