全 文 ：武汉植物学研究 2004，22(1)：22～26
Journal of Wuhan Botanical Research
褐飞虱诱导的水稻 cDNA文库的构建及
锌指蛋白基因的分离
王小兰，祝彩磊，祝莉莉，何光存
(武汉大学植物发育生物学教育部重点实验室．武汉大学生命科学学院，武汉 430072)
摘 要 ：从褐飞虱取食 48 h后的水稻幼苗中提取总 RNA并纯化出mRNA，经反转录合成第一、二链 cDNA，去除
小于 400 bp的cDNA片断后，连接 EcoR 1人工接头，与去磷酸化的噬菌体长短臂连接，体外包装后感染 ，成功构建
了含 1．1×10 重组子的褐飞虱诱导的水稻 cDNA表达文库，重组子平均外源片断为 1．5 kb，扩增后的cDNA文库
滴度为 1．1×10“pfu／mL，适用于筛选低丰度 mRNA的cDNA克隆。将已筛选得到的EST BPHiw001为探针，在
褐飞虱诱导的水稻cDNA文库中筛选得到 1．4 kb的全长锌指蛋白基因，命名为OsBi2。Northern blot分析说明此
基因可能在水稻对褐飞虱的防卫反应中起作用。
关键词：褐飞虱；cDNA文库；锌指蛋白
中图分类号：Q943；$511 文献标识码：A 文章编号：i000—470X(2004)01—0022—05
Construction of Rice cDNA Library Induced by Brown Planthopper
and Isolation of Dof Zinc Finger Protein
W ANG Xiao—Lan，ZHU Cai-Lei，ZHU Li-Li，HE Guang-Cun。
(Key Laboratory of．the Ministry of Education for Plant Dewelopmental Biology，College of Life Sciences，
W uhan University．W uhan 430072，China)
Abstract：Total RNA was exacted from rice shoots(B5)after 48 h fed by brown planthopper，
mRNA was isolated and further purified．The first and second cDNA strands were synthesized by
reverse transcription and inserted into phosphorylating Uni—ZAP XR vectors．The results revealed
that cDNA library BPH induced contained 1．1× 1 0 recombinants and the average length of in—
serts was about 1．5 kb．The tilter of the amplified cDNA library was 1．1×10n pfu／mL．T his li—
brary is suitable for screening genes in low abundance．Using the EST of zinc finger protein as
probe to screen the cDNA library，a full length of dof zinc finger protein with 1．4 kb was isolated
and named as OsBi2．Northern blot analysis proved that OsBi2 was up-regulated in brown plan—
thopper—fed rice．
Key words：Nilaparvata lugens；cDNA library；Dof zinc finger protein
随着分子生物学的迅速发展，cDNA文库的构
建已成为必不可少的技术之一，特别是在研究基因
表达与调控以及各种基因的功能与结构时，cDNA
克隆有着十分重要的意义。如在高等生物中，许多基
因只在发育的某个阶段或在特定的环境中表达，研
究这些基因的表达特性，cDNA克隆将更为重要。褐
飞虱(Nilaparvata lugens Stil1．)是水稻作物的一种
重要虫害，危害严重时全田枯死似火烧状，每年均造
成产量损失。因此，寻找抗虫基因、培育抗虫品种是
当务之急，而构建水稻受褐飞虱诱导的cDNA文库
对于寻找抗虫基因具有重要的意义。
锌指蛋白(Zinc finger protein)是一类具有“手
收稿日期：2003—06—24，修回日期：2003—08—04。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(30170085)。
作者简介：王小兰(1974一)，女．在读博士研究生，主要从事水稻对褐飞虱的抗性机理研究。
