全 文 ：植物科学学报　 ２０１５ꎬ ３３(３): ４０５~４１３
Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｊｏｕｒｎａｌ
　 　 ＤＯＩ:１０􀆰 １１９１３ / ＰＳＪ􀆰 ２０９５－０８３７􀆰 ２０１５􀆰 ３０４０５
水杨酸诱发的丹参悬浮培养细胞内
Ｈ２Ｏ２迸发与其培养基碱化的关系
张洪培ꎬ 张晓茹ꎬ 胡格格ꎬ 董娟娥∗
(西北农林科技大学生命科学学院ꎬ 陕西杨凌 ７１２１００)
摘　 要: 水杨酸(ｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄꎬ ＳＡ)处理可诱导丹参悬浮培养细胞内 Ｈ２Ｏ２产生及其培养基碱化ꎮ 利用 ＮＡＤＰＨ
氧化酶抑制剂咪唑( ｉｍｉｄａｚｏｌｅꎬ ＩＭＤ)、 Ｈ２Ｏ２淬灭剂二甲基硫脲(ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏｕｒｅａꎬ ＤＭＴＵ)、 质膜 Ｈ
＋￣ＡＴＰａｓｅ
抑制剂钒酸钠(Ｎａ３ＶＯ４)及激活剂壳梭孢菌素( ｆｕｓｉｃｏｃｃｉｎꎬ ＦＣ)处理丹参悬浮培养细胞ꎬ 探讨 ＳＡ诱导的 Ｈ２Ｏ２迸
发与培养基碱化之间的关系ꎮ 结果表明ꎬ Ｈ２Ｏ２可促发培养基碱化ꎬ ＩＭＤ 和 ＤＭＴＵ 抑制 ＳＡ 诱发的培养基碱化ꎬ
说明 Ｈ２Ｏ２参与 ＳＡ诱发的培养基碱化过程ꎻ ＳＡ抑制质膜 Ｈ
＋￣ＡＴＰａｓｅ活性ꎬ Ｎａ３ＶＯ４引发培养基碱化并使 Ｈ２Ｏ２
迸发时间提前ꎬ ＦＣ处理逆转了 ＳＡ诱导的培养基碱化及 Ｈ２Ｏ２迸发ꎬ 说明质膜 Ｈ
＋￣ＡＴＰａｓｅ 调控培养基 ｐＨ 值变
化ꎬ 培养基碱化促进了 Ｈ２Ｏ２产生ꎮ 因此ꎬ 丹参悬浮培养细胞内 Ｈ２Ｏ２水平与其培养基碱化程度之间相互关联、
共同作用ꎬ 协同响应 ＳＡ的诱导ꎮ
关键词: 培养基碱化ꎻ Ｈ２Ｏ２ꎻ 水杨酸ꎻ 信号转导ꎻ 丹参
中图分类号: Ｑ９４５　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ２０９５￣０８３７(２０１５)０３￣０４０５￣０９
　 　 　 收稿日期: ２０１４￣０８￣１３ꎬ 退修日期: ２０１４￣０９￣１８ꎮ
　 基金项目: 国家自然科学基金 (３１１７０２７４)ꎻ 西北农林科技大学青年骨干支持计划ꎮ
　 作者简介: 张洪培(１９８８－)ꎬ 女ꎬ 硕士研究生ꎬ 主要从事药用植物次生代谢调控方面研究(Ｅ￣ｍａｉｌ: ７７１８４４１５３＠ｑｑ􀆰 ｃｏｍ)ꎮ
　 ∗通讯作者(Ａｕｔｈｏｒ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ􀆰 Ｅ￣ｍａｉｌ: ｄｚｓｙｓ＠ ｎｗｓｕａｆ􀆰 ｅｄｕ􀆰 ｃｎ)ꎮ
Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｈ２Ｏ２ Ｂｕｒｓｔ ａｎｄ Ｍｅｄｉｕｍ Ａｌｋａｌｉｎｉｚａｔｉｏｎ
Ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｓａｌｉｃｙｌｉｃ Ａｃｉｄ ｉｎ Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ
Ｃｅｌｌ Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ
ＺＨＡＮＧ Ｈｏｎｇ￣Ｐｅｉꎬ ＺＨＡＮＧ Ｘｉａｏ￣Ｒｕꎬ ＨＵ Ｇｅ￣Ｇｅꎬ ＤＯＮＧ Ｊｕａｎ￣Ｅ∗
(Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｙａｎｇｌｉｎｇꎬ Ｓｈａａｎｘｉ ７１２１００ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ (ＳＡ) ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｃａｎ ｉｎｄｕｃｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ Ｈ２Ｏ２ ｂｕｒｓｔ ｉｎ Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ
ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｅｌｌ ａｎｄ ｉｔｓ ｍｅｄｉｕｍ ａｌｋａｌｉｎｉｚａｔｉｏｎ. Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙꎬ ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ＳＡ￣
ｉｎｄｕｃｅｄ Ｈ２Ｏ２ ｂｕｒｓｔ ａｎｄ ｍｅｄｉｕｍ ａｌｋａｌｉｎｉｚａｔｉｏｎ ｗａｓ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ＮＡＤＰＨ ｏｘｉｄａｓｅ ｉｎｈｉｂｉ￣
ｔｏｒ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ ( ＩＭＤ)ꎬ Ｈ２Ｏ２ ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ ａｇｅｎｔ ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏｕｒｅａ (ＤＭＴＵ)ꎬ ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ
Ｈ＋￣ＡＴＰａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｎａ３ＶＯ４ ａｎｄ ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｈ
＋￣ＡＴＰａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｆｕｓｉｃｏｃｃｉｎ ( ＦＣ) .
Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ (１) Ｈ２Ｏ２ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ａｌｓｏ ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｍｅｄｉｕｍ ａｌｋａｌｉｎｉｚａｔｉｏｎꎬ ａｎｄ
ＩＭＤ ａｎｄ ＤＭＴＵ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ＳＡ￣ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｅｄｉｕｍ ａｌｋａｌｉｎｉｚａｔｉｏｎꎬ ｗｈｉｃｈ
ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈａｔ Ｈ２Ｏ２ ｗａｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ＳＡ￣ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｅｄｉｕｍ ａｌｋａｌｉｎｉｚａｔｉｏｎꎻ (２) ＳＡ
ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｈ＋￣ＡＴＰａｓｅꎬ Ｎａ３ＶＯ４ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｃａｕｓｅｄ ｒａｐｉｄ
ｍｅｄｉｕｍ ａｌｋａｌｉｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｌｅｄ ｔｏ Ｈ２Ｏ２ ｂｕｒｓｔ ａｈｅａｄ ｏｆ ｔｉｍｅꎬ ａｎｄ ＦＣ ｒｅｖｅｒｓｅｄ ＳＡ￣ｉｎｄｕｃｅｄ
ｍｅｄｉｕｍ ａｌｋａｌｉｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｈ２Ｏ２ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎꎬ ｗｈｉｃｈ ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈａｔ ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｈ
＋￣
ＡＴＰａｓｅ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｔｈｅ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｍｅｄｉｕｍ ｐＨ ｖａｌｕｅ ａｎｄ ｍｅｄｉｕｍ ａｌｋａｌｉｎｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｍｏｔｅｄ ｔｈｅ
ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈ２Ｏ２ . Ｏｖｅｒａｌｌꎬ ｔｈｅ Ｈ２Ｏ２ ｌｅｖｅｌ ｉｎ ｔｈｅ Ｓ. ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｅｌｌ ａｎｄ ｉｔｓ
ｍｅｄｉｕｍ ａｌｋａｌｉｎｉｚａｔｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎｅｄ ｔｏｇｅｔｈｅｒ ｔｏ ｒｅｓｐｏｎｄ ｔｏ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｍｅｄｉｕｍ ａｌｋａｌｉｎｉｚａｔｉｏｎꎻ Ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｅｒｏｘｉｄｅꎻ Ｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄꎻ Ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎꎻ
Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ
　 　 诱导子可引发活性氧 (ＲＯＳ) [１]、 一氧化氮
(ＮＯ) [２]、 氢离子(Ｈ＋) [３]等胞内信号的迸发ꎬ 信
号分子间的交叉互作在植物防御应答和次生代谢过
程中发挥着重要作用[４]ꎬ 因此研究信号间的相互
作用有助于深入认识植物对逆境的适应调控机制ꎮ
培养基碱化伴随有胞质酸化ꎬ 是植物细胞感受外界
刺激的早期反应[５]ꎬ 一般认为是由于离子交换、
Ｈ＋内流等原因造成的ꎮ 逆境胁迫如机械刺激[６]、
重金属胁迫[７]等均可改变 Ｈ＋流向ꎬ 引起细胞内外
ｐＨ值变化ꎬ 从而调控植物防御应答[７]和免疫反
应[８]ꎮ 细胞质酸化可诱导植物细胞 ＲＯＳ 的迸
发[９]、 次生代谢物合成[１０]和防御基因表达[１１]ꎮ 质
膜质子泵(ＰＭ Ｈ＋￣ＡＴＰａｓｅ)是植物细胞膜的主要成
