全 文 ：武汉植物学研究 2010, 28(6): 673~681
Journal of Wuhan Botanical Research


收稿日期: 2010-01-19, 修回日期: 2010-03-19。
基金项目: 国家自然科学基金项目(30671433); 武汉市青年科技晨光计划项目(200750731299); 中国科学院知识创新工程重要
方向性项目—— 植物园与生物分类学研究专项(KSCX2-YW-Z-052)。
作者简介: 杨俊(1984−), 男, 硕士, 研究方向为园艺植物分子遗传学(E-mail: yangjun07@mails.gucas.ac.cn)。
∗通讯作者 : 王彦昌(1973-), 男 , 副研究员 , 博士 , 研究方向为园艺植物分子遗传学(Author for correspondence. E-mail: kiwi-
fruit@wbgcas.cn)。
DOI: 10.3724/SP.J.1142.2010.60673
红肉猕猴桃 DFR 基因的克隆及表达分析
杨 俊1,2, 姜正旺1, 王彦昌1∗
(1. 中国科学院武汉植物园保育遗传重点实验室, 武汉 430074; 2. 中国科学院研究生院, 北京 100049)
摘 要: 利用葡萄(Vitis vinifera)果实的 DFR-cDNA序列搜索猕猴桃(Actinidia Lindl.)EST数据库, 拼接所有与
该 cDNA相似片段成 contig并借此设计引物, 分离出红肉猕猴桃(A. chinensis var. rufopulpa)中 DFR的两个
克隆(AcDFR1和 AcDFR2)的片段。在此基础上利用 5′RACE和 3′RACE技术, 分别克隆到具有完整阅读框的
AcDFR1(1264 bp)和靠近 3′端的部分 AcDFR2序列(880 bp)。AcDFR1与茶 DFR-cDNA(Camellia sinensis)
相似达 84%, 且 AcDFR1与非洲菊变种(Gerbera hybrida var. regina)的氨基酸序列相似达 80%。据 DFR聚
类分析, AcDFR1与 AcDFR2蛋白类型上差异显著。实时定量 PCR分析表明, AcDFR1在‘金魁’(A. chinensis
var. deliciosa ‘Jinkui’)中表达很高, AcDFR1和 AcDFR2在‘金农’(A. chinensis var. chinensis ‘Jinnong’)与
‘红阳’(A. chinensis var. chinensis ‘Hongyang’)中较低, 且在果实发育后期(大约花后 90~120 d) 均有所升高,
二者可能参与了红肉猕猴桃中花青素的积累, 而在绿肉猕猴桃‘金魁’与黄肉猕猴桃‘金农’中, AcDFR1可
能还参与了类黄酮代谢过程中的上游分支途径。
关键词: 猕猴桃; 二氢黄酮醇-4-还原酶基因; 电子克隆; 花青素; 表达
中图分类号: Q344; S663.4 文献标识码: A 文章编号: 1000-470X(2010)06-0673-09

Cloning and Expression of Dihydroflavonol 4-Reductase
in Actinidia chinensis var. rufopulpa
YANG Jun1,2, JIANG Zheng-Wang1, WANG Yan-Chang1∗
(1. Wuhan Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430074, China;
2. Graduate University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)
Abstract: Two DFR cDNA sequences similar to full-length DFR cDNA in Vitis vinifera were
reconstructed by overlapping ESTs from Actinidia dbEST. Based on these two sequences, a
full-length AcDFR1 (1264 bp) and partial sequence of AcDFR2 cDNA near 3 end (880 bp) was
obtained using 3RACE and 5RACE in A. chinensis var. rufopulpa. AcDFR1, whose nucleotide
sequence exhibited 84% identity with DFR cDNA of Camellia sinensis, showed 80% identity with
Gerbera hybrida var. regina at the amino acid level. Alignment analysis of DFR showed that
AcDFR1 differed considerably from AcDFR2. To understand the diversity of expression among
green, yellow, and red-fleshed cultivars, real-time PCR was conducted. AcDFR1 expression was
extremely high in green-flesh kiwifruit (Jinkui) but relatively low in the yellow-flesh fruit (Jinnong)
and red-flesh fruit (Hongyang). There was an increasingly higher expression of AcDFR1 and
AcDFR2 in Jinnong and Hongyang fruit after development, especially between 90 to 120 days
after flowering. This indicated that the two transcriptions both catalyzed the accumulation of
anthocyanins during fruit growing development. Results also suggested that AcDFR1 and
AcDFR2 both participated in the anthocyanin pathway. In addition, AcDFR1 may have additional

