全 文 ：武汉植物学研究 2002, 20 (5) : 325～ 328
J ourna l of W uhan B otan ica l Resea rch
红莲型水稻不育系统花粉发育不同时期
M AD S-box 基因家族的表达分析Ξ
孙清萍　 汪　莉　 易　平　 朱英国ΞΞ
(武汉大学植物发育生物学教育部重点实验室, 武汉　430072)
摘　要: 以红莲型水稻不育系、保持系、恢复系和杂种为材料, 根据M AD S2box 的保守序列设计特异引物, 并分别
以O ligo dT 12GC 和O ligo dT 12CG 为锚定引物对花粉发育单核期和二核期的花药进行了差异展示分析。扩增共得
到 382 条带, 其中有组成型表达带 22×8= 176 条。对差异带的统计分析表明:M AD S2box 基因家族参与了水稻
CM S 和育性恢复的核质互作。最后, 对这些差异带与 CM S 和育性恢复之间的关系以及特异引物在研究复杂生物
学现象中的应用进行了讨论。
关键词: 水稻; 细胞质雄性不育; 育性恢复; M AD S2box 基因家族; 差异展示
中图分类号: Q 344. 4　　　　　文献标识码: A 　　　　　文章编号: 10002470X (2002) 0520325204
Express ion Ana lys is of M AD S-box Gene Fam ily on Un i-nuclea te and
B i-nuclea te Stage An thers on HL -CM S System
SUN Q ing2P ing, W AN G L i, Y I P ing, ZHU Y ing2Guo
(T he K ey L abora tory of M O E f or P lan t D evelopm en ta l B iology and Institu te of Genetics, Colleg e of L if e
S ciences, W uhan U niversity , W uhan　430072, Ch ina)
Abstract: T h is study analysised the differences of gene exp ression among the un i2 and b i2 nucle2
ate stage an thers of the HL 2CM S system w ith the m ethod of differen t ia l d isp lay. 382 b inds w ere
detected in all samp les w ith the specif ic M AD S2box p rim er and O ligo dT 12GC and O ligo dT 12CG
as ancho r p rim ers respect ively. 4611% (22×8 = 176 b inds) of w h ich exp ressed con st itu t ively
among all the samp les. T he sta t ist ica l analysis of the po lymo rph ism b inds show ed that the
M AD S2box genes took an impo rtan t ro le in the cytop lasm and nuclear in teract ion of CM S and fer2
t ility resto ra t ion in rice. A t the last, th is paper has discu ssed the rela t ion sh ip betw een the diversi2
ty b inds and CM S and sterility resto ra t ion. T he app lica t ion of d ifferen t ia l d isp lay u sing specif ic
p rim er in comp lica ted b io logica l phenom ena is a lso discu ssed.
Key words: O ry z a sa tiva L ; Cytop lasm ic m ale sterility; Fert ility resto ra t ion; M AD S2box gene
fam ily; D ifferen t ia l d isp lay
　　M AD S2box 是一类动植物中非常重要的调节
基因家族, 它编码一类具有共同序列的蛋白转录因
子。这些转录因子通过其保守结构域与特定的DNA
序列结合来调控基因的表达。这些DNA 序列不仅
可以是一般的结构基因, 而且也可以是M AD S2box