分之一ꎬ 也是改变细胞内外 ｐＨ值的关键酶ꎬ 可利
用 ＡＴＰ释放的能量将胞内 Ｈ＋释放到膜外ꎬ 故 ＰＭ
Ｈ＋￣ＡＴＰａｓｅ在细胞质酸化过程中起着关键作用ꎮ
Ｂｒａｕｌｔ等[１２]研究表明ꎬ ＡＢＡ 抑制拟南芥细胞质膜
Ｈ＋￣ＡＴＰａｓｅ的活性ꎬ 并迅速诱导质膜去极化ꎬ 造
成了细胞质酸化ꎮ
Ｈ２Ｏ２是植物细胞内重要的信号分子ꎬ 可调节
信号转导蛋白ꎬ 影响植物防卫反应、 细胞凋亡、 基
因表达等生理生化过程ꎬ 其中高热[１３]、 干旱[１４]等
环境压力可诱导 Ｈ２Ｏ２迸发ꎮ Ｈ２Ｏ２水平与细胞质酸
化间存在显著的正相关关系ꎬ 即胞质 ｐＨ 值变化介
导 Ｈ２Ｏ２诱导的气孔关闭[１５]ꎬ 而胞质酸化诱导活性
氧的产生[９]ꎮ 铁[１６]也可诱导 Ｈ２Ｏ２迸发ꎬ 从而抑
制 Ｈ＋￣ＡＴＰａｓｅ活性ꎬ Ｈ２Ｏ２则通过抑制 ＰＭ Ｈ
＋￣ＡＴ￣
Ｐａｓｅ而参与到胞外碱化(胞质酸化)过程中ꎮ
丹参(Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ Ｂｕｎｇｅ)为唇形科鼠尾
草属植物ꎬ 具有活血祛瘀、 通经止痛、 清心除烦、
凉血消痈的功效[１７]ꎮ 水杨酸(ｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄꎬ ＳＡ)
既可作为外源诱导子刺激丹参细胞酚酸类次生代谢
产物的合成[１８]ꎬ 又可作为胞内信号分子调控胞内
氧化水平及次生代谢物合成ꎬ 从而抵御逆境胁
迫[１９]ꎮ ＳＡ 诱发的 Ｈ２Ｏ２可作为重要的信使分子参
与次生代谢过程[２０]ꎬ 但对于 ＳＡ 如何引发丹参细
胞培养基碱化以及 ＳＡ 诱发的 Ｈ２Ｏ２与培养基碱化
之间的关系等一系列信号转导或互作过程尚不清
晰ꎮ 为此ꎬ 本研究以丹参悬浮培养细胞为材料ꎬ 利
用 Ｈ２Ｏ２淬灭剂(二甲基硫脲ꎬ ＤＭＴＵ)、 Ｈ２Ｏ２合成
酶抑制剂(咪唑ꎬ ＩＭＤ)改变 ＳＡ 诱导的胞内 Ｈ２Ｏ２
水平ꎬ 并使用 ＰＭ Ｈ＋￣ＡＴＰａｓｅ 激活剂 (壳梭孢菌
素ꎬ ＦＣ)及抑制剂(钒酸钠ꎬ Ｎａ３ＶＯ４)控制质子流
向从而改变细胞内外 ｐＨ 值ꎬ 考察 Ｈ２Ｏ２对培养基
ｐＨ值变化以及培养基 ｐＨ值变化对胞内 Ｈ２Ｏ２水平
的影响ꎬ 以期探讨 ＳＡ 诱导的 Ｈ２Ｏ２与胞外碱化的
关系ꎬ 为明确诱导子调控植物抗逆过程的信号转导
途径提供理论依据ꎮ
１　 材料与方法
１􀆰 １　 材料来源及培养
丹参(Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ Ｂｕｎｇｅ)种子来源于陕
西天士力植物药业有限公司丹参 ＧＡＰ 基地ꎮ 悬浮
培养细胞系的建立参照行冰玉等[２１]的方法ꎮ
１􀆰 ２　 水杨酸诱导及药理学试剂处理方法
取 ３０ ｍＬ培养 ６ ｄ的丹参悬浮细胞(即细胞生
长最旺盛时)ꎬ 将经过 ０􀆰２２ μｍ微孔滤膜过滤后的各
药理学试剂分别添加至培养液中ꎬ 悬浮培养 ３０ ｍｉｎ
后再分别向培养液中加入 ＳＡ(Ｓｉｇｍａ 公司)ꎬ 其处
理浓度分别为 １１、 ２２、 ４４ ｍｇ / Ｌꎮ 空白对照组添
加等体积的蒸馏水ꎬ 阴性对照组仅添加药理学试
剂ꎮ 各药理学试剂的处理浓度分别为: １、 １０、
５０ ｍｍｏｌ / Ｌ Ｈ２Ｏ２(分析纯ꎬ 天津天力化学试剂有
限公司)ꎬ ５０ μｍｏｌ / Ｌ 二甲基硫脲(ＤＭＴＵꎬ Ｓｉｇｍａ
公司)ꎬ ４００ μｍｏｌ / Ｌ 咪唑( ＩＭＤꎬ Ｓａｎｌａｎｄ Ｃｈｅｍｉ￣
ｃａｌ公司)ꎬ ２５、 ５０、 １００ μｍｏｌ / Ｌ 钒酸钠(Ｎａ３ＶＯ４ꎬ
Ｓｉｇｍａ 公司)ꎬ ０􀆰１、 ０􀆰５、 １􀆰０ μｍｏｌ / Ｌ 壳梭孢菌素
(ＦＣꎬ Ｓｉｇｍａ公司)ꎬ 每个处理设 ３次重复ꎮ
１􀆰 ３　 培养基 ｐＨ值变化量的测定
用赛多利斯 ＰＢ￣２１ ｐＨ计(玻璃铂透膜电极)在
各试剂处理后的 ０ ~ ２０ ｍｉｎ 内每隔 ２ ｍｉｎ 测定一
次培养基的 ｐＨ值ꎮ 测定时使用磁力搅拌器匀速持
续摇动培养基ꎬ 使悬浮细胞均匀分布ꎬ 避免培养物
黏在玻璃电极上ꎮ 初次测定值记录为初始值ꎬ ｐＨ
６０４ 植 物 科 学 学 报 第 ３３卷　
变化值为每次的测定值与初始值之差ꎮ
１􀆰 ４　 Ｈ２Ｏ２含量的测定
采用改进的硫酸钛法[２２]测定 Ｈ２Ｏ２含量: 称取
约 １ ｇ的丹参悬浮培养细胞ꎬ 加入 ４ ｍＬ ４℃预冷
的丙酮ꎬ 于冰浴下迅速研磨成匀浆ꎬ ４℃ １０ ０００ ｒ /
ｍｉｎ离心 １０ ｍｉｎꎻ 取 １ ｍＬ 上清液并加入 ０􀆰１ ｍＬ
５％硫酸钛混匀ꎬ 再加入 ０􀆰２ ｍＬ 浓氨水混匀ꎬ ４℃
１０ ０００ ｒ / ｍｉｎ 离心 １０ ｍｉｎꎻ 弃上清液并用 ４ ｍＬ
２ ｍｏｌ / Ｌ 浓硫酸溶解沉淀ꎬ 然后在 ４１５ ｎｍ 波长处
测定吸光度ꎮ 根据 Ｈ２Ｏ２含量标准曲线计算不同浓
度 ＳＡ处理丹参培养细胞中 Ｈ２Ｏ２含量:
Ｈ２Ｏ２ 含量(μｍｏｌ􀅰Ｌ
－１􀅰ｇ－１ ＦＷ)＝
Ｃ × Ｖ ｔ
ＦＷ × Ｖ ｉ
式中ꎬ Ｃ为标准曲线上对应的样品中 Ｈ２Ｏ２含
量ꎻ Ｖ ｔ为样品提取液总体积(ｍＬ)ꎻ Ｖ ｉ为测定用样
品提取液体积(ｍＬ)ꎻ ＦＷ 为丹参悬浮培养细胞鲜
