全 文 ：武汉植物学研究 2006，24(4)：365—376
Journal of Wuhan Botanical Research
植物荧光原位杂交技术的发展及其
在植物基 因组分析中的应用
佘朝文 ，宋运淳
(1．怀化学院生物系，湖南怀化 418008；2．武汉大学生命科学学院，植物发育生物学教育部重点实验室，武汉 430072)
摘 要：荧光原位杂交(HSH)是在染色体、间期核和 DNA纤维上定位特定 DNA序列的一种有效而精确的分子细
胞遗传学方法。20年来，植物荧光原位杂交技术发展迅速：以增加检测的靶位数为目的，发展了双色 FISH、多色
FISH和多探针 FISH鸡尾酒技术 ；为增加很小染色体 目标 的检测灵敏度，发展了BAC—FISH和酪胺信号放大 FISH
(TSA．FISH)等技术；以提高相邻杂交信号的空间分辨力为主要 目的，发展 了高分辨的粗线期染色体 FISH、间期核
FISH、DNA纤维 FISH和超伸展的流式分拣植物染色体 FISH技术。在植物基因组分析中，FISH技术发挥了不可替
代的重要作用 ，它可用于：物理定位 DNA序列，并为染色体的识别提供有效的标记；对相同 DNA序列进行比较物理
定位 ，探讨植物基因组的进化；构建植物基因组的物理图谱 ；揭示特定染色体区域的 DNA分子组织；分析间期核中
染色质的组织和细胞周期中染色体的动态变化 ；鉴定植物转基因。
关键词 ：荧光原位杂交；分子细胞遗传学；植物染色体；植物基因组 ；物理作图
中图分类号：Q94-33 文献标识码 ：A 文章编号：1000．470X(2006)04．0365—12
Progress of Plant FISH Technique and Its Applications in
the Analysis of Plant Genome
SHE Chao—Wen 一．SONG Yun—Chun
(1．Department ofBiology，Huaihua Colege，Huaihua，Hunan 418008，China；2．KeyLaboratoryofMOEforPlant
Developmental Biology，Colege of Sciences，Wuhan Univer． ity，Wuhan 430072，China)
Abstract：Fluorescence in situ hybridization (FISH)is an efective and accurate molecular cytogenetic
tool for mapping specific DNA sequences on chromosomes，interphase nuclei and DNA fibers．Rapid ad-
vances in plant FISH technique have been made in the past two decades． Dual FISH，multicolor FISH
and multiprobe FISH cocktail have been developed to increase the number of detected targets；BAC—FISH
and tyramide signal amplification FISH (TSA—FISH)have been applied to increase the detection sensiti—
vity of very small chromosomal targets；and high resolution FISH such as pachytene FISH，interphase
FISH，fiber FISH and FISH on super—stretched flow—sorted plant chromosome have been developed mainly
to improve the spatial resolution of signals derived from flanking sequences．FISH have played important
roles in the analysis of plant genome．It can physicaly map specifc DNA sequences，provide effective
marks for chromosome identification within a genome，investigate the evolution of plant genome by con—
parative mapping of the same DNA sequences in related species，construct the physical map of plant ge—
nome，directly reveals the DNA molecular organization of a specifc chromosome regions，analyze the or—
ganization patern of interphase chromatin and the dynamic changes of chromosomes in cel cycle，and
