全 文 ：武汉植物学研究 2007，25(6)：539～543
Journal of Wuhan Botanical Research
番茄(Solanum lycopersicum)果胶酸裂解酶 P56
在大肠杆菌中的重组表达
赵庆新 “，王 鑫 ‘，张宇玲 ，袁 生r
(1．南京师范大学生命科学学院微生物工程重点实验室，南京 210046；2．盐城师范学院生命科学与技术学院，江苏盐城 224002)
摘 要：果胶酸裂解酶P56在番茄花粉管伸长过程中起着重要的作用，为了制备番茄P56蛋白的抗体，进行番茄花
粉管萌发过程中 P56蛋 白的免疫组织化学研究，对 P56基因在大肠杆菌系统的重组表达进行 了研究。先采用
Overlap—PCR的方法 ，从番茄基 因组 DNA中克隆了成熟 P56蛋白的 eDNA序列 (LAT56)，再构建重组表达质粒
pEI~8a(+)一LAT56，转化大肠杆菌 BL21一CodenPlus(DE3)一RIL，得到了重组表达工程菌pET-28a(+)一LAT56一BL21一co-
denPlus(DE3)一RIL。在0．5 mmol／L IPTG、15℃和 180 r／min条件下，经过 60 h的诱导培养 ，重组蛋白表达量为细胞
总蛋白的30％左右，主要以包涵体形式存在，重组蛋白经Ni“一nitrilotriaeetate—agr∞e亲和柱层析，得到了SDS—PAGE
显示为单一蛋白带的纯化蛋白。
关键词：番茄 ；果胶酸裂解酶(P56)；大肠杆菌；表达
中图分类号：Q942．6 文献标识码：A 文章编号：1000—470X(2007)06—0539—05
Expression of P56 Pectate Lyase from Solanum lycopersicum
in Escherichia coli
ZHAO Qing．Xin · “，WANG Xin “，ZHANG Yu—Ling ，YUAN Sheng
(1．Key Labfor Microbial Technology in the Colege ofLife~oieltce，Nanjing Nomw．1 Unitersity，Nanjing 210046，China；
2．Colege of~1fe Science and Biotechnology，rarxheng Toachers Z ，Yancheng，Jiangsu 224002，China)
Abstract：P56 pectate lyase play aI1 important role during the extension of pollen tube．In order to obtain
the antibody of P56 for the study of action machnism and distribution of P56 along pollen tube．the reeom—
binant expression of P56 was carried out in Escherichia coli．The cDNA coding mature P56 without signal
peptide was amplified from Solanum lycopersicum by Overlap-PCR．The amplified fragment was ligated to
pET-28a(+)expression vector，then transformed into Escherichia coli BL21一CodenPlus(DE3)一RIL．The
expression of P56 was applied at 0．5 mmol／L IPrrG．15℃ and 18O r／min for 60 h．The recombinant pro—
tein reached about 30％ of total cel proteins and existed as inclusion body in pET-28a(+)一 6一BL21．
CodenPlus(DE3)一RIL cel1．Through Ni 一nitrilotriaeetate—agrose afinity chromatography，the recombinant
P56 was purified to homology based on SDS—PAGE．
Key words：Solanum lycopersicum；Pectate lyase(P56)；Escherichia coli；Expression
果胶裂解酶含果胶酸裂解酶(pectate lyase，EC
4．2．2．2)和果胶酸酯裂解酶(pectin lyase，EC 4．2．
2．1O)两类，植物来源的果胶裂解酶为果胶酸裂解
酶 卜引。
1989年，来 自植物 的果胶酸裂解酶类似序列
P56首次在番茄(Solanum lycopersicum)花粉中被发
现[7]，自那以后，很多类似序列在其它植物的花粉、
花粉管、花柱道等组织中不断被发现-2．9 J。在植物
花粉管萌发和延伸过程中，果胶酶在促进花粉萌发、
降解花柱道细胞壁展、促进花粉管延伸方面具有重
要的意义 。Pare和 Geitmann报道外源的微生
物果胶酶在适当的浓度下对番茄的花粉管伸长具有
显著的促进作用-】 。为了进一步研究果胶酶和果
胶在花粉管伸长过程中的作用机理，前人对花粉管