重(ｇ)ꎮ
１􀆰 ５　 质膜 Ｈ＋￣ＡＴＰａｓｅ活性测定
１􀆰 ５􀆰 １　 质膜提取与纯化
取丹参悬浮培养细胞 ８ ｇꎬ 按照 １ ∶ ２(Ｗ/ Ｖ)的
比例加入匀浆液(含 ０􀆰５ ｍｍｏｌ / Ｌ 蔗糖、 １５ ｍｍｏｌ / Ｌ
Ｔｒｉｓ￣ＨＣｌ ｐＨ ７􀆰８、 １ ｍｍｏｌ / Ｌ ＥＤＴＡ、 ５ ｍｍｏｌ / Ｌ
Ｖｉｔ􀆰Ｃ、 １ ｍｍｏｌ / Ｌ ＰＭＳＦ、 ３ ｍｍｏｌ / Ｌ ＤＴＴ、 ０􀆰６％
ＰＶ Ｐ)研磨ꎬ 匀浆液 １０ ０００ ｒ / ｍｉｎ离心 ４０ ｍｉｎꎻ 取
上清液 ４５ ０００ ｒ / ｍｉｎ 离心 ６０ ｍｉｎꎻ 收集沉淀并用
悬浮液[含 ０􀆰３ ｍｏｌ / Ｌ蔗糖、 ５ ｍｍｏｌ / Ｌ磷酸钾缓冲
液(ｐＨ ７􀆰８)、 １ ｍｍｏｌ / Ｌ ＫＣｌ、 ０􀆰１ ｍｍｏｌ / Ｌ ＥＤＴＡ、
１ ｍｍｏｌ / Ｌ ＰＭＳＦ、 １ ｍｍｏｌ / Ｌ ＤＴＴ]悬浮ꎬ 即得粗
提质膜ꎻ 再将粗提质膜加入两相系统(含 ０􀆰０１４％
ＫＣｌ、 ８􀆰７％ 蔗糖、 ６􀆰３％ ＰＥＧ ３３５０、 ６􀆰３％ Ｄｅｘ￣
ｔｒａｎ Ｔ￣５００、 磷酸缓冲液 ｐＨ ７􀆰８)中混匀ꎬ １０００ ｒ /
ｍｉｎ离心 ５ ｍｉｎ分相ꎻ 将上相液转移至新配置的下
相液中混匀后分相ꎬ 重复 ３ 次ꎻ 收集上相液ꎬ
４５ ０００ ｒ / ｍｉｎ 离心 ６０ ｍｉｎꎬ 所得沉淀即为纯化的
质膜微囊ꎮ
１􀆰 ５􀆰 ２　 Ｈ＋￣ＡＴＰａｓｅ活性检测
取 ０􀆰５ ｍＬ酶反应液ꎬ 加入 ４０ μＬ 质膜ꎬ ３７℃
水浴反应 ２０ ｍｉｎꎻ 用 １０％ ＴＣＡ终止反应后ꎬ 加入
３ ｍＬ 定磷试剂(３ ｍｏｌ / Ｌ Ｈ２ ＳＯ４ ∶ 水 ∶ ２􀆰５％钼酸
铵 ∶ １０％ Ｖｉｔ􀆰Ｃ ＝ １ ∶ ２ ∶ １ ∶ １)ꎬ ４５℃水浴反应
２５ ｍｉｎꎬ 冷却 １０ ｍｉｎ 后于 ６６０ ｎｍ 波长处测定吸
光度ꎮ 以反应前立即加终止液作空白对照ꎬ 并根据
无机磷标准曲线计算无机磷含量ꎮ
１􀆰 ６　 数据处理
采用 Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ ２００３ 对数据进行整理后
作图ꎬ 使用统计分析软件 ＤＰＳ ７􀆰０５ 进行数据分
析ꎮ 本文图中所示数值为 ３ 次重复的平均值(Ｘ
—＋
ＳＥ)ꎬ 不同字母表示在 ５％水平上具显著差异(Ｐ<
０􀆰０５)ꎮ
２　 结果与分析
２􀆰 １　 ＳＡ处理对丹参悬浮培养细胞培养基 ｐＨ值变
化和 Ｈ２Ｏ２含量的影响
２􀆰 １􀆰 １　 ＳＡ处理对丹参悬浮培养细胞培养基 ｐＨ值
变化的影响
向丹参悬浮培养细胞培养基中加入不同浓度
ＳＡ后ꎬ 其 ｐＨ 值的变化趋势显示(图 １)ꎬ 在本实
验 ＳＡ设置浓度范围内ꎬ ＳＡ 处理使培养基 ｐＨ 值
迅速增加ꎬ 直至 １０ ｍｉｎ后增幅变缓ꎻ ２２ ｍｇ / Ｌ ＳＡ
处理使培养基 ｐＨ 值的升高量显著高于其他 ２ 个
ＳＡ浓度处理(Ｐ < ０􀆰０５)ꎬ 且为空白对照的 ５ 倍ꎮ
说明 ＳＡ可显著诱导丹参细胞培养基碱化ꎬ 培养基
ｐＨ值变化量与 ＳＡ的处理浓度有关ꎮ
２􀆰 １􀆰 ２　 ＳＡ处理对丹参悬浮培养细胞 Ｈ２Ｏ２含量的
影响
向丹参悬浮培养细胞中加入不同浓度 ＳＡ 后ꎬ
其 Ｈ２Ｏ２含量的变化趋势显示(图 ２)ꎬ ＳＡ 引发了
Ｈ２Ｏ２在处理 ２０ ｍｉｎ和 ２ ｈ时的 ２次迸发ꎻ ２２ ｍｇ / Ｌ
ＳＡ诱导丹参悬浮培养细胞产生的 Ｈ２Ｏ２显著高于
其他 ２个 ＳＡ浓度处理ꎬ 并在处理 ２ ｈ 时达到最大
迸发量(是处理 ２０ ｍｉｎ 时的 １􀆰 ５ 倍)ꎮ 说明 ＳＡ 处
理可诱导丹参悬浮培养细胞 Ｈ２Ｏ２迸发ꎬ 且２２ ｍｇ / Ｌ
ＳＡ处理可引发 Ｈ２Ｏ２达到最大迸发量ꎬ 这与引起
培养基碱化最显著的 ＳＡ处理浓度一致ꎬ 因此本研
究中后续实验均采用 ２２ ｍｇ / Ｌ ＳＡ处理ꎮ
２􀆰 ２　 Ｈ２Ｏ２对 ＳＡ诱发的培养基碱化的影响
２􀆰 ２􀆰 １　 Ｈ２Ｏ２处理对培养基 ｐＨ值的影响
为了明确 Ｈ２Ｏ２处理对培养基 ｐＨ 值的影响ꎬ
我们向丹参悬浮培养细胞中添加不同浓度的Ｈ２Ｏ２ꎮ
结果表明(图３) ꎬ添加外源Ｈ２Ｏ２可使培养基ｐＨ
７０４　 第 ３期　 　 　 　 　 　 张洪培等: 水杨酸诱发的丹参悬浮培养细胞内 Ｈ２Ｏ２迸发与其培养基碱化的关系
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!" ( )Time min
CK 11 mg/L SA
22 mg/L SA 44 mg/L SA
pH
C
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不同小写字母表示在 Ｐ < ０􀆰 ０５水平上差异显著ꎮ 下同ꎮ
Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｏｗｅｒｃａｓｅｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ａｔ ｔｈｅ Ｐ < ０􀆰 ０５ ｌｅｖｅｌ. Ｓａｍｅ ｂｅｌｏｗ.