characterize~ansgenes in plant genomes．
Key words：Fluorescence in situ hybridization(FISH)；Molecular cytogenetics；Plant chromosome；
Plant genome；Physical mapping
DNA原位杂交(in situ hybridization，ISH)是一
项利用标记的 DNA探针直接在染色体、间期核和
DNA纤维定位特定靶 DNA序列的技术，它将基因
组的 DNA序列组成和染色体、问期核的结构与组织
直接关联起来 ，为宏观的细胞学和微观的分子生物
学架起一座桥梁，形成了一门新的交叉学科——分
子细胞遗传学(molecular cytogenetics)。这项技术创
建于2o世纪60年代末。1969年 3个研究小组几乎
同时报道了使用放射性标记的 DNA或 RNA对细胞
制片或组织切片的染色体进行的原位杂交实验 。
收稿13期：2006-02—15，修回13期：2006-05—15。
基金项目：国家自然科学基金资助项 目(39870423)。
作者简介：佘朝文(1964一)．男，教授，博士，研究方向为植物分子细胞遗传学。
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武 汉 植 物 学 研 究 第 24卷
在染色体原位杂交技术的初创期，都是采用放射性
同位素标记探针，需要采用放射 自显影进行检测。
这种检测上的限制及当时分子克隆方法的缺乏使得
DNA原位杂交技术不能很快得到广泛应用。1982
年，Langer—Safer及其合作者 ’ 采用生物素标记的
探针进行染色体原位杂交，建立了非放射性原位杂
交技术(nonisotopic in situ hybridization)。1985年这
项技术被引进到植物 。在非放射性原位杂交中，
杂交位点 可通 过免疫 酶联反应或荧 光素来检
测 ’ ，其中通过荧光素检测杂交位点的原位杂交
称为荧光原位杂交 (fluorescence in situ hybridiza．
tion，简称 FISH)。与通过免疫酶联反应检测的原位
杂交技术相比，FISH技术的程序简单、灵敏度高、对
比明显、可同时检测多个探针。这些优点使之迅速
成为原位杂交的主流技术。20年来，植物荧光原位
杂交技术不断得到发展，并在植物基因组分析中得
到广泛应用 。
1 植物荧光原位杂交技术的发展
衡量 FISH技术的两个最重要的参数是检测灵
敏度(sensitivity)和空间分辨力 (resolution)。检测
灵敏度是指能够毫不含糊地在靶位被检测到的最短
DNA序列，在实践中，它相当于能在两个姐妹染色
单体的相同位置或同源染色体的对应位置显现杂交
信号的被观察靶 DNA的 10％ ～20％大小。在最佳
的杂交和检测条件并使用最灵敏的 CCD(charge—
coupled devi~e，电荷藕连装置)照相机的情况下，检
测灵敏度主要依赖于探针分子与靶 DNA的易接近
程度，因而取决于染色质的凝缩程度 ¨。FISH的
空间分辨率是指在荧光显微镜下能够区分的两个相
邻信号的最小物理距离。在光学显微镜的最大分辨
率(为0．2 m)已限定的情况下，FISH实验中靶序
列的作图分辨力由它们在染色体 DNA上的自然距
离决定，而这种距离随染色质凝缩水平的变化而有
显著的变动。基因组大小、细胞类型、异染色质化程
度、特别是细胞核分裂时期的不同，染色质的凝缩程
度都会发生变化，因而 FISH 的分辨力也不相同。
染色质凝缩水平越低，FISH的分辨力就越高 引¨。
植物 FISH技术主要围绕增加灵敏度和提高分辨力
而不断得到革新，其应用领域也因为技术的进步而
不断得以拓展。
1．1 探针标记技术
最先使用的非放射性标记物是生物素(biotin)。
用与生物素结合的核苷酸(通常为 Biotin—UTP)标记
的探针可用结合有荧光素的亲和素(avidin)或链亲
和素(streptavidin)检测 ’ 。后来又发展了地高辛
(digoxygenin，来自毛地黄的一种类固醇)标记方法。
用与地高辛结合的核苷酸(通常为 Dig—u1’P)标记的
探针可用连有荧光素的抗地高辛抗体检测。这两种
标记方法都属于间接标记，标记的探针还可使用抗
抗体进行级联放大，以提高检测的灵敏度。除间接
标记外，还可用连有荧光团(fluorophore)的核苷酸
直接标记探针分子，这种直接标记的探针与染色体
杂交后不需要特殊的检测步骤就可直接显示杂交位
点，不仅实验快速而且背景相对较干净，只是检测的
灵敏度有所降低 ¨。FISH实验中的探针 DNA是
采用酶学方法标记的。最常用的方法是缺 口平移
(nick translation)标记、随机引物(random primer)标
记和PCR标记 ¨。标记所产生的探针长度一般要
求在 300 bp左右，这样的长度既可与靶 DNA形成
稳定的杂种 DNA分子，又能够容易地进入染色质构
型中的 DNA。使用缺 口平移和随机引物标记方法
一 般可以获得合适的探针长度，但是 PCR标记只适
合于小的质粒插入 DNA¨ 。有实验显示将 DNA亚