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functions related to other flavonol metallization referred to upper-stream pathways of Jinnong and
Jinkui fruit.
Key words: Actinidia; Dihydroflavonol 4-reductase; Cloning; Anthocyanin; Gene expression
猕猴桃因其营养丰富, 富含维生素 C, 在国际
国内市场上显示出很高的经济价值[1]。在主要栽培
种中华猕猴桃(Actinidia chinensis var. chinensis)
及其变种美味猕猴桃(A. chinensis var. deliciosa)
中, 果实成熟时果肉颜色主要表现为黄色、绿色或
二者的中间色。在猕猴桃野生资源中, 发现了非常
稀少的大果红肉猕猴桃资源, 如中华猕猴桃中的
红肉猕猴桃变种(A. chinensis var. rufopulpa), 其
内果皮的种子胎座基质与隔膜间隔分布, 形成放
射状, 色彩美观, 具有甜度高的风味特点。目前在
四川苍溪、都江堰及雅安等地大面积栽培的‘红
阳’是世界上第一个商业化的红肉猕猴桃品种, 果
实的内果皮组织横剖面呈放射状红色, 综合品质
较好, 推广范围较大[2,3]。但是各地栽培实践及已有
研究表明, ‘红阳’猕猴桃的果肉着色极易受到环
境条件的影响, 比如在低海拔高温地区栽培时着
色浅, 几乎失去了该品种的特质。相比而言, 四川
苍溪等低山地栽培区种植的红阳猕猴桃具有着色
深、风味好、综合性状优良、能充分表现品种的
特质。由于我国各猕猴桃主栽区的生态条件差异
很大, 着色稳定性成为限制‘红阳’推广的关键因
素之一, 研究‘红阳’猕猴桃着色的环境调控机制
对于提高果实品质, 有效推广该品种具有重要的
理论指导价值。
花青素作为植物器官着色的一类主要次生代
谢产物, 其抗氧化作用明显, 在一定程度上可以缓
解心血管疾病[4,5]。因此, 富含植物花青素的天然食
品开发也成为农业领域的关注热点。Montefiori
等报道[6], ‘红阳’猕猴桃果肉呈红色的主要原因
是, 果实内果皮中含有花青素 Cyanidin 3-O-xylo(1-
2)-galactoside, 而中华猕猴桃的绿肉和黄肉品种
均未发现花青素的积累[7]。通过长期的研究, 植物
花青素的生物化学合成途径已经很清楚, 该过程
在植物界相当保守, 主要由 PAL、CHS、UFGT等
基因编码的酶催化合成。其中, DFR是花青素代谢
途径中位于上游的重要功能蛋白, 与 NADP 偶联
催化蛋白直接作用于黄酮醇产生无色花青素 [8],
而无色花青素是合成花青素和单宁的底物。DFR
功能的缺失将直接导致花青素无法形成[9]。通常认
为是一个单独基因或者是一个小的基因家族, 如
在大麦、拟南芥、葡萄、金鱼草以及水稻中都被认
为是一个独立的基因[10−16], 在蒺藜苜蓿的 EST数据
库中搜索到了 2个 DFR基因, 发现氨基酸位点的
改变可能导致由于底物异构而产生偏好 [17], 在蕃
薯基因组中发现 3个串联的 DFR基因, 并且 DFR
可能已经突变成抑制花青素积累 [18,19]。最近发现
在百脉根(Lotus japonicus)中, 有 5个拷贝组成的
DFR 基因家族, 并且这些拷贝在不同程度上受到
调控因子的调节, 表明这些拷贝的启动子受到独
立的调控[20]。
红肉猕猴桃中花青素代谢的 F3H的基因已经
被克隆[21], 但其他途径基因尚未见报道, 如要诠释
红肉猕猴桃花青素代谢途径及其环境调控机理 ,
有必要分离猕猴桃 DFR的基因, 并研究其在果实
成熟过程中的表达情况, 这有利于逐步阐明红肉
猕猴桃着色稳定性的关键环节, 最终应用于指导
栽培。本研究克隆了猕猴桃中一个 DFR cDNA的
全长 CDS, 并发现另一个在成熟果实中显著表达
的 DFR,得到该转录本的主要功能区及 3 端的片
段。利用推测蛋白的氨基酸序列, 同时结合这两个
转录本在不同时期的表达情况, 初步探讨 DFR对
红肉猕猴桃中花青素积累的调节机理。
1 材料与方法
1.1 材料
本研究使用的材料是中国科学院武汉植物园
猕猴桃资源圃内中华猕猴桃(Actinidia chinensis
var. chinensis)红肉品种 ‘红阳 ’、黄肉品种 ‘金农 ’
和绿肉品种‘金魁’, 各设置 3 个单株作为重复, 根
据较长时间对猕猴桃果实在武汉的呈色情况的观
察, 将采样时间定为花后 0、30、65、90、120、
150 d。果实采摘后在冰上迅速切取内果皮, 每
5 个果实混合取样 , 在液氮中冷冻 , −70°C 低温
保存。