图 １　 水杨酸对丹参悬浮培养细胞培养基 ｐＨ值的影响
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｏｎ ｔｈｅ ｐＨ ｖａｌｕｅ ｏｆ Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉａ
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图 ２　 水杨酸对丹参悬浮培养细胞 Ｈ２Ｏ２含量的影响
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｏｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ Ｈ２Ｏ２ ｉｎ Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ ｃｅｌｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅｓ
值升高ꎻ １０ ｍｍｏｌ / Ｌ Ｈ２Ｏ２处理使培养基 ｐＨ 值显
著升高ꎬ 且处理 １０ ｍｉｎ 时 ｐＨ 值升高量为对照的
２􀆰５８倍ꎮ 说明外源 Ｈ２ Ｏ２ 可引发培养基 ｐＨ 值
升高ꎮ
２􀆰 ２􀆰 ２　 过氧化氢淬灭剂(ＤＭＴＵ)处理对 ＳＡ 诱发
的培养基碱化的影响
ＤＭＴＵ 可以有效淬灭胞内 Ｈ２Ｏ２ [２３]ꎬ 为探讨
ＳＡ诱发胞内产生的 Ｈ２Ｏ２对培养基 ｐＨ值变化的影
响ꎬ 向丹参悬浮培养细胞中加入 ５０ μｍｏｌ / Ｌ
ＤＭＴＵꎮ 结果表明(图 ４)ꎬ ＤＭＴＵ处理未使培养基
ｐＨ值发生明显改变ꎻ ＤＭＴＵ 与 ＳＡ 联合处理时ꎬ
ＤＭＴＵ则显著抑制了 ＳＡ诱导的培养基碱化ꎬ 且处
理 １０ ｍｉｎ时使 ＳＡ诱发的 ｐＨ值升高量下降 ５０％ꎮ
说明 ＤＭＴＵ 可通过清除胞内产生的 Ｈ２Ｏ２而消弱
ＳＡ诱导培养基碱化的程度ꎮ
２􀆰 ２􀆰 ３　 ＮＡＤＰＨ 氧化酶抑制剂( ＩＭＤ)处理对 ＳＡ
诱发的培养基碱化的影响
ＮＡＤＰＨ氧化酶是胞内产生 Ｈ２Ｏ２的主要酶类ꎬ
ＩＭＤ是抑制 ＮＡＤＰＨ氧化酶的专一性抑制剂ꎬ 为探
讨 ＳＡ诱发胞内产生的 Ｈ２Ｏ２对培养基 ｐＨ值变化的
影响ꎬ 向处理的丹参悬浮培养细胞中加入 ４００ μｍｏｌ / Ｌ
ＩＭＤ与 ２２ ｍｇ / Ｌ ＳＡꎮ 结果显示(图 ４)ꎬ ＩＭＤ几乎
８０４ 植 物 科 学 学 报 第 ３３卷　
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图 ３　 Ｈ２Ｏ２对丹参悬浮培养细胞培养基 ｐＨ值的影响
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｈ２Ｏ２ ｏｎ ｔｈｅ ｐＨ ｖａｌｕｅ ｏｆ Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉａ
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CK SA DMTU DMTU + SA
IMD IMD + SA DMTU + IMD DMTU + IMD + SA
图 ４　 ＤＭＴＵ、 ＩＭＤ、 ＤＭＴＵ / ＩＭＤ处理对 ＳＡ诱导的丹参悬浮培养细胞培养基 ｐＨ值的影响
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏｕｒｅａꎬ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ ａｎｄ ＤＭＴＵ / ＩＭＤ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ ｏｎ ｔｈｅ ｐＨ ｖａｌｕｅ ｏｆ
Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉａ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ
完全抑制了 ＳＡ诱发的培养基碱化ꎬ 说明 ＩＭＤ通过
抑制 ＮＡＤＰＨ 氧化酶产生 Ｈ２Ｏ２而抑制了 ＳＡ 诱导
的培养基碱化ꎮ
２􀆰 ２􀆰 ４　 ＤＭＴＵ与 ＩＭＤ联合处理对 ＳＡ诱发的培养
基碱化的影响
　 　 由图 ４ 可见ꎬ 二甲基硫脲 (ＤＭＴＵ)与咪唑
( ＩＭＤ)联合处理使丹参悬浮培养细胞培养基出现
轻微酸化ꎬ 且酸化程度随着处理时间的延长而增
加ꎻ ＤＭＴＵ ＋ ＩＭＤ 处理使 ＳＡ 诱导的培养基 ｐＨ