克隆或切成较小的片段后再标记可以显著地提高标
记效果 。
用生物素和地高辛两种半抗原可同时标记两种
不同的 DNA分子，利用两种不同的荧光素可以同时
检测它们在染色体上的位置u 5 J。这种双色 FISH
(dual FISH或 double FISH)技术可以确定不同DNA
序列在植物染色体上的分布和排列，从而大大拓展
了FISH技术的应用范围。使用比率标记探针(ratio—
labeled probes)，并与单个标记探针结合，可以进一
步增加检测 目标的数 目 ¨" 。增加检测靶位数的
另一种方法是用额外的探针对染色体标本进行反复
杂交 引，这在植物基因组的物理作图中已有较多的
应用 ·驯。最近，Islam．Faridi等 发展了一种多
个探针 FISH鸡尾酒技术 (muhipmbe FISH cock—
tail)，他们先通过单色和双色 FISH将高粱 1号染色
体连锁图的 RFLP标记锚定的 BAC克隆进行体细
胞中期染色体定位，确定它们相对于着丝粒、核仁组
织区(NOR)的位置和相互间的方向，然后用这些克
隆的生物素或地高辛标记混合物(按在染色体上的
顺序相间配置)与粗线期染色体杂交，获得了反映
这些克隆在粗线期染色体上的排列顺序和方向的红
绿相间的杂交信号图型。这种 FISH技术提供了一
种特别强大的植物基因组作图方案L2l 。
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第4期 余朝文等：植物荧光原位杂交技术的发展及其在植物基因组分析中的应用 367
1．2 不同探针 DNA序列的 FISH技术
在植物 FISH实验中应用得最多的探针分子是
克隆的重复 DNA序列，典型的是 rDNA和其它主要
的串联重复序列。重复DNA序列在靶位上的拷贝数
多，其 FISH的检出率很高，重复性好，结果可靠。在
FISH实验中也可选用单拷贝或低拷贝 DNA序列作
探针。不过，在植物有丝分裂染色体中定位几个 kb
大小的单拷贝或低拷贝 DNA序列在技术上比较困
难 ，原因是：植物材料的染色体制片往往有较多
的背景，杂交经检测程序后常常会产生一些背景信
号，使真正的杂交信号不易与背景信号相区分；而
且，由于靶 DNA序列小，探针接触靶 DNA的几率
小，探针不易与靶 DNA杂交，或杂交后显出的信号
弱，致使杂交的检出率很低，实验的重复性较差。一
般认为植物中期染色体在信号不放大和不使用 CCD
照相的情况下可检测的目标 DNA不低于 lO kb，通过
信号的放大并用 CCD照相，则可检测 1—3 kb的靶
DNA¨ 引。有几项研究表明，采用高灵敏度的酪胺信
号放 大 FISH(tyramide signal amplifcation FISH，
TSA-FISH或 Tyr-FISH)技术可以显著地提高小的单
拷贝序列的检出灵敏度 。例如，在转基因洋葱
的中期染色体 TSA—FISH检测到了7lO bp的T．DNA
插入 ；在大麦中 TSA—FISH能有效地检测 RFLP
(基因的cDNA克隆)的杂交位点 。
采用植物基 因组 的大片段克隆 (即 BAC和
YAC克隆)作探针的 FISH技术克服了单拷贝或低
拷贝序列难以杂交和不易检测的困难 珈 。BAC
克隆的插入片段为 100—200 kb，YAC克隆更大，与
靶 DNA的杂交几率大大增加，而且杂交信号的强度
和检出率显著提高。BAC．FISH和 YAC．FISH技术
不仅能够有效地进行单拷贝或低拷贝基因的物理作
图 ’28,加-32]，而且，BAC．FISH还在植物分子细胞
遗传图的构建 ¨ 、染色体的识别与核型
分析 -40]以及小基因组染色体的涂染 等多个
方面显示了强大的优势，极大地促进了 FISH技术
在植物中的应用。不过，大片段克隆中常常含有重
复序列，这些重复序列会在靶位之外的染色体区域
产生非专一的杂交，因此需要在杂交液中加人过量
的非标记 Cot一1 DNA来封阻重复序列。
因为植物基因组的差别主要源于它们的重复
DNA序列的不同，而且植物基因组中都有高含量的
专一重复序列，因此整个基 因组 的 DNA可作为
FISH探针来识别植物杂种、异源多倍体和重组的
育种品系中不同来源的染色体和染色体片段 ’川，
这一重要的 FISH技术变型称为基因组原位杂交
(genomicin situ hybridization，GISH)。在 GISH中一
般需要在杂交液中加入过量的来 自另外一个亲本基
因组的总 DNA来封阻非专一的交叉杂交，使不同的
基因组得以区分。可使用不同的半抗原标记不同来
源的基因组总 DNA，对异源多倍体和近缘物种的种
间杂种或它的衍生系进行 多色基因组原位杂交
(multicolor genomic in situ hybricization，McGISH)分
析 ’46]。McGISH在确定源自属间杂交的易位染色
体基因组来源方面比一般 GISH的分辨能力要高得
多 。在没有封阻的情况下，用一个物种的基因
组总 DNA与近缘或远缘物种的染色体杂交的GISH
分析也可以研究植物基因组的进化l49’驯或进行 比
较基因组分析 。还可以用两种不同标记的基
因组 DNA探针，采用探针经过预退火反应的同时基
因组原位杂交(simultaneous genomic in situ hybri．