第 6期 杨 俊等: 红肉猕猴桃 DFR基因的克隆及表达分析 675


1.2 方法
1.2.1 总 RNA 提取
猕猴桃果肉总 RNA提取采用改良的氯化锂沉
淀法[22]。① 研磨样品材料, 取 75~150 mg加入装
有 700 μL pH值为 7.5 的提取液( NaCl 0.02 mol/L、
Tris-base 0.01 mol/L、EDTA 0.0015 mol/L、SDS
0.5 g/100 mL、PVP-40 3 g/100 mL、1%巯基乙
醇) 的 1.5 mL离心管中, 快速混匀, 室温放置 5 min;
② 加入 600 μL的水饱和酚, 充分混匀放置 3 min;
③ 继续加入 120 μL氯仿:异戊醇(24:1), 混匀静置
3 min; ④ 再加入 42 μL 醋酸钠, 剧烈震荡混合均
匀, 冰上放置 15 min, 4°C 下 14000 r/min 离心
15 min; ⑤ 取上清液于一新的 1.5 mL EP管中并
加入等体积的水饱和酚及氯仿: 异戊醇(24:1), 充
分混匀, 4°C下 14000 r/min离心 15 min, 取上清
液, 加入 1/4 体积 12 mol/L氯化锂, −20°C沉淀 2 h,
随后以 14000 r/min离心 20 min, 小心弃掉上清液,
用适量的 75%乙醇洗涤沉淀, 在通风处吹干, 然
后将沉淀溶于适量的 DEPC水中, 变性电泳检测。
1.2.2 反转录获得 cDNA
利用新提取的总 RNA合成第一链 cDNA, 酶
SuperScriptTM II Reverse Transcriptase 购 自
Invitrogen。加 0.5~1 μg总 RNA于 2个 0.5 mL
离心管中, 分别加入 1 μL 3接头 5-GCGAGCAC
AGAATTAATACGACTCACTATAGGT12VN-3与
1 μL 5接头 5-AAGCAGTGGTATCAACGCAGA
GTACGCGGG-3, 各加入1 μL Oligo(dT)12 及1 μL
dNTP (10 mmol/L), 最后加DEPC处理水至 12 μL。
65°C 干浴 5 min, 迅速置碎冰中 , 加入 5X first
strand buffer 4 μL, 0.1 mol/L DTT 2 μL, RNasein
1 μL, 1000 g离心 10 s, 42°C干浴 2 min, 加入 1 μL
SuperScript TM II, 混匀后 , 42°C 干浴 1 h, 70°C
干浴 15 min, 获得 5RACE-Ready 和 3RACE-
Ready cDNA。
1.2.3 DFR 基因克隆
利用葡萄的 DFR cDNA序列搜索猕猴桃 EST
数据库 , 分别从 Young-fruit library 和 Ripe-fruit
library 得到相似的片段, 从这些片段中选择打分
最高的片段 , 重新对中华猕猴桃 Young-fruit
library和 Ripe-fruit library EST数据库进行 Blast
检索, 将部分重叠且相似度很高的片段拼接从而
产生 contig。反复这一过程, 拼接出尽可能长的
contig。最终得到 1341 bp的 AcDFR1和 574 bp