值变化量显著低于 ＳＡ处理ꎬ 即 ＤＭＴＵ 和 ＩＭＤ 联
合处理完全抑制了 ＳＡ诱导的培养基碱化ꎮ 当 ＳＡ
诱导产生的 Ｈ２Ｏ２被抑制或被清除时ꎬ 培养基碱
化则被抑制ꎬ 说明 Ｈ２Ｏ２参与了 ＳＡ诱导的培养基
碱化过程ꎮ
２􀆰 ３　 ＳＡ处理对质膜 Ｈ＋￣ＡＴＰａｓｅ活性的影响
ＳＡ处理后丹参悬浮培养细胞质膜 Ｈ＋￣ＡＴＰａｓｅ
活性的变化表明(图 ５)ꎬ 质膜 Ｈ＋￣ＡＴＰａｓｅ 活性随
处理时间的延长呈先降低后增加的趋势ꎬ 并在处理
２ ｈ时降至最低(０􀆰 ２６４ μｍｏｌ Ｐｉ􀅰ｍｉｎ－１􀅰ｍｇ－１ Ｐｒ)ꎮ
说明 ２２ ｍｇ / Ｌ ＳＡ 可抑制质膜 Ｈ＋￣ＡＴＰａｓｅ 活性ꎬ
且通过抑制质膜 Ｈ＋￣ＡＴＰａｓｅ减少 Ｈ＋外流ꎬ 从而引
发培养基碱化ꎮ
９０４　 第 ３期　 　 　 　 　 　 张洪培等: 水杨酸诱发的丹参悬浮培养细胞内 Ｈ２Ｏ２迸发与其培养基碱化的关系
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图 ５　 ＳＡ处理对丹参悬浮培养细胞质膜
Ｈ＋ ￣ＡＴＰａｓｅ活性的影响
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｏｎ ＰＭ Ｈ＋￣ＡＴＰａｓｅ
ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅｓ
２􀆰 ４　 质膜 Ｈ＋￣ＡＴＰａｓｅ活性对 ＳＡ诱导的培养基碱
化的影响
２􀆰 ４􀆰 １　 质膜 Ｈ＋￣ＡＴＰａｓｅ抑制剂(Ｎａ３ＶＯ４)处理对
培养基 ｐＨ值的影响
Ｎａ３ＶＯ４是质膜 Ｈ
＋￣ＡＴＰａｓｅ的抑制剂ꎬ 为了明
确质膜 Ｈ＋￣ＡＴＰａｓｅ 活性对培养基 ｐＨ 值的影响ꎬ
向丹参悬浮培养细胞中添加不同浓度的 Ｎａ３ＶＯ４ꎮ
结果表明(图 ６)ꎬ Ｎａ３ＶＯ４处理使培养基快速碱化ꎬ
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50 mol/L Na VOμ 3 4 100 mol/Lμ Na VO3 4
图 ６　 Ｎａ３ＶＯ４对丹参悬浮培养细胞培养基 ｐＨ值的影响
Ｆｉｇ􀆰 ６　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｎａ３ＶＯ４ ｏｎ ｔｈｅ ｐＨ ｖａｌｕｅ
ｏｆ Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉａ
且随着处理浓度的升高ꎬ 培养基碱化程度越强、 碱
化速度也越快ꎮ 说明质膜 Ｈ＋￣ＡＴＰａｓｅ 活性被抑制
是引起培养基碱化的主要原因ꎮ
２􀆰 ４􀆰 ２　 质膜 Ｈ＋￣ＡＴＰａｓｅ 激活剂(ＦＣ)处理对 ＳＡ
诱导的培养基碱化的影响
　 　 为了验证质膜 Ｈ＋￣ＡＴＰａｓｅ 活性影响 ＳＡ 诱导
的培养基碱化ꎬ 使用质膜 Ｈ＋￣ＡＴＰａｓｅ 激活剂壳梭
孢菌素(ＦＣ)预先激活质膜 Ｈ＋￣ＡＴＰａｓｅ 后发现(图
７: Ａ)ꎬ ＦＣ 处理可迅速引发培养基酸化ꎬ 且 ＦＣ
浓度越高ꎬ 培养基酸化程度越大ꎮ ＦＣ 预处理后再
外源施加 ＳＡꎬ 则培养基酸化受到抑制ꎬ ＦＣ ＋ ＳＡ
处理使丹参悬浮培养细胞培养基 ｐＨ 值的升高量低
于 ＳＡ处理(图 ７: Ｂ)ꎮ 说明激活质膜质子泵可逆
转 ＳＡ诱发的培养基碱化过程ꎮ
为了明确培养基 ｐＨ值降低是否对研究结果有
影响ꎬ 我们用 ０􀆰 １ ｍｏｌ / Ｌ ＨＣｌ将丹参悬浮培养细胞
培养基 ｐＨ值调至 ４􀆰 ２ꎬ 再外源施加 ＳＡ 诱导ꎮ 结
果显示(图 ７: Ｂ)ꎬ ＨＣｌ ＋ ＳＡ处理使培养基 ｐＨ值
的升高量与 ＳＡ处理间无显著差异ꎬ 表明单一的培
养基 ｐＨ值降低不影响 ＳＡ诱导的培养基碱化过程ꎻ
而 ＦＣ ＋ ＳＡ处理使培养基 ｐＨ值的升高量显著降低ꎬ
即 ＦＣ能抑制 ＳＡ诱发的培养基碱化作用ꎬ 说明激活
态的质膜质子泵可抑制 ＳＡ诱发的培养基碱化过程ꎮ
２􀆰 ５　 质膜 Ｈ＋￣ＡＴＰａｓｅ活性改变引发的培养基 ｐＨ
值变化对 ＳＡ诱导产生 Ｈ２Ｏ２的影响
２􀆰 ５􀆰 １　 Ｎａ３ＶＯ４处理对丹参悬浮培养细胞内 Ｈ２Ｏ２
含量的影响
Ｎａ３ＶＯ４可以通过抑制质膜 Ｈ
＋￣ＡＴＰａｓｅ活性引
起培养基碱化(图 ６)ꎮ 用 ５０ μｍｏｌ / Ｌ Ｎａ３ＶＯ４处理
丹参悬浮培养细胞后其培养基碱化对细胞内 Ｈ２Ｏ２
含量的影响(图 ８)表明ꎬ Ｎａ３ＶＯ４处理 １０ ｍｉｎ时丹
参悬浮培养细胞内 Ｈ２Ｏ２含量迅速升高ꎬ 分别比对
照组和 ＳＡ 诱导组高 ２５􀆰 ５％和 １６􀆰 ２％ꎮ 说明
