全 文 ：武汉植物学研究 2004，22(5)：445~448
Journal of Wuhan Botanical Research
光活化 一三噻吩诱发稗草愈伤组织保护酶系的反应
杨淑娟 ，万树青 ，蒋志胜 ，尚稚珍
(1．华南农业大学农药、化学生物学教育部重点实验室，广州 510642；2．南开大学元素有机化学研究所，天津 300071)
摘 要：用 a一三噻吩(a—T)处理稗草(Echinochloa crusgalli)愈伤组织，经近紫外光照射后，形成细胞内的氧化胁迫
环境。发现经 0．1、1和 10mg／L浓度 a—T处理 ，所测谷胱甘肽一S一转移酶(GST)、谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH—Px)和
过氧化物酶(POD)的光照诱导活性程度明显高于非光照的活性，其中 1 mg／L浓度处理，光照所提高活性分别为
26．78 、217．66 和 124．72 。但随着处理浓度的提高，超氧化物歧化酶(SOD)的活性呈下降趋势，以1 mg／L和
10 mg／L的浓度处理，所测SOD抑制率分别为 19．95 和 55．44 。
关键词 ：a 三噻吩；稗草；氧化胁迫；保护酶系
中图分类号：Q946．5 文献标识码：A 文章编号 ：1000-470X(2004)05—0445—04
Response of Protective Enzymes in Calli of Barnyard Grass to
Oxidizing Stress Induced by cx-terthienyl
YANG Shu—Juan 。，WAN Shu—Qing ，JIANG Zhi—Sheng。，SHANG Zhi—Zhen。
(1．Key Lab．of Pesticide，Chemistry—Biology of Ministry of Education，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，ChinaI
2．Institute D，Element—Organic Chemistry，Nankai University，Tianjin 300071，China)
Abstract：The calli of barnyard grass(Echinochloa crusgalli)was treated with a-terthienyl(a—T)
under A—UV irrdiation for 3 h，which forms an inner environment of oxidizing stress in the cells．
The results show that a．T stimulates the activity of glutathione—S．transferase(GST)，glutathione
peroxidase (GSH—Px)and peroxidase(POD)and inhibited the activity of superoxide dismutase
(SOD)under A—UV．The activities of GST，GSH—Px ，and POD under light were higher then
that non—light．The enhanced percentages of GST，GSH—Px，and POD at the concentration of
1 mg／L under light were 26．78 ，217．66 and 124．72 ，but SOD was inhibited at 1 mg／L and
10 mg／L，the inhibiting percentage was 19．95 and 55．44 ，respectively．The relationship be—
tween a—T’S oxidization and anti—oxidization was discussed．
Key words：a-terthienyl；Echinochloa crusgalli；Oxidizing stress；Protective enzymes
a一三噻吩(a—terthienyl，a—T)为菊科植物特征