的 AcDFR2, 并以此片段设计引物 (AcDFR1-F:
5-GAAAGCGGAGACGAACCTGAC-3, R: 5-C
CTCATCATCTTCGCGAAATC-3; AcDFR2-F: 5-
TGGATGTACTGGTGTCTTC-3, R: 5-GCAGGT
AAATGTGAGCGTT-3)。用反转录得到的 cDNA
为模板进行 PCR扩增, 将回收的产物克隆测序验
证。PCR反应体系 20 μL: 10 × buffer 2 μL, Mg2+
1.8 μL, dNTP(10 mmol/L) 0.5 μL, 引物(10 μmol/L)
各 0.6 μL, 模板 cDNA 0.5 μL, Taq DNA 聚合酶
0.2 μL, 加灭菌双蒸水至 20 μL。TD-PCR 程序 :
94°C 预变性 4 min; 94°C变性 30 s, 63°C 复性
30 s(每个循环降低 1度), 72°C 40 s, 13 个循环;
94°C 30 s, 47°C 30 s, 72°C 40 s, 30个循环; 72°C
延伸 8 min。拼接用软件 Vector NTI, 引物设计用
Oligo 6。
利用克隆的特异片段序列, 分别设计 5′ 和 3
端扩增引物。5′ PCR反应程序为：94°C 变性 5 min;
94°C 30 s, 75°C 30 s, 72°C 1 min, 5个循环; 94°C
30 s, 72°C 1.2 min, 6 个循环 ; 94°C 30 s, 68°C
30 s, 72°C 1 min, 35 个循环。体系为 50 μL：
2.5 μL 的 5′ RACE-Ready cDNA 为模板 , 2 μL
ExTaq buffer 2 μL, 上游混合引物 a 5 μL, 5′ GSP
(10 mmol/L) 1 μL, dNTP(10 mmol/L) 1 μL, ExTaq
酶 0.25 μL, 加无菌去离子水至 50 μL。
3′ PCR 反应程序为：94°C 5 min; 94°C 30 s,
60°C 30 s(每个循环降低 1度), 72°C 1 min, 15 个
循环; 94°C 30 s, 48°C 30 s, 72°C 1 min, 27个循
环; 72°C 8 min。反应体系为 20 μL：10 × buffer
2 μL, Mg2+ 1.8 μL, dNTP(10 mmol/L) 0.5 μL, 下游
引物 b (10 μmol/L)和 3′ GSP (10 mmol/L)各 0.6 μL,
模板 3′ RACE-Ready cDNA 1 μL, ExTaq DNA聚
合酶 0.15 μL, 加灭菌双蒸水至 20 μL。
混合引物 a：5′-CTAATACGACTCACTATAG
GGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3(终浓
度 0.4 µmol/L)+5′-CTAATACGACTCACTATAG
GGC-3′(终浓度 2 µmol/L);
引物 b (终浓度 10 mmol/L)：5′-GCGAGCAC
AGAATTAATACGACT-3′;
5GSP-AcDFR1 (10 mmol/L)：5′-CCACAGG