Ｎａ３ＶＯ４处理引起的培养基碱化可诱导 Ｈ２Ｏ２迸发ꎬ
且培养基碱化引发的 Ｈ２Ｏ２迸发时间早于 ＳＡ处理ꎬ
但在实验设定时间内只有一次 Ｈ２Ｏ２迸发ꎬ 说明单
纯的培养基碱化引发的 Ｈ２Ｏ２迸发弱于 ＳＡ处理ꎮ
２􀆰 ５􀆰 ２　 ＦＣ处理对 ＳＡ诱导的 Ｈ２Ｏ２含量的影响
ＦＣ处理可促进 Ｈ＋释放从而抑制 ＳＡ 诱发的培
养基碱化(图 ７)ꎮ 用 １ μｍｏｌ / Ｌ ＦＣ处理丹参悬浮培
养细胞后其胞内 Ｈ２Ｏ２含量变化(图 ９)表明ꎬ 胞内
Ｈ２Ｏ２含量显著低于对照ꎮ ＦＣ 预处理后再用 ＳＡ 诱
导ꎬ 分别引发 Ｈ２Ｏ２在 ２０ ｍｉｎ 和 ２ ｈ 时的 ２ 次迸
发ꎬ 但迸发量显著低于 ＳＡ 诱导组ꎮ 说明当质膜
Ｈ＋￣ＡＴＰａｓｅ被激活且培养基碱化作用被抑制后ꎬ
ＳＡ诱发的 ２次 Ｈ２Ｏ２迸发均被抑制ꎮ
０１４ 植 物 科 学 学 报 第 ３３卷　
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图 ７　 壳梭孢菌素(ＦＣ)对丹参悬浮培养细胞培养基 ｐＨ值的影响
Ｆｉｇ􀆰 ７　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｆｕｓｉｃｏｃｃｉｎ ｏｎ ｔｈｅ ｐＨ ｖａｌｕｅ ｏｆ Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉａ
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图 ８　 Ｎａ３ＶＯ４对丹参悬浮培养细胞内 Ｈ２Ｏ２含量的影响
Ｆｉｇ􀆰 ８　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｎａ３ＶＯ４ ｏｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ Ｈ２Ｏ２ ｉｎ Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅｓ
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图 ９　 ＦＣ对 ＳＡ诱导的丹参悬浮培养细胞内 Ｈ２Ｏ２含量的影响
Ｆｉｇ􀆰 ９　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｆｕｓｉｃｏｃｃｉｎ ｏｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ Ｈ２Ｏ２ ｉｎ Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ ｃｅｌｌｓ ａｆｔｅｒ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ
１１４　 第 ３期　 　 　 　 　 　 张洪培等: 水杨酸诱发的丹参悬浮培养细胞内 Ｈ２Ｏ２迸发与其培养基碱化的关系
３　 讨论
培养基碱化伴随有细胞质酸化ꎬ 是诱导子引发
的早期信号之一[５]ꎮ 细胞质酸化被视为响应外界
刺激的重要步骤ꎬ 可诱导活性氧的迸发和次生代谢
物质合成[９]ꎮ 植物遭受胁迫后可诱导胞质酸化及
胞内活性氧积累ꎬ 这两种不同的胞内信号协同作
用[２４]ꎮ 本研究结果表明ꎬ ＳＡ 可诱导丹参悬浮培养
细胞内 Ｈ２Ｏ２迸发、 培养基碱化(细胞质酸化)ꎻ 诱
导 Ｈ２Ｏ２迸发与培养基碱化的 ＳＡ最佳浓度(２２ ｍｇ/ Ｌ
ＳＡ)一致ꎬ 并与行冰玉等诱导丹参酚酸类次生代谢
物生物合成的 ＳＡ 最佳浓度一致[２１]ꎮ 此外ꎬ 陈红
艳等研究表明ꎬ Ｈ２Ｏ２影响丹参培养细胞丹酚酸
(Ｓａｌ Ｂ)的合成[２０]ꎬ 故可以推测培养基碱化可能也
与丹参悬浮培养细胞的次生代谢过程有关ꎮ
质膜电位的瞬时变化构成植物感受胞外刺激的
早期反应ꎬ 质膜 Ｈ＋￣ＡＴＰａｓｅ 对维持细胞内外 ｐＨ
值起着重要作用ꎬ 其抑制态促进质子内流、 培养基
碱化、 防御基因表达[２５]ꎬ 激活态则抑制寡聚糖和
系统素引起的抗性反应发生ꎬ 使质子外流、 培养基
酸化[２６]ꎮ 本实验中 ＳＡ 处理抑制了质膜 Ｈ＋￣ＡＴ￣
Ｐａｓｅ 活性ꎬ 说明 ＳＡ 可能通过抑制质膜 Ｈ＋￣ＡＴ￣
Ｐａｓｅ活性促使 Ｈ＋内流从而引发培养基碱化ꎻ ＳＡ
与钒酸钠(Ｎａ３ＶＯ４)处理均可引发丹参培养基的快
速碱化ꎬ 壳梭孢菌素(ＦＣ)处理导致培养基快速酸
化ꎬ 并抑制 ＳＡ诱导的胞外介质碱化过程ꎬ 说明质
膜 Ｈ＋￣ＡＴＰａｓｅ参与 ＳＡ 对细胞内外 ｐＨ 值的调控ꎬ
ＳＡ对质膜 Ｈ＋￣ＡＴＰａｓｅ的抑制作用是引发培养基碱