通讯作者(Author for correspondence．E—mail：gche@whu．edu．cn)。
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第 1期 王小兰等：褐飞虱诱导的水稻 cDNA文库的构建及锌指蛋白基因的分离 23
指状”结构域的转录因子，负责调控基因的表达。其
主要通过与核酸相互作用，显示出不同的功能，如促
进转录、抑制转录、单链 DNA结合和 RNA结合或
RNA／DNA双向结合[1]等。目前植物中已经克隆了
一 些锌指蛋白，被证实与植物的发育相关，如与拟南
芥发育相关的 SUPERMAN L2]，与小麦组蛋白 H3
与H4基因启动子区域专一性结合的WZF1[3]。近年
来，通过不断的研究发现，锌指蛋白还参与了植物抵
御其生长过程中所经历的各种胁迫反应，如大豆中
报道的冷诱导蛋白SCOF一1有增强转基因植物抗冷
胁迫的作用[4 ；拟南芥和棉花中报道的与耐盐性有
关的锌指蛋白STZ[5]和 CSTZ[6J以及水稻中分离得
到的一种新的锌指蛋白OsZFP1 L7 等都揭示锌指蛋
白参与植物抗胁迫的作用。
本研究构建了水稻受褐飞虱诱导的cDNA文库，
并利用一段从褐飞虱诱导的水稻幼苗SSH文库中分
离得到的EST为探针，从此cDNA文库中筛选并获得
一 个新的Cys2型水稻锌指蛋白的全长cDNA，由于是
第2个筛选得到的可能是与抗褐飞虱相关的基因，命
名为OsBi 2(Oryza sativa L．BPH induced gene 2)。
l 材料与方法
1．1 材料
菌株与载体 Ecoli XL1一Blue MRF’株，SOLR
菌株，pBluescript KS(+／一)；Uni—ZAP XR载体，
VCSM13辅助噬菌体均购自Strategene公司。
工具 酶及试 剂 DNA 序列分 析试剂盒及
[=P]-dCTP均购自Perklin—Elmer公司。T。和 T
通用引物由上海生物工程公司合成。TRIzol试剂购
自Gibcol公司。
水稻材料 选用来源于栽培稻与药用野生稻
(Oryza officinalis Wal ex Watt)间杂交后代的一
个高抗褐飞虱的稳定品系B5[8]为实验研究对象。
褐飞虱 实验中所用的褐飞虱均为发育至 2～
3龄的若虫。褐飞虱在武汉大学遗传所以台中1号
饲养繁殖。
探针 以王小兰等[ 构建的B5材料抑制消减
杂交文库中筛选得到的 BPHiwO01(BQ8O8683)为
探针，进行 cDNA文库的筛选。
1．2 方法
1．2．1 褐飞虱取食 选取发芽良好的抗褐飞虱水
稻品系 B5种子，以每杯 2O粒的密度播种于 1O×
10 cm 的塑料杯中。待秧苗长至三叶期时，按每株
1O只放入褐飞虱。
1．2．2 总RNA分离 三叶期的水稻 B5在褐飞虱
取食 48 h后，提取总RNA。总RNA采用TRIzol试
剂，根据试剂盒说明书来提取，取 25 g的总 RNA
在 1．2 甲醛变性胶上电泳 4 h后检测其完整性。
1．2．3 cDNA文 库的 构建 cDNA 的合 成 按照
ZAP—cDNA—Synthesis—Kit (Stratagene，USA)进
行。合成第 1条cDNA链的引物为 18碱基的寡聚胸
腺嘧啶(poly(DT) 。)，XhoI的酶切位点和 2O个碱
基的保护序列，在第 1链的缓冲液中含有 10 mmol
甲基化的Dntp；第 2条链合成时，DNA：RNA杂交
链上 的 RNA经 RnaseH消化出一些缺 口，在 E．coli
DNA聚合酶 I的作用下将RNA置换成DNA，末端
经 Klenow酶补平后，连接上 EcoR I接头后，再用
‘ XhoI酶解，这样，cDNA的 5’端为 EcoR I，3’端为
XhoI的粘性末端。该 cDNA产物经 Sepharose CL一
2B柱分离去掉小于 400 bp的片段后，连接于 Uni—
ZAP XR载体上。连接产物的体外包装采用 由
Stratagene提 供 的 Gigapack Ill Gold packaging
Extract(2×10 pfu／／~g DNA)。每 L连接产物使
用 1份包装产物。室温下温育2 h，加入 500 L SM一
缓冲液，2O L氯仿，4℃保存备用。取上述包装产物
1 L逐级稀释(1：10，1：100，1：lOOO)后，转染
Ecoli XL1一Blue，铺于含 IPTG和 X—gal的平板上，
培养 6 h后计算嗜菌斑个数，根据嗜菌斑数计算出
文库滴度，同时计数其蓝白斑个数，计算重组率。
1．2．4 锌指蛋白cDNA克隆的筛选 用 SSH筛选
得到的抗褐飞虱相关基因 BPHiw001[ ，对噬菌体
文库进行原位杂交，放射自显影后 ，从膜中选出阳性
的嗜菌斑区域，取出后进行第 2轮杂交，得到可能纯
化的阳性嗜菌斑，溶于 100 L SM buffer，吸 1 L
作模板进行PCR扩增。对扩增结果为两条带或以上
