全 文 ：武汉植物学研究 2003, 21( 1) : 91～94
Journal of Wuhan Botanical Research
中华水韭( Isoetes sinensis)等位酶分析的初步研究
陈媛媛, 叶其刚, 黄宏文

(中国科学院武汉植物研究所/武汉植物园, 武汉　430074)
摘　要: 采用超薄平板聚丙烯酰胺等电聚焦技术对珍稀濒危植物中华水韭( I soetes s inensis Palmer ) 72 个样品的等
位酶遗传变异进行了初步研究。从 24 种酶系统中筛选,得到了 13 种酶系统可用于该植物的遗传变异分析,其中 7
种酶系统在中华水韭的迁地保护居群中检测出 16 个位点,共 27个等位基因, 12 个位点表现出多态性。遗传多样性
初步分析表明: 中华水韭具较低的等位酶遗传多样性。研究结果为中华水韭的综合保育及居群恢复、重建提供了初
步的依据。中华水韭遗传变异的全面研究将在进一步改善等位酶方法的基础上, 采用其它更为灵敏的分子标记方
法做深入检测。
关键词: 中华水韭; 凝胶电泳; 等位酶分析
　　中图分类号: Q949. 36+ 3. 2; Q347　　　　　文献标识码: A　　　　　文章编号: 1000-470X( 2003) 01-0091-04
Preliminary Study on Allozyme Analysis for Isoetes sinensis Palmer
CHEN Yuan-Yuan, YE Qi-Gang , HUANG Hong-Wen


( W uhan B otanical G ard en/ Wuhan Insti tut e of B otany , T he Chinese Acad emy of S ci ences, Wuhan　430074, C hina)
Abstract: T he allozymic diversity w as preliminarily invest igated for 72 samples of r ar e and endan-
gered species I soetes sinensis Palmer, using iso elect ric focusing in thin-layer polyacry lamide slab
gels. 24 enzyme systems were init ially screened, result ing 13 w or kable enzyme systems. A total
of 27 alleles o f 16 loci were detected fr om 7 w ell-resolved enzymes. Al though 12 loci w ere ob-
served to be polymorphic in ex situ conserved populat ions at Wuhan Botanical Gar den, the overall
genet ic diversity is low in I . sinensis. T he study provided pr elim inary evidence that a comprehen-
sive conservat ion and resto ration prog ram is needed for sustainable conserving and recovery of
natural I . sinensis populat ions. A further study of I . sinensis populat ion and conser vat ion genet ics
is urg ent ly needed by employ ing mor e sensit iv e molecular methods.
Key words : I soetes sinensis Palmer; Gel elect rophoresis; Allozyme analysis
　　中华水韭( I soetes sinensis Palmer )是水韭科水
韭属的水生蕨类植物[ 1] ,模式标本于 1922年采自南