化的原因之一ꎮ
细胞响应外界胁迫有着复杂的信号传递网络ꎬ
信号间存在交叉互作[４]ꎮ Ｈ２Ｏ２大量迸发可抑制质
膜 Ｈ＋￣ＡＴＰａｓｅ 活性ꎬ 影响细胞内外 ｐＨ 值[６]ꎬ 脱
落酸则主要通过 Ｈ２Ｏ２诱导质膜 Ｈ
＋￣ＡＴＰａｓｅ去磷酸
化来实现胞质酸化ꎻ 同时ꎬ 质膜质子泵抑制造成的
培养基碱化可诱导细胞活性氧迸发[９]ꎬ 说明 Ｈ２Ｏ２
与胞质酸化在植物响应外界胁迫的信号转导中存在
相互作用ꎮ 本研究发现ꎬ 外源 Ｈ２Ｏ２可引发丹参悬
浮培养细胞培养基碱化ꎬ 但程度低于２２ ｍｇ / Ｌ ＳＡ
处理ꎬ 用 Ｈ２Ｏ２的淬灭剂 ＤＭＴＵ及主要合成酶抑制
剂 ＩＭＤ处理丹参悬浮培养细胞后均抑制了 ＳＡ诱导
的培养基碱化ꎬ 说明 Ｈ２Ｏ２参与 ＳＡ 诱导的培养基
碱化过程ꎬ 但并非是唯一参与的信号分子ꎻ 质膜
Ｈ＋￣ＡＴＰａｓｅ激活剂抑制 ＳＡ 诱导的 Ｈ２Ｏ２的 ２ 次迸
发ꎬ 且使 Ｈ２Ｏ２迸发时间提前ꎬ 说明通过抑制质膜
Ｈ＋￣ＡＴＰａｓｅ造成的培养基碱化促进了 Ｈ２Ｏ２的迸
发ꎬ 但迸发量低于 ＳＡ处理ꎬ 说明培养基碱化只是
ＳＡ诱导 Ｈ２Ｏ２迸发的因素之一ꎮ ＳＡ 通过质膜 Ｈ
＋￣
ＡＴＰａｓｅ诱导的培养基碱化促进 Ｈ２Ｏ２迸发ꎬ 进而
促进胞外碱化进程ꎮ Ｈ２Ｏ２与培养基碱化协同作用ꎬ
将 ＳＡ诱导产生的信号级联放大ꎬ 诱发防御应答反
应ꎬ 从而影响细胞的生长发育及次生代谢以抵御逆
境胁迫ꎮ 然而ꎬ 仅通过以上研究不能证明伴随培养
基碱化发生的细胞质酸化程度ꎬ 也很难解释清楚
Ｈ２Ｏ２与细胞质酸化间的关系ꎬ 还需要通过进一步
实验(如利用激光共聚焦显微镜观察细胞质 ｐＨ 值
的变化情况)提供更直接的证据ꎮ
４　 结论
水杨酸可诱导丹参悬浮培养细胞 Ｈ２Ｏ２迸发及
其培养基碱化ꎮ 水杨酸诱发的 Ｈ２Ｏ２参与培养基碱
化的诱导过程ꎻ 水杨酸抑制质膜质子泵活性ꎬ 质膜
质子泵参与培养基碱化过程ꎻ 水杨酸诱发的培养基
碱化促进 Ｈ２Ｏ２迸发ꎮ 因此ꎬ 丹参悬浮培养细胞内
Ｈ２Ｏ２迸发与其培养基碱化之间相互关联、 协同作
用ꎬ 共同响应水杨酸的诱导ꎮ
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ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ
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ｌｉｘ Ｇꎬ Ｎｕｒｎｂｅｒｇｅｒ Ｔ. Ｂａｃｔｅｒｉａ￣ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙ￣
ｃａｎｓ ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅ ｐａｔｈｏｇｅｎ￣ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｐａｔｔｅｒｎｓ ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
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Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｅｌｌｓ ｉｎｖｏｌｖｅｓ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ
ｐｒｏｔｏｎ ｐｕｍｐｉｎｇ ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｔｏ ａｎｉｏｎ ｃｈａｎｎｅｌ ａｃｔｉ￣
ｖａｔｉｏｎꎬ ｗｈｉｃｈ ａｌｅ ｂｏｔｈ Ｃａ２＋ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ[Ｊ] . Ｊ Ｐｌａｎｔ
Ｐｈｙｓｉｏｌꎬ ２００４ꎬ １３５(１): ２３１－２４３.
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ｂｒａｎｅ Ｈ＋￣ＡＴＰａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ａｃｔｉｖａｔｅｓ
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(责任编辑: 刘艳玲)
３１４　 第 ３期　 　 　 　 　 　 张洪培等: 水杨酸诱发的丹参悬浮培养细胞内 Ｈ２Ｏ２迸发与其培养基碱化的关系