和花柱道 中的果胶分布进行 了免疫组织化学研
究-1引，但对果胶酸裂解酶等果胶酶的免疫组织化学
收稿 日期：2007—04—11，修回日期：2007—07—27。
基金项 目：国家自然科学基金资助项 目(30170005)；江苏省 自然科学基金项 目(BK2005136)；江苏省教育厅高校 自然科学研究项 目
(07KJD18o237)。
作者简介：赵庆新(1966一)，男，博士，副教授，从事分子酶学和酶工程研究；王鑫(1982一)，男，硕士，研究方向为酶工程。
} 通讯作者(E—mail：yuansheng@njnu．edu．cn)。
·· 同为第一作者。
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的研究尚未见报道。
笔者构建了P56原核重组表达工程菌，对其在
原核细胞中的表达进行了研究，可为植物来源的果
胶酸裂解酶的表达积累一定的资料，也可为用组织
免疫学方法研究植物果胶酸裂解酶的定位奠定基
础。
1 材料与方法
1．1 材料
番茄 (Solanum lycopersicum)品系为 ‘苏粉一
号’，购于江苏红太阳种业(南京)。
1．2 菌株与质粒
大肠杆菌 DH5ot作为基因克隆的宿主菌，BL21一
CodenPlus(DE3)一RIL(Novagen)用作 LAT56基因表
达的宿主菌；pMD 18一T Vector(TaKaRa)作为克隆载
体，pET-28a(+)(Novagen)用作表达载体。
1．3 番茄基因组DNA的提取
均匀播种番茄种子于湿纱布上，无光条件下，
30％静置培养 4 d。用 CTAB法提取番茄基因组
DNA[
。
1．4 ／_．4：／"56基因的克隆与表达
1．4．1 LAT56克隆的引物设计
由于 T56(NCBI accession number：X15500)
基因在花粉管萌发时表达，材料难以获得，故采用
Overlap—PCR方法获得基 因，根据 NCBI(national
center for biotechnology information，http：／／www．Be—
bi．nlm．nih．gov／)数据库，得到目的基因的3个外
元的序列，使用 Gene Runner软件 (Spruyt，Michael
spruyt at DGIBT．COM)并参照Sefan N Ho等 ¨的
方法设计6个引物，P2与 P3有 l6 bp序列的重叠，
P4与 P5有 2O bp序列的重叠，以利于片断的延伸。
序列如下：
P1：5’一CAT ATG A AAC GCT CCG AGG AGG
A CTA ACT AAG-3’(与去除信号肽后的exonl的
5’序列相同，划线部分为引入的Nde I酶切位点)；
P2：5’一GCA TCA CCT TCA TCT GCG CCC CTT
AG一3’(19 bp与 exonl的 3’端序列互补，7 bp与
exon2的5’端序列互补)；
P3：5’一CAG ATG AAG GTG ATG CCA TCA GTA
TCT TCA ATT C-3’(9 bp与 exonl的3’端序列相
同，25 bp与exon2的5’端序列相同)；
P4：5’一AAT AGC GTA TCT TTC CCA ATG AGT
GTA ATC A-3’(2l bp与 exon2的 3’端序列互补，
1O bp与 exon3的5’序列端互补)；
P5：5’一ATT GGG AAA GAT ACG CTA TrG GAG
GAA GCA G一3’(1O bp与 exon2的3’端序列相同，
2l bp与 exon3的5’端序列相同)；
P6：5’一 TTA ACA TGG GCG TCG AAT
CTT G-3’(与 exon3的3’序列互补，划线部分为引
入的BamH I酶切位点)。
1．4．2 LAT56克隆与表达
使用高保真的 PfuUhra 。M DNA聚合酶 (strata—
gene)，以基因组 DNA为模板，分别 以 Pl和 P2、P3
和 P4、P=5和 P6为特异引物通过扩增得到不含信号
肽的LAT56 exon1，exon2和 exon3片断；然后用 P3
和 P6为引物，以 exon2和 exon3片断为模板，通过
第一次 Overlap—PCR，得到 LAT56 cDNA 中的 exon2
+exon3片断；最后用 Pl和 P6为引物，以 exon2+
exon3和 exonl片断为模板，通过第二次 Overlap—
PCR，得到 6 cDNA中的成熟蛋白的编码片断，
连接到 pMD 18一T载体，转化 DH5ot细胞，以便基因
的克隆和保存。用限制性内切酶Nde I和 BamH I
将不含信号肽的LAT56 cDNA片断从 pMD 18一T—
LAT56上切下，连接到 pET-28a(+)(Novagen)表达
载体上，转化 E．coli BL21一CodenPlus(DE3)一RIL细
胞(Novagen)，得到 pET-28a(+)一LAT56一BL21一Coden—
Plus(DE3)一RIL阳性转化子。
将得到的 pET-28a(+)一LAT56一BL21一CodenPlus
(DE3)一RIL转化子放人 LB培养基(10 g蛋白胨，
5 g酵母膏，10 g NaC1，1000 mL水)中培养，LB中分
别加入葡萄糖 1％(w／v)和有关抗生素，在 37％、
220 r／min条件下培养，当 OD鲫达到0．8左右时，加
入 0．05 mol／L IPTG，在 170 r／min、15℃条件下表达