676 武 汉 植 物 学 研 究 第 28卷


GTCAGGTTCGTCTCCGCT-3′;
3′ GSP-AcDFR1同 AcDFR1F;
3′ GSP-AcDFR2 同 AcDFR2F。
1.2.4 质粒回收
质粒提取试剂盒购自北京普博欣公司。① 将
扩增得到的片段回收后, 与 pGEM-T载体连接, 转
染感受态, 涂平板, 过夜培养。② 挑单克隆, 同时
接种于两个 1.5 mL离心管中的液体培养基上。其
中一个 37°C摇菌培养 4 h后, 做菌液PCR检测; 另
一个培养 16 h。③ 选择阳性单克隆的菌液提取质
粒。④ 按照质粒说明书提取。⑤ 用质粒做模板,
PCR检验是否有目的条带。
1.2.5 Real-time PCR
将含有目的片段的质粒纯化后, 制作两个转
录本的标准曲线 conc= 10^(-0.364×CT + 5.245);
R2=0.98886。将各个时期提取的 RNA反转后稀释
10 倍 , 260 nm 测定 OD 值 , 计算浓度。仪器为
Rotor-gene6000, 反应体系 10 μL：各时期用
Oligo反转录得到的模板 cDNA 1 μL; 10 × buffer
1 μL; Mg2+ 0.8 μL; 引物各加 0.3 μL; dNTP 0.3 μL;
染料 EvaGreen 1 μL; Taq 酶 1 μL; 加无菌去离子
水至 10 μL。所用引物有：
QPCR-AcDFR1-F: 5-AATGACTGGATGGA
TGTA-3(10 mmol/L);
QPCR-AcDFR1-R: 5-CAATAGATGGTTGA
ATGGT-3(10 mmol/L);
QPCR-AcDFR2-F: 5-CATCAACAGCCTCG
GTAT-3(10 mmol/L);
QPCR-AcDFR2-R: 5-CATCCAGCCAGTCA
TCTT-3(10 mmol/L)。
2 结果及分析
2.1 DFR基因的克隆
通过预测得到 1341 bp的拼接 DFR contig,
以此片段设计特异引物, PCR扩增得到约 600 bp
的片段, 回收纯化后交给公司测序, 发现与预期片
段长度相符。并预测其位于靠近 DFR中部的主要
功能区域。以此特异片段进一步扩增出 AcDFR1
的 3′与 5′端序列, 将扩增得到的所有条带回收纯
化后, 交给公司测序(图 1)。测序检测结果表明, 只
有两条片段的测序结果与 600 bp的片段有重叠,
分别为 778 bp和 274 bp, 与 600 bp片段拼接后
除去相似部分得全长 AcDFR1 cDNA, 共 1264 bp,
并且预测出完整 ORF(图 2)。此外, 用同样的方法
得到转录本 AcDFR2 , 大小约 500 bp的中段序列,
通过 3 RACE扩增到 700 bp的 3 端序列, 拼接
后为 880 bp的片段(图 3), 但未得到 5端序列。
AcDFR1 cDNA 序列与其他物种的序列相似性很
高, 与茶最为接近, 达到 84%。而 AcDFR2核酸序
列与葡萄中疑似 DFR 的核酸序列最为相似 , 为
71%。

M为 DL2000的 Marker; A1：AcDFR1克隆中部; A2：AcDFR2克隆
中部; B：AcDFR2 的 3-RACE; C：AcDFR1的 5-RACE
M: DL2000 Marker; A1: Middle region of AcDFR1; A2: Middle
region of AcDFR2; B: 3 RACE of AcDFR2; C: 5 RACE of AcDFR1
图 1 PCR 产物检测
Fig. 1 Detection of PCR production
2.2 DFR氨基酸序列分析
翻译后氨基酸序列与其他物种 DFR氨基酸序
列做两两全序列比对(图 4)。如图所示, AcDFR1
与下列物种比对时, 相似性在 80%左右, AcDFR2
则为 60%左右, 并且在蛋白模块水平上与这些物
种的 DFR相似性更高。另外, AcDFR1和 AcDFR2
氨基酸水平上存在较明显差异。 聚类结果表明,
AcDFR1 与茶 CsDFR 的蛋白类型比较相似, 而
AcDFR2 与苹果, 梨等 DFR较为接近。
利用 AcDFR2与 AcDFR1的氨基酸序列进行
全局比对发现, 其相似度为 52%, 可能为同源序
列。并且在蛋白模块水平上相似更高, 可能两种蛋
白在空间结构上具有相近的折叠。除此之外, Beld
等的研究表明, 黑线以下的区域可能影响蛋白酶
对底物的特异性(图 4: A); 不同物种间该区域序列
的差异, 可能是针对底物化合物不同发生的适应
性进化。
2.3 不同时期表达分析
2.3.1 AcDFR1 的表达分析
从不同时期的表达结果来看(图 5), AcDFR1