dization with probe preannealing，SP-GISH)来分析某
个物种与近缘或远缘物种间相同和不 同的重复
DNA顺序在染色体上的分布特征，从而探讨植物的
进化关系 J。
在人类和动物中，用来自流式分拣或微切割染
色体的DNA序列构建的探针池可以涂染有丝分裂
或减数分裂期和间期核的单个染色体 J，但这种染
色体原位抑制(chromosome in situ suppression，CISS)
FISH技术并不适用于植物。微切割或流式分拣的
单个植物染色体的 DOP-PCR扩增探针常常涂染了
基因组的所有染色体，这可能是由于在植物基因组
中存在大量快速均质化的分散重复序列的缘故 。
在小基因组的拟南芥和它的近缘种中已发展了另一
种策略的染色体涂染技术，采用属于某一染色体或
染色体臂的大量的 BAC和 YAC克隆探针混合物可
对该条染色体或它的一个臂进行专一的涂染 1． 。
1．3 不同凝缩程度染色质的 FISH技术
到目前为止，植物 FISH技术中使用的模板包
括：有丝分裂早中期和中期染色体 、间期细胞核、减
数分裂粗线期染色体和 DNA纤维。这些模板上的
DNA包装程度不同，因而 FISH的检测灵敏度和空
间分辨力有很大的差异 引¨。
植物 FISH实验使用得最多的模板是有丝分裂
早中期和中期染色体。这类染色体制备容易，并且
它的着丝粒、端粒和次缢痕等形态特征容易识别，有
助于染色体的鉴别和杂交信号的定向。但是，由于
早中期和中期染色体的染色质凝缩程度很高，因而
FISH的灵敏度和分辨力都不高。一般来说，中期染
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色体 FISH技术的分辨力为 5～10 Mb ¨ ，检测灵敏
度为 lO kb左右。最近，Cheng等 在水稻的 FISH
分析中显示，早中期染色体的分辨力有所提高，但仍
不能区分距离小于2 Mb的相邻序列。因此，早中期
和中期染色体 FISH技术适合于对较大的单个 DNA
序列以及两个或多个相距较远的 DNA序列进行物
理定位。当需要对两个靠得较近的 DNA序列同时
定位并分析它们在染色体上的排列和方向时，中期
染色体 FISH技术就不适用了。
植物减数分裂粗线期染色体的凝缩程度比有丝
分裂中期染色体的低得多，其长度比相应的中期染
色体大 7～5O倍。粗线期与有丝分裂中期的染色体
长度比与基因组的大小有密切的关系，例如在黑麦
中为7倍，玉米中为 lO倍，番茄中为 l5倍，拟南芥
中为2O倍，水稻中为4O倍，因此基因组的大小也是
影响粗线期染色体 FISH(Pachytene—FISH)分辨力的
重要因素。粗线期染 色体 FISH 的分 辨率可达
100 kb左右 ¨。早粗线期染色体比晚粗线期染色
体长，因而其 FISH的分辨力要高 ¨·朝]。不过，早粗
线期染色体难以区分限制了它的应用。粗线期染色
体的异染色质区和常染色质区的 FISH分辨力也有
明显的差异 ¨弱J，异染色质区和常染色质区的分辨
力，在番茄中分别为 1．2 Mb和 l2O kb，在拟南芥中
是 140 kb和 6O kb。粗线期较低凝缩程度的染色质
使探针 DNA容易进入，因而 FISH的检测灵敏度也
有所提高。植物粗线期染色体具有显著的常染色
质、染色粒和大异染色质块的分化，在荧光染料 DA—
PI染色后呈现特征性的图型，使染色体很容易被识
别。这些优点使粗线期染色体 FISH更适合于定位
单拷贝 DNA序列 、阐明重复序列在染色体上的
组织 、以及整合基 因组 的遗传学图和物理
图 ’ ’ 65t。用粗线期染色体作为 FISH
模板也有一些不足：选择时期合适的用于制备粗线
期染色体的花粉母细胞较费时费力；多倍体的粗线
期染色体因为有复杂的配对构型、不联会和染色体
粘连等情况而使分析特别困难；大基因组的粗线期
染色体很长，难以追溯和识别单个的染色体。
与分裂期的染色体相比，间期细胞核的染色体
凝缩程度很低，FISH的分辨力可提高到 5O kb【1 。
在人类间期核的 FISH分析中发现，间期核中两个
信号点的距离与两个探针的线性距离具有很强的相
关性。当两个探针的间距在 100 kb至2 Mb时，间期
核中信号点间的距离与它们在染色体上的物理距离
成线性相关关系，因此间期 FISH作图可用来测定
染色体上两个相邻序列间的物理距离 ’671。Jiang
等口 皤 首先将间期核 FISH(interphase FISH)技术应
用到植物基因组分析中，在玉米中发现相距 140 kb
的两个序列在间期核的间距为 0．5 m，以此为依
据，判断出另外两个在间期核中相距 2．32 m的
DNA序列的物理距离大约是 650 kb。可见问期核
FISH可以作为定量地分析物理图谱中相邻重叠群
间隙的一种工具。不过，间期核缺乏可辨别的染色
体结构，无法分辨单个的染色体，不能确定 FISH信
号相对于着丝粒、端粒和其它染色体标记的位置；而
且在不同的细胞类型和染色体区域，染色质的凝缩
模式和程度不同，必须有相应的对照标准。这些不
利因素限制了间期核 FISH的应用。
用间期细胞核制备的 DNA纤维可以用作 FISH
的模板，这种 DNA纤维 FISH(Fiber—FISH)显著提高