京玄武湖 [ 2] , 据记载现零星分布于安徽、浙江、江西
等省少数湿地 [ 3]。近几十年来,由于工农业的发展和
城镇化建设, 我国的内陆湿地急剧丧失; 同时,工业
废水、生活污水和化肥农药对水体的污染也日趋严
重,致使许多水生植物处于濒危状态,中华水韭就是
其中之一, 而且已被列为国家一级重点保护野生植
物[ 4]。我们于 2002年调查了中华水韭在江苏、浙江、
安徽、江西等省的分布情况,结果表明: 中华水韭在
模式产地南京玄武湖已灭绝, 浙江和安徽的大多数
地方居群以及江西东乡居群也已消失, 仅在浙皖两
省各发现 1个野生居群和数个亚居群, 且分布范围
非常狭小。为了挽救这一物种,中国科学院武汉植物


收稿日期: 2002-11-30,修回日期: 2003-01-14。
基金项目: 中国科学院知识创新工程重要方向项目资助( KSCX2-SW-104)。
作者简介: 陈媛媛( 1977- ) ,女,硕士研究生,植物学专业,从事植物保育遗传研究。
通讯作者。
研究所已对一批中华水韭进行了迁地保护, 并着手
开展其细胞遗传学 [ 5]、濒危机制和保护对策的研究。
探讨中华水韭等位酶水平的遗传变异特点对进一步
揭示中华水韭居群和种的遗传多样性及遗传结构是
十分必要的, 同时也为制定中华水韭的取样策略和
保护措施提供科学依据。本实验采用超薄平板聚丙
烯酰胺等电凝胶电泳技术,对中华水韭等位酶的遗
传特点作了初步探讨。
1　材料与方法
1. 1　材料
实验材料取自迁地保护在中国科学院武汉植物
所温室的 72株中华水韭。凭证标本存放于中国科学
院武汉植物所标本馆。取样时间为 2002 年 10～11
月。
1. 2　方法
1. 2. 1　电泳系统
采用黄宏文改进的 Mulcahy 等的超薄平板聚
丙烯酰胺等电聚焦系统 ( IEF-PAGE ) [ 6] , 该系统具
有操作简单、高分辨率、高效率、低耗材等优点。
1. 2. 2　制样
提取缓冲液的筛选: 提取缓冲液 4 种, 1 号、2
号、3号配方分别参照王中仁[ 7]的简单磷酸提取缓
冲液( 1号中未加 PVP-40T , 2号中加 PVP-40T )和
Tr is-HCl提取缓冲液, 4号为Wendel 和Weeden [ 8]
三号提取液。在 0. 1 g 鲜样中分别加入提取液
50
L、75
L、100
L、200
L。
取样部位:成熟叶片和幼嫩叶。
磨样:先将叶片上的附生藻类及泥土清洗干净,
而后剪成小段, 加入少许石英砂和缓冲液, 冰镇研
磨。研磨液在 6 000 r/ m in下离心 5 min后点样或存
于- 70℃冰箱中保存。
1. 2. 3　电泳
上样:分别用 1 mm 2、1 mm×2 mm、2 mm 2的
Whatman 3 号滤纸制作的纸芯子吸取上清液 (酶
液) ,加在距阳极 3～4 mm 处, 样品间距为 1. 5～
2 mm ,每块胶可上 15～20 个样。电泳: 在 50 V、
100 V、200 V、300 V 和 400 V 的恒压条件下各电泳
15 min,即可染色。
1. 2. 4　染色
染色配方参见Wendel和Weeden [ 8]的方法, 用
量减半。分别染 ACP(酸性磷酸酶 E. C. 3. 1. 3. 2)、
DIA (还原型辅酶 I 心肌黄酶 E. C. 1. 6. 2. 2)、EST
( 脂酶 E. C. 3. 1. 1. )、PGI (磷酸葡萄糖异构酶
E . C. 5. 3. 1. 9 )、PGM ( 磷 酸 葡 萄 糖 变 位 酶
E . C. 5. 4. 2. 2)、PGD ( 6-磷酸 葡萄糖酸脱氢 酶
E . C. 1. 1. 1. 44 )、 PRX ( 过 氧 化 物 酶
E . C. 1. 11. 1. 7 )、 SKD ( 莽 草 酸 脱 氢 酶
E . C. 1. 1. 1. 25)等 24种酶系统。
2　结果与分析
2. 1　筛选结果
以上的 24种酶系统中,可以染色的有 13种, 它
们 是: ACP、ADK、DIA、EST、 G6PDH、GDH、
G3PDH、IDH、MDH、PGI、PGM、PGD、PRX。但由
于气温骤降等原因影响到植株的生长和酶的活性,
目前可得到清晰带谱的有 7种: ACP、DIA、EST、
PGI、PGM、PGD、PRX。除 ACP 用 1号缓冲液效果