第 6期 杨 俊等: 红肉猕猴桃 DFR基因的克隆及表达分析 677



ATG为起始密码子, TAA为终止密码子
ATG and TAA are initials and stop codons
图 2 AcDFR1 cDNA 序列及预测氨基酸序列(345 aa)
Fig. 2 AcDFR1 cDNA nucleic acid sequences and deduced amino acid sequences

用靠近 AcDFR2 3端的核酸序列推断出的氨基酸序列, TAG可能为中止密码子
Translation of partial nucleic acid sequences near 3 terminal of AcDFR2, and TAG is a stop codon
图 3 AcDFR2 880 bp cDNA 核酸序列及氨基酸序列(256 aa)
Fig. 3 AcDFR2 cDNA nucleic acid sequences and deduced amino acid sequences
在红肉、绿肉、黄肉猕猴桃中均有表达, 并且贯穿
整个成熟过程。在绿肉猕猴桃品种 ‘金魁 ’中 , 该
基因在开花期的子房中表达量异常高, 是所有样
品及各时期中最 高的, 但开花后 AcDFR1的表达
迅速降低 , 花后 90 d 又有所升高 , 但整体看
AcDFR1在绿肉猕猴桃品种‘金魁’中的表达高于黄
肉品种 ‘金农 ’及红肉品种 ‘红阳 ’; 在 ‘金农 ’与 ‘红阳 ’
内果皮中, 开花期 AcDFR1 基因表达仍高出结果

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A：系统发育树。黑色背景为相似或保守, 灰色背景为蛋白模板相似; 黑线以下残基为可能影响 DFR选择底物特异性的区域。Am: 金鱼草; Cs:
茶; Gh: 非洲菊; Md: 苹果; Ph: 矮牵牛; Pc: 梨; Vv: 葡萄。B: 与其他植物的系统发育树
A：Phylogenetic tree. The identity amino sequences have a black background, while the amino sequences referring to similar protein
blocks have a gray background; The bold black line in A part emphasizes the amino acid residues proposed to determine substrate specificity.
Am: Antirrhinum majus (Garden snapdragon); Cs: Camellia sinensis (Tea); Gh: Gerbera hybrida; Md: Malus domestica (Apple) (Malus
sylvestris); Ph: Petunia hybrida (Petunia); Pc: Pyrus communis (Pear); Vv: Vitis vinifera (Grape). B: Phylogenetic tree
图 4 不同物种中 DFR 相似性比对
Fig. 4 Multiple alignment of DFRs from several species

图 5 AcDFR1 不同时间表达结果(平均值+标准误)
Fig. 5 Temporal expression of AcDFR1(mean+SE)