基因家族本身[1 ]。当蛋白转录因子与M AD S2box 基
因家族本身结合, 它可以通过调节其它M AD S2box
基因的表达从而调控动植物的生长和发育, 所以ΞΞΞ 通讯作者。收稿日期: 2002202205, 修回日期: 2002204222。基金项目: 国家自然科学基金资助项目 (30170568)。　作者简介: 孙清萍 (1977- ) , 男, 在读硕士研究生, 现从事植物发育遗传学研究。
M AD S2box 基因家族和它们所编码的蛋白转录因
子一起行使调控表达的功能。研究表明, 被子植物的
大部分M AD S2box 基因参与花发育的调控[2 ] , 而且
在植物花发育分子机制的ABC 模型中的大多数花
发育相关功能基因属于M AD S2box 基因家族[3, 4 ]。
可见,M AD S2box 基因家族对高等植物花的发育有
着非常重大的意义。植物细胞质雄性不育是杂种优
势利用的基础, 对此现象机理的了解将有助于对杂
种优势的利用, 在应用上有着重大的意义。国内外研
究表明, 造成不育的主要原因在线粒体上, 而育性恢
复是核质互作的表达结果[5 7 ]。红莲型细胞质雄性
不育是本实验室发现的一类新的不育类型, 在细胞
学上其败育发生在二核早期。鉴于M AD S2box 基因
家族在植物花发育中所起的重要作用,M AD S2box
基因家族与雄性不育及育性恢复可能有关。笔者根
据M AD S2box 基因家族的保守区域设计特异引物,
对红莲型水稻细胞质雄性不育系统 4 个材料的单核
期和二核期的花药进行了差异展示分析, 以期了解
M AD S2box 基因家族在水稻细胞质雄性不育及育
性恢复中可能起到的作用。
1　材料与方法
1. 1　水稻花药总 RNA 的提取
以水稻红莲型细胞质雄性不育系统 YTA、
YTB、9311 (R ) 和红莲二号 (F 1) 为材料, 以花药镜检
为基础, 结合植株外部形态特征分别选取 4 个材料
的单核期和二核期的幼穗, 于 4℃冷库中剥取穗子
中部的花药, 用 T rizo l R eagen t 并按其说明提取花
药总 RNA , RNA 经甲醛电泳检测合格后于- 70℃
贮存。
1. 2　反转录及特异引物 PCR
锚定引物O ligo dT 12- 18购自 P rom ega 公司。反
转录酶为 Gibco 公司的 Su rperscrip t RN ase H - ,
反转录按反转录酶的产品说明书进行。PCR 反应
时 , 分 别 以O ligo dT 12 GC 和O ligo dT 12 CG 作 为
锚 定 引 物 , 特 异 引 物 按 文 献 [ 8 ] 设 计 为
5’ CAA GA GCA TCGA GAA 3’, 由武汉金贝公司合
成。PCR 反应体系为: 总体积 25 ΛL , 其中 T aq DNA
聚合酶 110 U ,M gC l2 115 mmo löL , 10×扩增缓冲
液 215 ΛL , 200 Λmo löL dN T P s, 1 ΛL DM SO , 1 ΛL
反转录产物, 特异引物和锚定引物各 012 Λmo löL。
PCR 程序为: 94℃ 5 m in; 94℃ 1 m in, 48℃ 1 m in,
72℃ 1 m in, 35 个循环; 72℃延伸 10 m in; 4℃保
存。 PCR 反 应 于 Perk in E lm er DNA T herm al
Cycler 480 扩增仪上进行。
1. 3　PAGE 电泳、银染、差异带的回收及克隆
PCR 产物于 5% 变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分
离, 以 P rom ega 公司的 Silver Sequence DNA Se2
quencing System 银染显带并照相记录实验结果。差
异条带用无菌刀片直接从凝胶中挖出后在沸水中煮
5 m in, 离心, 取上清 4 ΛL 按相同的条件再扩增差异
片断, 回收后连接到 P rom ega 公司的 pGEM 2T
Easy V ecto r 上, 并转化DH 5Α菌株。
1. 4　Northern 杂交分析
采用 P rom ega 公司的 P rim e2a2Gene L abeling
System 标记探针, N o rthern 杂交分析参照 Sam 2
b rook 进行, 用变性 PCR M arker 指示分子量大小。
2　结果与分析
2. 1　变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
电泳银染结果 (图 1) 表明,M AD S2box 基因家
族在水稻花粉发育两个时期均丰富表达, 且样品间
存在较丰富的多态性。8 个样品共扩增得到 382 条
带, 平均每个样品每个时期约有 24 条表达带。由于