60 h。
1．5 蛋白的亲和层析
诱导表达结束后，在5000 g、4℃条件下离心
10 min，收集菌体，用5 mL0．01 mol／LTris—HC1溶液
(pH 7．0)洗涤菌体，重复1次，然后将菌体在 一80％
条件下冻存6 h以上，之后用25 mL含100 ixg／mL
lysozyme和0．001 mol／L PMSF的0．01 mol／L Tris—HC1
溶液(pH 7．5)重新悬浮细胞，在O℃条件下，超声破
碎细胞，离心得包涵体，用含 1％ triton、0．05 mol／L
Tris—HC1溶液(pH 7．0)清洗包涵体，然后用含8 mol／
L尿素的0．05 mol／L Tris—HC1缓冲溶液(pH 7．0)溶
解，进一步用 Ni¨ 一nitrilotriacetate—agrose柱进行亲和
层析(用于层析各级溶液中含8 mol／L的尿素)，层析
后的样品在0．05 mol／L Tris—HC1缓冲溶液(pH 7．0)
中透析。
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第6期 赵庆新等：番茄(Solanum lycopersicum)果胶酸裂解酶 P56在大肠杆菌中的重组表达
1．6 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测和蛋白浓度的
测定
为了检测重组菌表达的 P56重组蛋白产物，采
用 SDS～PAGE凝胶电泳检测，浓缩胶浓度为3．5％，
分离胶浓度为 11．0％，用考马斯亮蓝 R-250染色。
蛋白浓度的测定参照 Bradford的方法采用考马斯亮
蓝 G-250法进行可溶性蛋白含量测定 ¨。以牛血
清白蛋白(BSA)作为标准蛋白，配制标准溶液，制作
标准曲线。
1．7 DNA序列比对
用 DNAMAN软件 (Lynnon BioSoft，Quebec)进
行 DNA序列比对。
2 实验结果
2．1 PCR与 Overlap-PCR
使用Ultra—Pfu DNA聚合酶，以常规 PCR的方
法从基因组 DNA中分别克隆出3个外显子后，装入
PMD18一T Vector克隆测序。参照 Sefan N Ho等的
方法 ¨将各断外显子通过 Overlap—PCR连接起来，
再次装入 PMD18一T Vector克隆测序，最终克隆到 目
的基因完整的cDNA(LAT56)(图1)，保存于 DH5ot
中。实验重复了3次，所得到的序列均一致。
利用 DNAMAN软件，进行 Solanum lycopersicum
LAT56 cDNA(X15500 in NCBI)和Solanum lycopersi—
cum(‘苏粉一号’)LAT56 cDNA核苷酸序列比对，从
两者比对的结果来看(图2)，我们克隆到的蛋白
P56的 cDNA序列与报道序列有两个碱基的差异，
分别在 192和195两个位置，但从密码子简并性分
M：DNA marker；G：Tomato genomic DNA；E1：exonl(499 bp)；
E2：exon2(301 bp)；E2+3：exon2+exon3(617 bp)；LtT56：
exonl+exon2+exon3(1116 bp)
图 1 番茄基因组 DNA提取、外元 PCR和
Overlap-PCR琼脂糖凝胶电泳
Fig．1 Agarose gelelectrophoresis of tomato genomic
DNA，diferent exon PCR and Overlap-PCR
析该差异时发现其氨基酸序列并未发生突变。
2．2 P$6在 pET-28a(+)-LAT56-BL21-CodenPlus
(DE3)-RIL中的表达
P56在pET-28a(+)一LAT56．BI21一CodenPlus(DE3)-
RIL中得到了表达，在 pET-28a(+)一LAT56一BI21-Co—
denPlus(DE3)．RIL的细胞上清中可以检测到 目的
蛋白，细胞中的大部分 P56以包涵体方式存在，细胞
全蛋白电泳胶扫描分析显示，重组表达的 P56蛋 白
占全蛋 白 30％以上 (图 3)。其对应的分子量为
41．4 kD，表达后的P56包含了6个组氨酸的Tag和
一 段连接序列，理论上总的分子量为43．56 kD。
重组表达后的细胞经过裂解和离心，可得到
P56包涵体，包涵体经过triton清洗、尿素的溶解、
Ni“一nitrilotriacetate—agrose柱层 析 和 在0．05 tool／L
Tris—HCI缓冲溶液(pH 7．0)中透析后，最终得到的
样品经SDS—PAGE检测，为单一蛋白带的纯化蛋白
(图 3)，样品中的蛋白浓度可以达到50 g／ L。
藏
2 1 l ( _f【 A【’CCAAAAA(；【 ACL A I I’( I’G( A．fCACA I【1_f(；CCA(；AA(；TAT(；A【 从 TCC(；ATT(；ACC X15500
_l l ( T( ATC AAAAA(；(；A CA1 r(；T(；( ATCACA l’I’ l( A( AA( TAq’( A(÷AATCC(；A I1 rGACC Sufen No 1
K Y G P Y Y j V T D N S D D D V V D P K acid sequence
图 2 Solanum lycopersicum LAT56 cDNA (X15500 in NCBI)和 Solanum lycopersicum