的阳性嗜菌斑，进行第 3轮杂交，得到纯化的阳性嗜
菌斑。
1．2．5 阳性克隆的体内剪接 用灭菌的牙签挑取
后，再悬浮于 200 L SM 缓冲液和 2O L氯仿中。
取 100 L阳性嗜菌斑与 100 L XL1一Blue(OD一
1．O)和 0．5 L辅助噬菌体 (>1×10 pfu／／~L)在
37℃培养 15 min后，再加入 3 mL LB一培养基继续
摇动孵育 3 h，细菌经 70~C 20 min灭 活，含有
pBluescript质粒的上清再感染 SOLR宿主菌，在含
氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃培养过夜。挑
取单克隆继续在含氨苄青霉素的LB液体培养基上
扩大培养。
1．2．6 Northern blot 提取褐飞虱取食(T)48 h
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24 武 汉 植 物 学 研 究 第 22卷
和未取食(C)的三叶期的B5幼苗总 RNA，其提取
方法同1．2．1。以OsBi2全长 cDNA的PCR产物为
探针，进行 Northern杂交分析，探针标记及杂交方
法参照Chen等 。 的方法。
2 结果
2．1 总 RNA和 cDNA的鉴定
总RNA样品的甲醛凝胶变性电泳清晰显示28S
和18S两条带(图 1：A)，表明我们分离的总RNA是
完整的，而mRNA大小是不均一的，呈弥散状分布。
根据cDNA一、二链的电泳结果，提示纯化的mRNA
和合成的cDNA较为完整和有效(图 1：B)。
1 2 3 4 1 2 3
■
A B
A．RNA电泳(1，2，3，4泳道代表褐飞虱取食不同时间的
B5 RNA)；B．mRNA及 eDNA完整性检测 (1泳道 ：纯
化的 mRNA；2，3泳道：反转录的第 1、2链 eDNA)
A．Represents the total RNA analyzed by agarose gel
electroDhoresis．Lane 1—4 are different time course total
RNA after BPH infection；B．Represents the analysis of
mRNA and cDNA (Lane1，purified mRNA；Lane 2，3，
the first and second cDNA strand respectively)
图 1 RNA 、mRNA及 eDNA电泳检测
Fig．1 The gel electrophoresis of
RNA，mRNA and cDNA
2．2 cDNA文库的质量
首先测定包装蛋白的效价，取 1 g kDNA进行
体外包装反应，稀释后侵染XL1一Blue细胞，结果出
斑率为 1．2×10 pfu／~g DNA，证明符合建库要求。
将纯化的cDNA与 Uni—ZAP XR／EcoR I脱磷
臂连接后进行体外包装，感染 XL1一Blue细胞后铺
板记数，整个文库大小为 1．16×10 个嗜菌斑。在上
层琼脂中加入 IPTG和 X—gal铺板，白斑比例大于
96 ，因此含有重组子的文库大小为1．1×10 ，完全
符合一般用于筛选低丰度的cDNA全长的要求。
2．3 阳性克隆的酶切分析
为了对 cDNA文库作进一步分析，首先测定其
cDNA插入片段大小。在 Uni—ZAP载体中有 1个
pBluescript SK(一)的质粒，而插入的 cDNA就在
其中。在体外，因M13辅助噬茵体的协助，可得到含
有该 cDNA的质粒。经 EcoR I和 XhoI消化，琼脂
糖凝胶电泳，测定其cDNA片段的长度。图2表明，
在检测的 13个克隆中，只有 6泳道克隆的插入片段
小于 1．0 kb，其余都明显大于 1．0 kb，第 5泳道克
隆可能为空载或其插入片段与载体重叠；第 3、7和
10泳道克隆为酶切不完全，因为从图中酶切结果未
见插入片段释放，但用 T3和T7通用引物扩增发现
都有插入片段。从图 2中可以看出，在第 8和 13泳
道克隆显示出大于载体 2．6 kb条带。通过进一步计
算，其平均插入片段为 1．5 kb。因此，从cDNA文库
插入片段大小判断该 cDNA文库足够用于筛选
cDNA全长。
1～ 13代 表 cDNA 克 隆；M 代 表 1 kb DNA Ladder
Marker
Lane 1～ 13 are cDNA clones；M ．1 kb DNA Ladder
Marker
图 2 eDNA文库插人片段检测
Fig．2 The insertion of cDNA library
2．4 BPHiwO01 cDNA克隆的筛选
以BPHiw001 EST作探针，对所构建的褐飞虱
诱导的B5 cDNA文库进行噬菌体原位杂交筛选，第
1轮筛选时每皿储有噬菌体30 000个左右，共有3个
皿，印膜，在高强度条件下 (1×SSC／0．1 SDS，
15 min；0．5×SSC／O．1 SDS，15 min)洗膜，从两