锚定引物是O ligo (dT ) 12加两个选择碱基, 它所揭示
的信息是总信息的 1ö12, 如果不考虑mRNA 的不
同剪接等, 推算每个样品约有 280 个M AD S2box 基
因表达。与植物中其它的基因家族相比[9 ] ,M AD S2
box 是个很大的基因家族。另一方面, 在花粉发育两
个时期的丰富表达也暗示了M AD S2box 基因家族
在水稻花粉发育中起着重要的作用。在 382 条带中
组成型表达带 22×12= 176 条 (图 1 中箭头Ë 所
指) , 占总数的 4611%。这些带代表的M AD S2box
基因在水稻花粉发育的过程中可能行使着一些基本
调控功能。
样品间的差异很丰富, 我们把在材料上表现出
差异的带进行分类并归纳为表 1 和表 2。表 1 所示
为单个材料特异带的统计结果 (包括材料特异表达
的带和材料特异表达缺失的带)。从表 1 可以看出,
每个材料都有自己特异的带, 所有材料共有 48 条特
异带, 占总带数的 1216% 。差异丰富的原因可能是
由M AD S2box 调控方式的灵活与多样造成的[2 ]。A
和B 的细胞核相同, 但细胞质不同, A 和B 之间表
现出的差异说明不同的细胞质对M AD S2box 基因
的表达有显著的影响。F 是A 和R 的杂种, F 特异
的带可能与杂种优势和育性恢复有关。
表 2 所示为共有材料特异带的统计结果。共有
材料特异带是指在某个时期, 2 个材料中有表达, 而
623 武 汉 植 物 学 研 究　 　　　　　　　　　　　　　　　　第 20 卷　
1. YTA 单核期; 2. YTB 单核期; 3. 9311单核期; 4. 红莲二号单核期; 5. YTA 二核期; 6. YTB 二核期; 7. 9311二核
期; 8. 红莲二号二核期; M. pGEM 27Zf (+ )DNA öH ae Ë M arker
1. U ni2nucleate stage an thers of YTA ; 2. U ni2nucleate stage an thers of YTB; 3. U ni2nucleate stage an thers of
9311; 4. U ni2nucleate stage an thers of Honglian22; 5. B i2nucleate stage an thers of YTA ; 6. B i2nucleate stage an2
thers of YTB; 7. B i2nucleate stage an thers of 9311; 8. B i2nucleate stage an thers of Honglian22; M. pGEM 27Zf (+ )
DNA öH ae Ë M arker
图 1　红莲不育系统 2 个时期花药M AD S-box 特异引物差异展示图谱
F ig. 1　Patterns of disp layed cDNA from differen t stage an thers of the HL 2CM S system of
rice using M AD S2box specific p rim er
表 1　M AD S-box基因家族单个材料间的差异
T able 1　D ifference of specia l exp ression in single
m ateria l of M AD S2box gene fam ily
时期
Stage
O ligo　dT 12GC
A B R F
O ligo　dT 12CG
A B R F
单核
U ni2nucleate 1 0 2 2 4 4 2 5
二核
B i2nucleate 3 5 4 2 6 4 3 1
表 2　M AD S-box 基因家族共表达差异
T able 2　Co2exp ression difference of
M AD S2box gene fam ily
时期
Stage
O ligo　dT 12GC
AB A R A F BR BF RF
O ligo　dT 12CG
AB A R A F BR BF RF
单核
U ni2nucleate 2 0 4 4 1 5 5 0 3 0 0 0
二核
B i2nucleate 2 0 5 0 2 3 3 0 2 0 1 2
在另外 2 个材料中没有表达的特异带。如A 和 F 共
有的特异带是指在A 和 F 有表达, 而在R 和B 是没
有表达的带。A 和 F 的细胞质相同, 它们的共有特
异带较多, 共 14 条。虽然A 和B 的细胞核是相同
的, 但B 和A 及 F 的细胞质却不同, B 和 F 间的共
有特异带 (4 条)明显比A 和 F 的共有特异带少。这
再次表明不同的细胞质对细胞核内M AD S2box 基
因的表达影响显著。表中A R 和BR 的共有特异带
栏内几乎都是 0, 这是因为A R 之间以及BR 之间无