(‘苏粉一号’)LAT56 cDNA核苷酸序列比对
Fig．2 Alignment of Solanum lycopersicum LAT56 cDNA(X15500 in NCBI)(the first line)and Solanum lycope~wum
‘Sufen No．1’LAT56 cDNA(the second line)．The third line：amino acid sequence of the corresponding LAT56 cDNA
l l l l
一 一 un 8
l l l l
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542 武 汉 植 物 学 研 究 第 25卷
一
M：Marker；l：Soluble fraction of cel extract from pET-28a(+)一
8I2l—Code u8(DE3)一砌L indueed by 0．5 mmol／L IPrG．15℃．
60 h：2：Soluble fraction of cel extract from pET-28a(+)一 ／"56—
8I2l—CedenPlus(DE3)一砌Linduced by0．5mmolfLIP1C．15℃ ．
60 h；3：A1 cel proteins sample from pET-28a(+)一 ／"56一BI2l—
CedenPlus(DE3)一砌L induced by0．5 mmoVL IPrG。l5℃。60 h：
4：Purified 6his—P56 inclusionbody
图3 pET-28a(+)-LAT56-BL21-CodenPlus
(DE3)-RIL重组表达的 P56 SDS-PAGE检测
Fig．3 Assay of P56 expressed in pET-28a(+)一／AT56一
BL21一CodenPlus(DE3)一RIL by SDS—PAGE
3 论讨
Solanum lycopersicum LAT56 cDNA (X15500 in
NCBI)和Solanum lycopersicum(‘苏粉一号’)LAT56
cDNA核苷酸序列 比对显示：Solanum lycopersicum
LAT56 cDNA(X15500 in NCBI)和 Solanum lycopersi—
cum(‘苏粉一号’)P56的cDNA序列有两个碱基的
差异 ，分别在 192和 195两个位置，但从密码子简并
性分析该差异时发现其氨基酸序列并未发生突变。
由于3次重复实验得到的Solanum lycopersicum(‘苏
粉一号 ’)P56的 cDNA序列均一致，所以，Solanum
lycopersicum LAT56 cDNA(X15500 in NCBI)和 So／a—
ntm lycopersicum(‘苏粉一号’)P56的 cDNA序列有
两个碱基的差异不是实验引起的变异 ，可能是不同
番茄品种问的差异造成的。
BI21．CodenPlus(DE3)．RIL能够很好 地表达
P56蛋 白，是由于 BI21．CodenPlus(DE3)一RIL细胞
内添加了3种稀有的tRNA基因，恰好弥补了P56
的翻译起始区4个大肠杆菌稀有密码子(1个 CTA，
对应于 P56第 1个氨基酸；2个 AGG，对应于 P56
第5个和第6个氨基酸；1个 ATA，对应于 P56第 8
个氨基酸)，所以P56在 BL21一CodenPlus(DE3)一RIL
表达效果显著，细胞积累了大量的P56蛋白包涵体，
经过纯化后得到的纯化蛋白，经电泳检测为单一蛋
白，浓度达到50 g／ L，可以进一步用于免疫学方
面的研究。
在构建 P56原核表达的过程中，本研究试用了
多种质粒和表达宿主细胞，表达的效果相互间有显
著的差异性。从蛋白表达量上分：有不表达的表达
工程菌[pET-28a(+)一LAT56一Turner plac I(DE3)]，
有表达量高达占细胞总蛋白30％～70％以上的表达
工程菌【pET一28a(+)．LAT56．BL21．CodenPlus(DE3)．
RIL、pET-32a(+)一LAT56一BL21一CodenPlus(DE3)一RIL、
pET-43．1b(+)一LAT56一BL21一CodenPlus(DE3)一RIL]；
根据表达蛋白的可溶性分：有不溶的工程菌[pET．
28a(+)一LAT56一BL21一CodenPlus(DE3)．RIL]，也有可
溶性较高的工程菌[pET．32a(+)．LAT56．BL21．Coden．
Plus(DE3)一RIL和pET_43．1b(+)一LAT56一BL21一Coden．
Plus(DE3)一RIL]。但不同的表达组合的共同特征是
重组酶的活性很低(0．01 U／mL medium)，这可能是
由于原核表达无法满足该蛋白在糖基化等方面的修
饰要求，而该酶的有关修饰对酶的活性又非常重要，
所以从酶活角度需要尝试其它表达系统。植物果胶
酸裂解酶方面的重组表达是植物学相关研究领域的
瓶颈问题，目前国内外未有成功的报道，Domingo报
道 Zinnia elegans果胶酸裂解酶在原核表达中有活
性 ¨，但酶活只有 0．001 U／mL medium。
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