了FISH技术的灵敏度和分辨力【J 。最早采用在玻
片上用碱性变性剂处理间期细胞核然后进行铺展
的方法制备了人类的 DNA纤维 。之后，制备伸
展 DNA纤维的方法几经改进，使 DNA纤维的伸展
程度从最初的 80 kb／~m 达到了2．5～3．5 kb／
7ol
。 这一数值与 B型 DNA双螺旋分子的理论
值 2．97 kb／ m十分接近。Fiber—FISH技术在 1996
年被引入植物分子细胞遗传学研究 。在植物中
普遍采用 STE溶解缓冲液(含 SDS、EDTA和 s)
制备 DNA纤维 卜巧J。DNA纤维的伸展程度在拟
南芥和水稻中分别为 3．27和 3．21 kb／~ml”·弱 。
高度伸展的植物 DNA纤维使 FISH的灵敏度和分辨
力大大提高：分辨力达到 l～2 kb，灵敏度可达到
<700 bp 。这些强大的优势使得 Fiber—FISH能
够直接显示 DNA序列的线性位置，分析不同 DNA
序列的线性排列关系 · 引。而且，还可以根据
DNA纤维的伸展程度来测定 DNA序列的长度和拷
贝数 ， · ，以及两个相邻 DNA序列之间间隙
的大小【J ，从而直接对 DNA进行定量分析。不过，
Fiber—FISH也有它的不足，主要是：它不能阐明靶序
列相对于着丝粒、端粒和异染色质块等染色体标记
的位置和取向，如果没有已知位置的DNA标记的共
定位则不能鉴别染色体 ¨。
最近 Val6rik等 副发展了一种超伸展的流式分
拣植物染色体(super—stretched flow—sorted plant chro—
mosomc)高分辨 FISH技术。流式分拣的大基因组
(包括大麦、小麦、黑麦和鹰嘴豆)染色体在玻片上干
燥后经温和的蛋白酶K消化和乙醇：冰醋酸(3：1)伸
展，可获得比中期染色体长 100倍以上的伸展的染
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第 4期 佘朝文等 ：植物荧光原位杂交技术的发展及其在植物基因组分析中的应用 369
色体纤维，以此为模板的 FISH技术的分辨力和灵
敏度分别可达 7O kb和 1—2 kb。由于这种超伸展
的染色体之间不重叠，又保持了染色体的完整性，并
有较大范围的伸展程度，可以用于研究染色体的超
微结构，因此与 Fiber—FISH技术相比具有一定的优
势。此 FISH技术特别适合于难以进行粗线期染色
体 FISH研究的大基因组。它的不足是需要用流式
细胞仪分拣染色体。
2 FISH技术在植物基因组分析中的应用
FISH技术是直观地在染色体、间期核和 DNA
纤维上显示 DNA序列，使基因组的 DNA序列组成
与染色体、间期核的结构和组织直接联系起来，因此
能够提供许多其它方法(如纯粹的分子生物学方
法)所不能揭示的有关植物基因组的组织、动态变
化和进化等方面的信息。FISH技术在植物基因组
分析中主要有以下几个方面的应用。关于基因组原
位杂交(GISH)技术在植物中的应用。限于篇幅，本
文不作讨论，请参阅有关文献 J。
2．1 物理定位 DNA序列。并为染色体的识别提供
有效的标记
FISH技术能够将单或低拷贝基因和重复 DNA
序列直接定位到染色体上，提供基因或重复 DNA序
列在染色体上的物理位置信息。对具有重要经济价
值的单或低拷贝基因进行 FISH物理作图，在基因
的图位克隆和其它的物理作图策略中有十分重要的
价值，但由于单或低拷贝序列有难以杂交和不易检
测的困难，目前有关植物单或低拷贝基因定位的报
道不是很多|5 帅’弘]。绝大多数的植物 FISH实验
是对重复 DNA序列或 BAC克隆进行物理定位，而
重复序列和 BAC克隆的FISH信号往往可以作为染
色体识别的有效标记。
染色体的准确识别和精确的核型分析是植物基
因组研究的基础 。在多数植物中，单凭染色体的
形态学特征难以识别全部的染色体。尽管染色体显
带技术(如 C一、N一显带技术)的应用使一些植物的染
色体得以准确识别，但是许多植物的染色体经显带
程序处理后不能产生相应的带纹或产生的带纹数有
限，它们的染色体仍然难以被准确地识别。DNA序
列的FISH信号为染色体提供了有效的细胞遗传学
标记，这些标记与染色体的形态学特征一起，使很多
植物的全部或部分染色体得以准确识别，由此建立
了精确的核型。
rDNA的 FISH信号是使用得最多的染色体识
别标记。由于 rDNA的高拷贝数和串联重复的特
性．两种 rDNA探针的FISH作图能够以很高的重现
性在45S和5S rDNA位点产生杂交信号，杂交信号
的有无、数目、位置和大小均可作为染色体识别的标
记。在有些植物中，例如大麦 。 、湿地松(Pinus
elioti) 引、拟 南 芥 叫 和 芸 薹 属 的 一 些 物
种_9卜 ，45S和5S rDNA的双色 FISH能够区分基
因组的所有或大多数染色体 ；而在其它许多物种中，
45S和5S rDNA的双色或单色杂交也能识别部分染
色体 舛圳 。
在小麦族的物种中，串联重复卫星序列和某些
微卫星序列的 FISH定位可产生特征性 的杂交带
型，使全部或多数染色体得以识别。例如，来自节节
麦的克隆pAsl能够识别整个 D组染色体。而来 自
黑麦的克隆 pScl 19．2主要与 B组染色体杂交。这
两个克隆的双色 FISH带型能够识别普通小麦的 17