最好外,其它均用4号缓冲液最好。不同取样部位酶
的活性也有差别,但均以成熟叶片较好。
2. 2　等位酶位点的确定
PGI、PGD 和 PGM 的位点是根据 Caplen 和
Werth 对北美水韭属植物( Isoetes r ip aria)的同工酶
分析 [ 9]而确定的, 其它 5种酶系统的位点则结合其
染色体的倍性( 2n= 4x = 44) [ 5] , 根据 Weeden 和
Wendel
[ 8]、王中仁[ 7]的方法确定。
2. 3　等位酶分析
酸性磷酸酶 ACP (图版 Ⅰ: 1) :单体和二聚体
酶, 有 4个位点,第 1、2位点表现为单体酶,第 3、4
位点表现为二聚体酶,每个位点可以观察到的基因
型为:第 1位点都为 aaaa; 第2位点有 aabb和 aaab
2 种基因型; 第 3 位点均为 abbb; 第 4 位点为
aabb。
还原型辅酶 I 心肌黄酶 DIA (图版 Ⅰ: 2) :单体
酶, 有 2个位点,每个位点可以观察到的基因型为:
第 1位点有 aaaa和 aaab 2种基因型,以 aaaa 为主;
第 2位点有 aaaa、aabb 和 aaab 3种基因型。
脂酶 EST (图版 Ⅰ: 3) : 二聚体酶, 有 4个位
点, 其中第 4位点比较模糊,难以判读, 其它位点的
基因型为:第 1 位点为 aaaa; 第 2位点为 aabb 和
abbb; 第 3 位点为 abbb。磷酸葡萄糖异构酶 PGI
(图版 Ⅰ: 4) :二聚体酶, 有2个位点,但 PGI-2比较
模糊, 没有判读, 在北美水韭上也出现类似的情
况[ 9] , PGI-1的基因型有 aaaa和 abbb。
磷酸葡萄糖变位酶 PGM (图版 Ⅰ: 5) : 单体
酶,有 2个位点, 在北美水韭中 PGM -12和 PGM -21
两个等位基因重叠[ 9] , 在本试验中只能判读到
PGM -2,有 2种基因型 aaaa 和 aaab。
92 武 汉 植 物 学 研 究　　　　　　　　　　　　　　　　　第 21 卷　　
6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶 PGD (图版 Ⅰ: 6) : 二
聚体酶, 有 2 个位点, PGD -1 的基因型为 aaaa,
PGD-2的基因型为 aaaa 和 aaab。
过氧化物酶 PRX (图版 Ⅰ: 7) :二聚体酶, 在中
华水韭有多个位点, 但只有 PRX -1和 PRX-2两个
位点比较清晰, PRX -1有 aaaa和 aabb 2种基因型,
PRX-2有 abbb、aabb 和 bbbb 3种基因型。
本试验在 7个酶系中共检测到 16个可分析位
点, 27个等位基因, 其中有 12位点具有多态性。
3　讨论
从目前的研究结果来看, 中华水韭在等位酶水
平上的遗传多样性是比较低的。这可能是由于中华
水韭栖息地的不断丧失和生境片段化而导致居群的
急剧缩小造成的; 另一方面,中华水韭具有孢子繁殖
和无性分生繁殖的繁殖方式, 由于孢子的传播一般
要在有水域相通的条件下才可进行 [ 10] ,生境片段化
后无性繁殖在一定程度上会增加, 从而降低了遗传
多样性水平。
在本实验中, 有些酶系统染色过浅, 分辨率不
高,以后需要对酶的提取、电泳系统、染色方法和采
样时间等方面加以改进。同时,也要摸索检测遗传多
样性灵敏度更高的其他分子标记(如 AFLP) ,以更
好揭示中华水韭居群的遗传结构和遗传动态,并结
合中华水韭种群生态学、生殖生物学、细胞遗传学等
方面的研究, 为中华水韭的保护和居群恢复提供系
统的、切实可行的理论依据。
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93　第 1 期　　　　　　　　　　　陈媛媛等: 中华水韭( I soetes s inensis)等位酶分析的初步研究
陈媛媛等: 图版Ⅰ CHEN Yuan-Yuan et al .: P late Ⅰ
中华水韭( I soetes sinensis)等位酶图片
Gels pict ur es of I soetes sinensis
94 武 汉 植 物 学 研 究　　　　　　　　　　　　　　　　　第 21 卷