性次生代谢产物，利用植物化学方法，可从万寿菊
(Tagetes erecta)的根部分离提纯a—T。a—T为一种
光敏毒素，许多文献报道它对多种昆虫具有强烈的
光活化毒杀活性，对植物病菌和线虫也表现出光活
化效应[1 ]。万寿菊化感抗草作用研究中发现，在有
近紫外光的照射下，a—T可引起稗草、马唐、异型莎
草、小麦，水稻、油菜、含羞草等植物强烈的光活化效
应[3]。一般情况下，在 1～10 mg／L的浓度范围内，
光照处理可抑制受试植物根、茎的伸长，在 10 mg／L
以上则可使植株死亡[3]。有关 a—T的作用机理，一
般认为，a—T为光活化 I型机制，即产单线态氧机
制[4]。运用 自旋电子共振技术 ，测得 a—T处理的稗草
愈伤组织，光照后可诱导细胞产氧 自由基的总量增
收稿 日期；2003—12—19，修回日期；2004—06—25。
基金项目t广东省自然科学基金资助项目(990703，010319)，南开大学元素有机化学所国家重点实验室资助课~(2002)。
作者简介：杨淑娟(1977一)，女，农药学硕士研究生。
通讯作者。
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446 武 汉 植 物 学 研 究 第 22卷
加[3]，表明 a—T还存在光活化 I型机制。这些研究
结果表明：在有近紫外光的作用下，a—T可诱导植物
细胞活性氧的增加，而当细胞受到活性氧的氧化胁
迫时，生活的细胞可启动自身的保护机制，其中保护
酶的激活与抑制，表明植物对光敏毒素的反应与光
敏毒素对植物氧化损伤的程度。
笔者以a—T处理稗草愈伤组织结合近紫外光光
照，造成细胞内氧化胁迫的环境，检测几种保护酶的
活性变化，比较它们在抗氧化中的作用，阐明外源光
敏物质引起的氧化损伤与机体抗氧化作用之间的平
衡机制，为利用光敏化合物防治杂草提供科学依据。
1 材料和方法
1．1 稗草(层．crusgali)愈伤组织的培养
取稗草幼苗，消毒处理，切成 0．5～1 cm长片
段，置 MS培养基内，附加 2，4一二氯苯氧乙酸(2，4一
D)2～4 mg／L。在生化培养箱内培养，温度(25±
1)℃。诱导产生愈伤组织，并继代培养约 15代，取指
数生长期的愈伤组织作为实验材料。
1．2 几种保护酶系的活力测定
1．2．1 谷胱甘肽一s一转移酶(GST)的活力测定
药剂处理与酶源制备：将稗草愈伤组织分别置
入含有 0．1、1、10 mg／L的a一三噻吩(a—T)(从Sig—
ma公司购进)悬浮培养液中，(25±1)℃黑暗处理
10 h后，光照组置近紫外光下(15 w／cm )光照3 h，
然后光照组与非光照处理组同在 24 h后，取愈伤组
织提取酶源。空白对照同样设有光照与非光照处理，
每种处理 3个重复。称取0．2 g愈伤组织，加适量的
50 mmol／L pH 7．0的磷酸缓冲液冰浴匀浆，在 4℃
下 ，以 5 371×g离心 15 min，取上清液为酶源。
GST的活力测定参考 Habig等的方法嘲。蛋白
质含量测定参照Bradford的方法[6]。酶比活力表示
为：在 340 nm波长下，每毫克蛋白每分钟光密度变
化值，且p：AOD·mg一 pro·min一 。
1．2．2 谷胱甘肽过氧化物酶(GSH—Px)活力测定
GSH—Px活力测 定参考张嘉 麟和荣征 星方
法[7 ]。测定时以空白管调零，酶活力表示为在412 nm
时，每毫克蛋白、每分钟转化GSH的量(t~mo1)，即
t~molGSH·mg pro·min一。计算公式：
GSH-Px活力单位数=
I-GSH]~Iz酶管一[-GSH]样品管一FGSH]试剂 宰白管
1．2．3 过氧化物酶(PoD)活性测定
取药剂处理过的愈伤组织 0．2 g，加入预冷的
0．05 mol／L磷酸缓冲液 1．5 mL冰浴匀浆，匀浆液
在低温下(4℃)7 734×g离心 15 min，取上清液测
酶活性。
POD活性测定参考袁庆华等的方法[9]，以愈创
木酚为底物 ，取 2 L酶液 ，加入 100 L缓冲液和
2．8 mL的 18 mmol／L愈创木酚液，再加入 100 L
3OHzOz溶液，摇匀反应，温度为25℃。待光密度值
(OD值)恒定时记录470 nm处光密度值，以每毫克
蛋白质每分钟吸光度增值表示酶活性。
1．2．4 超氧化物歧化酶(SOD)活性测定
取药剂处理过的愈伤组织置入 50 mmol／L磷