论在细胞核或是细胞质上都没有什么联系, 理论上
它们不应该有共有特异带。这也从侧面证明了我们
试验结果的可靠性。
我们也按时期的不同将差异带进行了分类统计
(数据未列出) 和分析, 但结果没有发现在各个材料
间一致而在时期上却不一致的时期特异带。将材料
和时期结合起来进行分析时, 可以发现一些有规律
的差异带。如A 和B 在单核期共同缺失一条带 (如
图 1 箭头Ê 所示) , 而这条带在A 和B 的二核期以
及R 和 F 的所有时期都表达。这些带以及在材料上
表现出差异的那些带都已回收, 进一步的研究正在
进行之中。
2. 2　Northern 杂交
选取 A 和 B 间共有特异表达的分子量约
150 bp的差异片段 (图 1 照片中箭头É 所指)AB 1 作
N o rthern 杂交分析, 结果显示 (图 2) , AB 1 在粤泰
A、粤泰B 中具有大小 (约 115 kb)一致的杂交带, 而
在恢复系R 及 F 杂种中没有杂交信号, 和差异展示
723　第 5 期　　　　　孙清萍等: 红莲型水稻不育系统花粉发育不同时期M AD S2box 基因家族的表达分析
的结果相吻合。差异片段AB 1 的真实性得到N o rth2
ern 杂交的验证, 也说明高退火温度的特异引物的
R T 2PCR 反应可靠性较高。
1. YTA 单核期; 2. YTA 二核期; 3. YTB单核期; 4. YTB
二核期; 5. 9311单核期; 6. 9311二核期; 7. 红莲二号单核
期; 8. 红莲二号二核期
1. U ni2nucleate stage an thers of YTA ; 2. B i2nucleate
stage an thers of YTA ; 3. U ni2nucleate stage an thers of
YTB; 4. B i2nucleate stage an thers of YTB; 5. U ni2
nucleate stage an thers of 9311; 6. B i2nucleate stage an2
thers of 9311; 7. U ni2nucleate stage an thers of Honglian2
2; 8. B i2nucleate stage an thers of Honglian22
图 2　AB1 和 18s rD NA 的 Northern 杂交分析
F ig. 2　N o rthern b lo t analysis of AB 1 and 18s rDNA
3　讨论
M AD S2box 基因家族首先在酵母中发现[1 ] , 随
后在小鼠、人、拟南芥等中发现也有其表达。高等植
物中M AD S2box 主要在花器官原基分化期表达[3 ] ,
但近年来的研究表明,M AD S2box 在植物其它部位
也有表达[11, 12 ] , 且某些M AD S2box 在烟草花粉发育
的全过程中持续表达[13 ]。本研究表明M AD S2box
在水稻花粉发育的单核期和二核期都有表达, 说明
M AD S2box 在水稻中不仅仅局限于控制花器官原
基的分化, 其功能是丰富的。
A 和B 同核异质, A 和 F 同质异核, A 的特异
带可能与水稻CM S 相关。表 1 中A 在二核期表现
出较多的差异带也和前人细胞学的研究结果红莲型
水稻不育发生在二核期相符[10 ]。另外, B 的差异带
和A 的差异带相比, 由于B 只与A 同核, 而细胞质
同和其它的材料没有关系, 所以B 的差异带应该比
A 的多, 然而, 试验结果与此相反 (见表 1)。对此我
们认为其原因可能是: 在A、B、R、F 中只有A 的花
粉是不育的, 此生理现象中代谢的不正常诱导了细
胞内一系列特异的应答, 最终表现为A 特异带的增
多。因此我们推测,A 的特异带大部分是不育的“结
果”, 而不是不育的“原因”。
红莲型水稻细胞质上的缺陷可以导致花粉绒毡
层细胞畸形增生, 形成绒毡层周缘质团, 进而导致花
粉败育[14 ] , 但核内的恢复基因的表达却能弥补细胞
质上的缺陷, 恢复花粉的育性。M AD S2box 表达明
显受到细胞质影响的试验结果暗示M AD S2box 可
能参与了红莲型水稻CM S 和育性恢复的核质互作
的过程, 对M AD S2box 基因家族的深入研究, 将有
助于对水稻CM S 及育性恢复机理的深入了解。
高退火温度的特异引物差异展示与随机引物差
异展示相比具有较高的可靠性, 而且其揭示的遗传
信息也不是“随机”的。利用以基因家族保守序列为
基础的特异引物展示能很快地了解基因家族在复杂
生物学现象中的表达与功能, 如借助基因芯片等技
术对回收的差异带进行进一步的研究将有助于对所
研究问题的了解。
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