对染色体 J。来 自大麦的(GAA) 微卫星序列与
大麦染色体杂交，产生的 FISH带型与大麦的 N．带
对应，能够识别所有的大麦染色体 ¨ 。采用 pAsl
和含有(GAA) 微卫星序列的大麦克隆 pHvG38进
行的双色 FISH能够识别普通小麦 的全部染色
体 。在玉米中，多种重复序列的 FISH信号标记
提供了改进的减数分裂和有丝分裂染色体的核型分
析方法 Ⅲ]。最近，Kato等 用新分离的3个玉
米重复序列克隆和包括 CentC、染色纽专一序列、
45S rDNA、TR一1在内的其它6个重复序列，发展了
一 个多色 FISH程序，使 14个玉米品系体细胞的 1O
对染色体中的每一对都产生了独特的杂交带型和颜
色图型，据此能够准确识别玉米的体细胞染色体。
BAC—FISH能够为较小基因组的单个染色体识
别提供新的有效的细胞遗传学标记，已应用于多种
植物的染色体识别和核型分析。Dong等 用连锁
遗传图的 RFLP标记从马铃薯的 BAC文库中分离
了一套分别对马铃薯 12对染色体专一的 BAC克
隆，这些克隆的 FISH信号可以作为识别马铃薯单
个染色体的有效标记。Cheng等[2引用 RFLP标记筛
选的24个水稻染色体臂专一的 BAC克隆和CentO、
45S rDNA等进行的 FISH分析，准确地识别了水稻
的粗线期染色体，并以此为基础建立了水稻粗线期
染色体的分子细胞遗传学核型。高粱的有丝分裂中
期染色体很难凭借其形态学特征来识别。Kim等[37J
用靠近高粱连锁遗传 图末端 的分子标记筛选 的
BAC克隆混合物进行的同时荧光原位杂交(simuha．
neous fluorescence situ hybridization of a landed
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370 武 汉 植 物 学 研 究 第24卷
BAC cocktail)可以同时识别高粱的 lO对染色体，由
此建立的基于 FISH的高粱核型整合了连锁遗传图
标记和细胞学标记。Kim等 进一步用这种基于
FISH的核型分析方法与染色体的长度和臂比分析
相结合 ，建立了以大小为基础的高粱染色体和连锁
群命名法，这一命名法有助于建立统一的高粱染色
体命名系统。在小麦这样 的大基因组，筛选到的
BAC克隆的FISH信号也可用于识别染色体甚至区
分普通小麦的 3个染色体组，不过这种 BAC-FISH
对染色体的识别是依赖 BAC克隆中所含的重复序
列对染色体不同位点的杂交 ’ 。
2．2 对相同 DNA序列进行比较物理定位。探讨基
因组的进化
对 rDNA在不同种属中的比较物理定位研究得
最多。rDNA的 FISH物理定位提供的信息可用于
研究植物近缘种属的系统学关系和异源多倍体的起
源_】 ”J，以及与进 化相联 系 的染色 体结构 变
化 ¨13]。rDNA位点的染色体位置在近缘物种中
一 般是保守的，例如小麦的祖先种和它们衍生的多
倍体种在经历了长时间的平行进化后 rDNA的位置
仍然保守 “¨ ；在芸薹属植物中，A基因组特征性的
臂中间的rDNA位点可用作双二倍体中A基因组来
源的指示标记 14]。多倍体物种的 rDNA位点数应
预期是祖先二倍体物种位点数之和，但许多属的异
源多倍体物种的 rDNA位点数并不总是它们祖先二
倍体物种位点数之和 · “ is]。例如，在四倍体
棉花(Gossypium hirsutum)中45S rDNA主位点数相
对 于两个 推定 的二倍 体祖先种 的位 点数减少
了 16]。Mishima等⋯ 发现 在蔷 薇科 的地 榆属
(Sanguisorba)的多倍体物种中，重复的5S rDNA位
点倾向于被消除，而重复的 45S rDNA位点则倾向
于保留。有许多报道显示，同属的二倍体物种间的
rDNA位点数也有较大的变化。例如，稻属(Oryza)
的6个二倍体种的 rDNA位点数从 1对到 3对不
等，rDNA位点所在的染色体位置和 rDNA重复单位
的拷贝数也出现变化 ¨ 。在芸薹属中，具有 A、B
或 C基因组的3个基本的二倍体中的45S rDNA位
点数分别是 5对、3对和 2对⋯ 。rDNA位点在亚
种间甚至不同的栽培种间也表现出差异的情况。栽
培稻的粳稻(O．sativum ssp．japonica)只有 1对45S
rDNA位点，而籼稻(O．sativum ssp．indica)则有 2
对位点 引¨ 。洋葱 (Alium cepa)的栽培品种 New
Mexico Yelow Grano在第6和 8染色体短臂的末端
各有 1对 45S rDNA位点 ¨ ，而栽培品种 Francesa
则在一条 8号染色体的长臂末端还有一个位点[123]。
在较大的分类单位内的物种间比较，同属禾本科的
水稻、玉米和小麦基因组的基因顺序是保守的 ¨J，
但这 种基 因顺 序 的保守 性 并 不 适 用 于 rDNA
位点 加。。
2．3 构建植物基因组的物理 图谱
FISH技术已成为植物基因组物理作图的重要
工具之一。与使用大插入片段 DNA克隆进行的重
叠群组装以及通过缺失系和易位系等细胞遗传学材
料将 DNA定位到染色体片段等物理作图方法相比，
FISH物理作图具有许多优势：它可以直接显示不同