第 6期 杨 俊等: 红肉猕猴桃 DFR基因的克隆及表达分析 679


初期, 开花后, 果实发育过程中, 该基因表达逐渐
升高, 但‘红阳’果实发育 120 d时表达迅速增强, 并
高于‘金农’中相应时期的表达量, 而此前 90 d 时,
AcDFR1在‘金农’中的表达仍高于‘红阳’。AcDFR1
在果实发育后期的表达有明显上升的趋势。
2.3.2 AcDFR2 的表达分析
从不同时期的表达结果来看(图 6)。‘金魁’中
AcDFR2在开花期, 花后 90 d与 150 d有较低的表
达; 但在‘金农’与‘红阳’中, 其表达主要为果实发育
后期, ‘金农’中 AcDFR2表达的迅速升高开始于花
后 90 d, ‘红阳’中开始于花后 120 d, 但‘金农’内果皮
中 AcDFR2的表达远高于‘红阳’。在‘金农’与‘红阳’
中, AcDFR2在果实发育后期表达也有明显上升的
趋势, 这一点与 AcDFR1 极为相似。
3 讨论
3.1 AcDFR1与 AcDFR2序列差异显著
本研究首次分离克隆了猕猴桃次生代谢途径
的一个全长 AcDFR1 cDNA以及一个部分序列的
AcDFR2, 其中 AcDFR1与其他物种氨基酸序列相
似程度高, 表明该基因可能是猕猴桃花青素途径
中的功能基因, 但由于只得到 AcDFR2 的部分序
列, 未能充分肯定二者在该基因家族中的进化位
置。从序列上看, 个别位点上的差异可能导致不同
的功能, 同样可能改变酶的活性[23], 二者差异较大,
可能存在功能差异, 但是在蛋白模块水平上相似
性较大, 有可能具有相似的二级结构。同时不排除
AcDFR2 可能具有除催化类黄酮以外的功能, 需
要进一步研究。
3.2 AcDFR1与 AcDFR2表达规律差异明显
在不少组织中, 花青素的积累是跟 mRNA 的
表达成正比的, 如茶叶的幼叶及茎尖[24]。黄肉猕猴
桃品种 ‘金农 ’与红肉品种 ‘红阳 ’处于开花期时(图
7), 子房胚珠周围呈现较深的红色 , 此后变为绿
色。两品种中 AcDFR1的表达与胚珠附近红色的
出现及消退时间一致, 可能该基因在其花青素合
成中具有重要作用。由于实验材料有限, 我们目前
还未用子房提取花青素并加以分析。Montefiori
等 [7]的研究表明 , 中华猕猴桃变种内果皮在果实
发育中后期逐渐变红, 已经被证明是花青素的作
用, 花青素的种类也已被验明。AcDFR1在结果初
期存在较低表达, 此后表达上升与果实的转色趋
势基本一致, 也表明该基因可能在花青素途径中
发挥一定功能。除此之外, 绿肉猕猴桃‘金魁’的子
房虽然不积累花青素(子房整体为黄绿色), 然而
子房组织中 AcDFR1表达极高, 显著超过‘金农’和
‘红阳’的表达量, 且 AcDFR1 cDNA在大多数时间
内的表达远高于黄肉与红肉品种, 除了可能因为
其为多倍体植物外, 不排除其他代谢途径参与竞
争, 如其他类黄酮化合物的合成。我们推测该基因
在猕猴桃果实中扮演多种角色, 如可能催化花青
素的积累, 或者参与如类黄酮等其他支路途径的
催化代谢并异常活跃。但这还需做次生产物的检
测及深入研究才能确定。

图 6 AcDFR2 不同时间表达结果(平均值+标准误)
Fig. 6 Temporal expression of AcDFR2 (mean+SE)

680 武 汉 植 物 学 研 究 第 28卷



图 7 武汉栽培的‘红阳’果实不同时期的着色(DAF表示花后天数)
Fig. 7 Pigmentation of ‘Hongyang’ fruit during different development stages
cultivated in Wuhan(DAF, days after flowering)
从 AcDFR2 的表达情况来看, 不同于前期的
低表达, ‘金农 ’及 ‘红阳 ’果实发育后期的表达有所
升高。由于此时果实主要生长发育已经完成, 可以
判断其功能主要体现在催化果实后期的次生代
谢。DFR蛋白酶尚属催化花青素代谢途径的上游
成员, 且 DFR的催化产物可继续被催化生成无色
花青素和花青素并可能进一步积聚形成单宁等[25] 。
Xie等[17]的研究表明, 花青素的积累需要多个催化
蛋白的共同作用, 下游某些蛋白的缺失或者不表
达, 可能无法形成具有呈色能力的花青素; 如果成
功合成花青素, 也不能完全排除其将被进一步催
化形成其他次生产物, 如单宁等。鉴于该途径各成
员基因与着色的关系并非简单线性关系, 故本研
究无法判定哪条基因直接关联花青素的积累。然
而, 就以上不同种之间表达结果来看, AcDFR1和
AcDFR2 可能共同参与一个或多个代谢途径, 并
且有可能存在协同作用。
4 小结
综上所述, 对来自四川着色较深的‘红阳’品
种着色过程中这些基因的表达进行分析将会对基
因功能提供更多的线索。同时由于猕猴桃果实中
花青素合成途径的调控因素复杂, 伴随参与催化
代谢的功能基因较多的问题, 不能仅仅根据单个
功能基因的表达模式独立分析红肉猕猴桃呈色机
理, 必须综合分析整个途径的相关基因表达模式,
因此, 需要进一步分离花青素途径中的其他功能
基因, 并对 DFR 蛋白开展深入的功能验证, 才有
可能解决着色稳定性的机制问题。
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(责任编辑：张 平)