酸缓冲液中，内含 1 聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)匀
桨，9077×g 4"C离心 10 min，取上清液测酶活性。
SOD活性测定：主要参考张宪政和沈文飚的方
法[】 ，¨测定 SOD对硝基四唑蓝(NBT)的还原抑
制作用。
酶比活力=z~OD／OD0·50％ mg protein·rain～。
0D。：对照管在 560 nm处吸光度值；AOD：空白对照
在 560 nm处吸光度值与加入酶液反应液在 560 nm
处吸光度值的差。
酶活抑制率计算：根据所测每种酶的空白对照
与药剂处理的比活力，计算酶活抑制率( )公式：
酶活抑制率( )一
舢 。。 对照酶比活力(光照
、未光照) ⋯ ⋯
当计算值为负数时，表明具有促进酶的活性 ，用
“
一 ”表示。
2 结果与分析
2．1 a—T对稗草愈伤组织 GST活力的诱导激活作
用
以 0．1、1、10 mg／L浓度的 T处理愈伤组
织，测得光照与非光照的酶活力变化情况(见表 1)。
从表 1可知，在测试的浓度范围内，光照与非光照的
酶活力都可诱导提高。比较它们之间的酶比活力‘，发
现光照明显高于非光照处理。如 10 mg／L浓度的
a—T处理愈伤组织，光照比活力为 2．18±0．06，而非
光照比活力为 1．92±0．04，光照与空白光照相比可
提高活性 29．76 ，而非光照却为 15．67O。
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第 5期 杨淑娟等 ：光活化 a一三噻吩诱发稗草愈伤组织保护酶系的反应 447
光照
光照
光照
光照
非光照
非光照
非光照
非光照
1．68士0．05 e
1．71士0．04 C 一 1．78
2．13士0．04 a 一 26．78
2．19士0．06 a 一 29．76
1．66士0．02 C
1．94士0．01 b 一 16．87
1．99士0．02 b 一 19．87
1．92士0．06 ca 一 15．67
10．42士 1．10 C
14．40士1．2O b 一 38．19
33．10士3．33 a 一 217．6
10．11士1．71 C 2．98
7．97士0．24 cd
8．58士0．49 cd 一 7．65
9．81士0．O0 C 一 23．09
5．82士 1．10 d 26．98
21．68士 0．56 e
38．99士 0．34 b 一 79．84
40．72士 0．27 a 一 124．72
37．94士 0．06 b 一 75．86
21．54士 0．98 e
24．50士 0．20 d 一 13．74
26．65士 0．47 C 一 23．72
27．28士 3．34 C 一 26．65
22．91士 0．53 ab
20．42士 0．08 b 10．87
18．34士 0．65 b 19．95
10．21士 0．08 C 55．43
24．31士 0．37 a
22．13士 0．36 ab 8．97
22．28士 0．03 ab 8．35
9．96士 0．06 dc 59．03
*表中同列数据有相同字母者表示 5 水平差异不显著(DMRT)。
* Significantly different from the same row with different letters by Duncan’S multiple range at P< 0．05
2．2 a—T对稗草愈伤组织 GSH—Px活力的诱导激
活作用
GSH—Px活力测定结果表明，光照组的 0．1、1、
10 mg／L处理 ，0．1～1 mg／L所测活性呈大幅度提
高的趋势，在 1 mg／L时酶活性提高 217．66 ，但
在 10 mg／L处理时，酶活力下降，略有抑制出现，但
与对照无显著差异。非光照组中也显示一定的诱导
激活作用，但激活幅度小于光照组 (表 1)。a—T在
1 mg／L时，光照后能大幅度地激活提高GSH—Px活
力，说明GSH—Px在保护植物免遭氧化损伤中起重
要作用。
2．3 a—T对稗草愈伤组织 POD活力的诱导激活作
用
测定结果表明：光照组各处理浓度均能诱导激
活 POD活性，在 1 mg／L时，提高活性 124．72 ，在
lOmg／L时，上升的幅度略有下降，提高了 75．O1％；