DNA序列的排列次序并测量它们之间的物理距离；
可提供不同水平的空间分辨力；不需要特殊的细胞
学材料，因而可适用于许多物种；尤为突出的是，它
能比较简便地将连锁遗传图和物理图整合，构建植
物基因组的分子细胞遗传学图。因为在技术上比较
难以检测只含几个 kb DNA序列的小探针 J，因此
多数用于遗传作图的 RFLP不能直接用于 FISH物
理作图。用 RFLP从基因组文库筛选含大插入片段
的 BAC克隆，然后用这些克隆在粗线期和／或有丝分
裂中期染色体上进行 FISH物理作图，是一种十分有
效的植物基因组物理作图策略_】9． ’ 。由于用于
作图的BAC克隆在遗传图上的位置是已知的，因此
在得出这些克隆的物理图的同时即实现了物理图和
遗传图的整合。最早 Cheng等 ¨采用水稻 lO号
染色体上 l8个 RFLP锚定的BAC克隆，结合 rDNA
和着丝粒序列 pRCS2，对该染色体进行了粗线期
FISH物理作图，并将物理图与该染色体的遗传图进
行了完全的整合。这一研究不仅重新确定了该染色
体着丝粒的遗传位置，而且还发现遗传重组沿 lO号
染色体主要呈均匀分布，但高度异染色质化的短臂
显示了比主要是常染色质的长臂较低的重组频率。
在高粱中，采用多探针 FISH鸡尾酒技术已绘制了
1、2和8号染色体的分子细胞遗传学图[2 2]。比
较这些染色体的遗传图和细胞学图发现，重组频率
在染色体不同区域有较大的差异，近着丝粒区的异
染色质在很大程度上缺乏重组，重组主要发生在基
本属常染色质的远端区，例如含有 NOR的 1号染色
体的近着丝粒区占了该染色体的 60％，但这个区域
只代表了该染色体的 0．7％的遗传图距 。除上
述这些例子外，不同的研究小组已采用同样的作图
策略对苜蓿(Medicago truncatula) 、甘蓝(Brassica
oleracea) 和百脉根(Lotus japonicu~)¨圳进行了物
理作图分析，并与遗传图进行了整合。值得指出的
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第4期 佘朝文等：植物荧光原位杂交技术的发展及其在植物基因组分析中的应用 371
是，在玉米、大麦、小麦等大基因组植物中，RFLP标
记筛选的BAC克隆含有很多的重复序列，而含单一
序列很少，在没有用非标记的重复 DNA进行精确封
阻的情况下，其中的重复序列(主要是反转录转座
子)往往与基因组染色体的许多区域杂交，甚至涂
染整个基因组 幻’m ，因此大基因组难以用 BAC—
FISH进行基因组物理作图。Stephens等 采用高
灵敏度的TSA—FISH技术，直接对大麦的 RFLP(cD—
NA克隆)进行了物理作图尝试，显示这种技术可以
作为大基 因组 FISH物理作 图的一种 可选择 的
方法。
2．4 揭示特定染色体区域的DNA分子组织
采用 Pachytene—FISH技术可以显示某一染色体
区域内不同 DNA序列相对于着丝粒、端粒、NOR和
其它特殊染色体区域的位置信息，而 Fiber—FISH技
术可以直接显示 DNA序列在染色体上的线性位置，
阐明特定区域内不同 DNA序列相互间的排列关系。
因此这两种高分辨的 FISH技术在阐明端粒、着丝
粒和其它特定染色体区域的 DNA分子组织方面能
够发挥不可替代的作用 ，’ 127]。例如，在番茄
中，Pachytene—FISH和 Fiber—FISH确定了端粒序列
(TR)和亚端粒序列(TGR)在每个染色体臂末端的
分布情况以及它们的排列方式 。又如，通过 Fi—
ber—FISH分析，阐明了水稻和玉米的着丝粒是由夹
杂排列着的着丝粒卫星 DNA和着丝粒专一的反转
录转座子(CR)构成 ” 。
2．5 分析间期核中染色质的组织和细胞周期中染
色体的动态变化
通过端粒和着丝粒重复序列对间期核的双色
FISH定位可以分析着丝粒和端粒在体细胞间期核
中的配置情况，从而分析间期核染色体的组织方式。
FISH研究发现，在小麦 、黑麦和大麦等大基因组物
种中，问期核的染色体呈现经典的 Rabl构型，即着
丝粒和端粒位于核被膜相对的两侧_】 引，说明在这
些物种解凝缩的问期染色体仍保持了分裂后期的排
列方式。但在水稻这样具有小基因组的物种中，问
期核的端粒和着丝粒并不呈现 Rabl构型，推测 Rabl
构型的保持可能仅仅是大染色体或大基因组植物细
胞核染色质的扩散受到约束的结果【128]。
端粒和／或着丝粒 FISH还用于研究植物前减
数分裂问期细胞的端粒与着丝粒的配置和减数分裂
同源染色体联会前和整个前期 I的染色体动态变
化 ¨ ” ，以及筛选和鉴别减数分裂突变型 ¨ 。
对玉米、小麦和黑麦等植物的研究显示，在同源染
色体配对前(细线期)，端粒聚集在核被膜内表面的
一 个小 区域，成 为 紧 密 的 一 簇，产 生 花 束 构
型[】 130,136]。一般认为这种端粒聚集促使同源染
色体末端的共定位，因而促进涉及末端或亚末端染
色体区同源染色体的早期联会模式——花束的形
成[136,137]。对玉米的 FISH分析显示，减数分裂的着
丝粒也在花束期前被极化，但这种极化并不是花束
形成的促成因素【136]。对拟南芥减数分裂细胞端粒
和着丝粒进行 FISH分析显示‘】 J，在早前减数分裂
间期(包括 S期)不配对的端粒与核仁紧密相连；在