张重复的膜中挑选均出现的阳性噬菌斑，共有22个
如图3的第1轮筛选结果中箭头所示候选噬菌斑，其
杂交信号的强度和密度均大于周围背景的为阳性克
隆，用牙签将这区域噬菌体取出后，进行第2、3轮筛
选，每个斑对应1个平皿，每皿储100个左右噬菌体，
洗膜条件同上，放射自显影，结果见图3。经过3轮原
位杂交，将挑选的单个噬菌斑PCR检测，每个泳道都
是一条带，说明经3次筛选后，基本上是纯化的单克
隆，且插入片段各不相同，选取插入片段较大的3个
阳性克隆，将这些阳性噬菌斑分别挑出后，进行体内
剪切，形成含有锌指蛋白基因的大肠杆菌菌落。
2．5 全长的分离
将上述22个阳性克隆3个长约1．4 kb已转化成
质粒的含有锌指蛋白的cDNA片段进行测序，发现
这个cDNA包含一个由600个碱基编码的200氨基酸
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第 1期 王小兰等：褐飞虱诱导的水稻cDNA文库的构建及锌指蛋白基因的分离 25
第1轮筛选 第2轮筛选
图 3 cDNA文库的筛选
Fig．3 Screening of cDNA library
残基的开放阅读框(图4)。将此测序产物进行蛋白质
数据库(国际生物技术信息中心，BLAST，http：∥
www．ncbi．nlm．nih．go~／)搜索，发现与水稻锌指
第3轮筛选
蛋白(BAA78575)存在56 的同源性。将序列输入
包含保守域数据库中搜索，发现此蛋白在划线处(图
4)含有一个类似于Cys2锌指结构的DNA结合域。
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* 表示终止密码子；——表示 Cys2结构
The stop codon is shown by an asterisk (*)and the structure of Cys2 is underlined
图 4 OsBi2的核苷酸和氨基酸序列
Fig．4 Nucleotide and amino acid sequences of OsBi 2
2．6 Northern杂交结果分析
对照及接虫 B5水稻植株 RNA样品经电泳分
离转膜后，以OsBi2为探针进行 Northern杂交。结
果见图 5，经褐飞虱取食后，OsBi2的表达量明显高
于对照，说明 OsBi2可能在水稻对褐飞虱的防卫反
应中起作用。
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26 武 汉 植 物 学 研 究 第 22卷
OsBi2
rRNA
C T
C代表褐飞虱未取食的B5植株的 RNA；T代表褐飞虱
取食的 B5植株的 RNA
C represented the RNA from the control B5 plant；T
represented the RNA from the BPH fed B5 plant
图 5 OsBi2的 Northern blot分析
Fig．5 Northern blot analysis of OsBi2
3 讨论
自本实验室采用 Strategene的快速 cDNA文
库构建技术以来，已成功构建了三十烷醇处理及褐
飞虱取食后的抗、感虫材料的cDNA文库，库容量
均达 1O 以上，并获得了相关的基因克隆，实践证明
此法构建的cDNA文库完全符合实验要求。笔者利
用已筛选出的受褐飞虱诱导的 EST，筛选 cDNA文
库，得到了目的基因的全长 cDNA，从而再次证明了
我们所构建的 cDNA文库完全能够满足分离全长
基因需要。
褐飞虱是亚洲最严重的水稻害虫之一，除了对
水稻作物产生直接的伤害外，它还是水稻病毒病的
传播媒介[1 。尽管取食植物韧皮部的昆虫多种多
样，但是植物抗性反应分子生理及抗性机理信息却
相当匮乏。在本文中，我们构建了抗虫材料cDNA
文库是为了更好地了解来自抗性水稻 B5的抗褐飞
虱相关基因的特性，并且为进一步研究取食植物韧
皮部的昆虫与植物的关系奠定基础。虽然锌指蛋白
如何参与水稻对褐飞虱的应激反应还不甚清楚，但
是我们从文库中分离的这个基因提供了一个证据，
即锌指蛋白基因可能参与褐飞虱诱导的应激反应。
我们所筛选得到基因经GenBank查寻，与水稻
锌指蛋白基因的同源性达 56 ，从而断定此基因为
锌指蛋白。锌指蛋白是一类重要的转录因子，许多高
等动、植物的锌指蛋白基因已经分离。实验证明锌指
蛋白基因与个体发育[12]、花器官发育[1。]以及胁迫相
关的调节[7]等均相关。同时，我们的Northern杂交
结果也证实，锌指蛋白在受褐飞虱取食后表达产物
增加，说明锌指蛋白在水稻对褐飞虱的防卫反应中
起作用。至目前为止，还没有报道锌指蛋白与褐飞虱
的反应有关，因此，进一步研究其在抗褐飞虱反应中
的作用具有重要的意义。
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