而非光照组中，随着浓度的提高，POD的活性呈上
升的趋势，但上升的幅度远不及光照组。1 mg／L时，
提高活性 26．65％(表 1)。
2．4 a—T对稗草愈伤组织 SOD活力的抑制作用
测定结果表明：a—T对 SOD的影响主要表现为
抑制作用，随着处理浓度的提高，抑制率呈上升的趋
势。在 1 mg／L时，抑制率为 19．95 ，在 10 mg／L
时，为 55．44 。而非光照处理的酶活性变化与光照
处理趋势相同，在 0．1 mg／L时，抑制率低于光照
组，在 10 mg／L时，光照与非光照处的抑制率无显
著差异(表 1)。
3 讨论
3．1 a—T的光活化作用与保护酶活性的关系
a—T为一种光敏毒素，在有光的作用下，a—T吸
收光子能量，由基态转变为激发态 a—T，这种激发态
分子在细胞内将能量传递给处于基态的三线态氧
(。O。)，使之转变为激发态单线态氧( O )，这是造成
细胞内氧化胁迫的因素之一。通过 自旋电子共振仪
检测，a—T在有近紫外光下，还可催化细胞内产氧 自
由基L3]。当 O。和氧自由基达到一定剂量时，可形成
细胞内严重的氧化环境，使生物分子被氧化降解，细
胞坏死，机体死亡[3]。如果细胞处于初始轻度的氧化
胁迫的背景下，细胞可启动抗氧化应急反应，首先细
胞内存有种类繁多的抗氧化剂。如维生素C、谷胱甘
肽、类胡萝 卜素等，可发挥氧化猝灭作用。其二是细
胞内的各种保护酶系，这些酶在清除细胞内多余的
活性氧和自由基中发挥重要作用。细胞内的活性氧
和 自由基 的清除是在 SOD、POD和过氧化 氢酶
(CAT)3种酶的协调一致工作，处于一种动态平衡
状态中完成的[1引，这样才能使细胞内的活性氧和自
由基维持在一个较低水平，一旦这种平衡被打破，就
有可能造成氧化损伤。
在 3种保护酶系中，过氧化氢酶(CAT)能催化
HzOz产生 O。和 H。O，减轻 H。O。的毒害作用。但由
于它有光敏性，释放氧气以及定位在植物的过氧化
物体 内，在植物抗 氧化胁迫 中并不 占重要 的位
置[1纠。在一定浓度范围内，a—T在稗草细胞内所诱导
形成的氧化环境，可激活 GSH和 GSH—Px和 POD，
减轻活性氧给细胞造成的损伤，尤其是 GSH—Px在
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稗草细胞内抗氧化作用更为重要，诱导激活的活性
最高 (表 1)。GSH—Px是一种含硒酶 ，其功能是将
H O：还原成水，是机体对抗内源或外源性诱导产生
的脂质过氧化反应的一种重要的保护酶系[1引，a—T
对 GSH—Px表现出强烈的激活作用，表明 GSH—Px
在清除有害过氧化代谢产物中起重要的作用。
3．2 a—T的光活化毒杀植物的生化机理
a—T作为一种光敏毒素，已用于光活化毒杀蚊、
蝇幼虫的药剂，在光活化除草作用中发现，含有 a—T
的提取物，在有近紫外光(300～400 nm)或在太阳
光的作用下，对稗草、马唐、含羞草等植物具有显著
的触杀和抑制生长作用。在检测 a—T对稗草保护酶
的影响时发现 a—T在较低的浓度下，可抑制 SOD的
活性，而且，随浓度的提高，抑制活性逐渐增强(表
1)。由于 SOD被抑制，这样细胞内可积累超氧 自由
基 (O：一)，这种推论已被自旋电子共振所测得的结
果所证实(研究结果待发表)。a—T具有光活化杀虫
和除草作用的主要机制是除了产 Oz外，对细胞造
成氧化损伤，还与细胞内不断积累的Oz一有关，造成
细胞氧化损伤，导致稗草根、茎伸长受到抑制，严重
时可引起细胞坏死、机体死亡[3]。这些测定结果表明
SOD是 a—T的作用靶标之一，也是 a—T的光活化毒
杀植物的生化机理之一。
除了机体 内的保护酶系在抗 a—T引起的氧化
胁迫外，同时细胞内的解毒酶也在发挥重要的作用，
如细胞内的多底物单加氧酶(PSMO’S)和谷胱甘
肽一S一转移酶(GST)、葡糖基转移酶等参入 a—T的初
级和次级代谢，Hasspieler等和 Iyenger等已在蚊和
鳞翅目昆虫中得已证实["14,15]。作者通过高效液相色
谱仪分析可检测到稗草和含羞草从根部吸收的
a—T，可在茎、叶部位得以降解(资料正在整理中)。
这些研究结果，对于应用 a—T作为光活化农药提供
有益的信息。
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