G2／早细线期端粒仍与核仁相连，但同源染色体端
粒配对 日益增多；随着细线期的推进，配对的端粒与
核仁分离并广泛分布到核的周边，到偶线期时端粒
在核的一个半球显示松散的聚集。这些结果表明，
在拟南芥中经典的细线期／偶线期花束在功能上被
与核仁相连的端粒聚集所取代。
FISH技术也可用于研究植物单个染色体在间
期核中的组织方式。普通小麦的黑麦染色体附加
系、燕麦的玉米染色体附加系和含有黑麦 B染色体
的黑麦或普通小麦品系，可通过用附加染色体所属
的基因组 DNA探针或 B染色体专一的 DNA序列探
针进行 FISH分析，“涂染”附加的染色体或 B染色
体，从而研究体细胞或减数分裂细胞间期核染色体
的组织 引、细胞周期中染色体的行为 训¨，以及
基因突变等因素对染色质组织的影响 140,¨ 。¨对于
小基因组的拟南芥，通过利用覆盖一条染色体或一
个染色体臂的 BAC和 YAC克隆群对间期核的某一
染色体或某一染色体臂进行 FISH涂染_4 ，可以直
接观察染色体在间期核的组织[142]。FISH涂染分析
表明，拟南芥的单个间期染色体组织成为异染色质
的染色中心(chromocenter)和从中心中发散出的常
染色质环，染色 中心和环形成一个染色体领域
(chromosome teritory)[142]。
直接观察植物细胞间期核 45S rDNA的 FISH
信号已用于研究 rRNA基因在细胞核中的组织和表
达模式[1 。对多种植物的体细胞间期核的45S
rDNA FISH分析揭示，间期核 rDNA FISH的信号基
本上可归为两种类型：较粗且荧光很亮的纽(knob)
和相对较小且荧光较弱的杂交点(spot)，前者代表
了处于凝缩状态的非活性的 rDNA，后者则代表了
rDNA的活跃转录 14,145]。
2．6 鉴定植物转基因
FISH技 术 是 鉴 定 植 物 转 基 因 的 有 力 工
具n 153]。转基因的FISH分析是用包括载体和 目
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372 武 汉 植 物 学 研 究 第 24卷
的基因在内的 DNA(delivered DNA)探针与转化植
株的染色体、DNA纤维或间期核杂交。由于转化的
基因为小的单拷贝序列，转基因的 FISH分析需要
有优良的染色体制片和灵敏度、精确度都较高的
FISH程序 ¨。’m]。改进探针标记 ¨和使用 TSA—
FISH 都可以提高转基因的检测灵敏度和检出率。
转基因的 FISH分析与传统 的转基 因表 型分析、
Southern 印迹分析相比有明显的优势，是对传统分
析方法的有力补充。对转基因植株中期染色体的
FISH分析可对整合的转基因进行精确的染色体物
理定位和确定转基因的位点数。FISH分析显示，通
过根癌农杆菌转化的植物一般只有一个转基因位
点 ¨ 】。而在通过微弹轰击转化的植物常常可观
察到一个以上的转基因位点[159—162]。到目前为止，
除一项以转基因小麦为研究材料的报告外 ¨ ，其
它所有的转基因植物的 FISH分析都显示，转基因
在染色体上的整合不是随机的，往往是优先整合到
染色体的远端区。转基因大麦整合位点侧翼区的数
据显示，转基因优先整合到基因丰富区 ¨ 。FISH
分析可以较简便地鉴别转基因植株是杂合子还是纯
合子 ∞¨’ J。FISH技术还可以揭示转基因位点的
结构。研究表明，小麦、燕麦的多数转基因位点由多
个转基 因 拷 贝 和散 布 其 中 的基 因组 DNA组
成 ¨ ，Fiber．FISH技术直观地显示了转基因位
点中散布的基因组 DNA‘】 ’165]。在小麦中，转基因
有 3种基本的插入模式：大的串联重复整合、大的串
联重复整合夹杂基因组 DNA及小的可能是单个转
基因拷贝的插入 ¨ 。在微弹轰击转化获得的燕
麦、小麦和小黑麦转基因植物的中期或早中期染色
体上，许多被当作单个 FISH信号检测的转基因位
点显示是由两个或多个整合位点构成的簇，这表明
在某些位点转基因组织成簇，其间夹杂着很大的基
因组 DNA片段 ·l6lJ。对小麦间期核转基因
FISH信号的3．D分析显示，中期染色体上相隔很远
的整合位点在间期核中相互靠近，这提示了一种通
过微弹轰击转化的转基因整合机理 tr0]。FISH分析
还显示微弹轰击转化植株的整合常常与重排的染色
体相联系 叭’ J。
3 结束语
FISH技术的产生与发展是过去5O年来细胞遗
传学在技术上最富有意义的里程碑。已发展的多种
植物 FISH技术为植物基因组研究提供了新的强大
的工具，这些技术的应用，使得我们能够研究染色体
结构的细节，分析染色体的行为，解析基因组的结构
及其与染色质的联系，促进基因组测序。随着更多
的植物基因组被测序，FISH技术作为研究染色体组
织和行为的重要工具，将会对这些基因组的功能研
究发挥更大的作用。在植物基因组分析中，可根据
不同的需要，采用不同的 FISH技术；还可以将 FISH
技术与蛋白质荧光染色技术等其它分子细胞遗传学
技术结合，检测各种染色质蛋白质与专一 DNA序列
的相互作用情况 ’ ’ ，从而更进一步推进植物
基因组学的发展。
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