全 文 ：武汉植物学研究 2003, 21 (4) : 301～ 307
J ourna l of W uhan B otan ica l Resea rch
高温和红光诱导的鱼腥藻 7120 短藻丝体中
TNF-Α基因表达效率的提高Ξ
欧阳叶新1, 2, 3, 施定基1, 钟 晖4, 梁承邺2, 李振甲4, 胡鸿钧3
(1. 中国科学院植物研究所, 北京　100093; 2. 中国科学院华南植物研究所, 广州　510650;
3. 中国科学院武汉植物研究所ö武汉植物园, 武汉　430074; 4. 中国人民解放军总医院, 北京　100853)
摘　要: 目前解决外源基因在蓝藻中低效表达的主要策略是改进供体DNA 元件。这项工作尝试改变受体系统生
理状态, 研究对外源基因表达效率的影响。以前已经报道用高温 (45℃) 和红光处理鱼腥藻 7120 (A nabaena sp.
PCC7120) 可以诱导其形成短藻丝体, 这里报道以此作为受体细胞, 将构建的含重组人肿瘤坏死因子 Α(TN F2Α) 基
因的穿梭表达载体 pKT 2TN F 通过三亲接合转移法进行转化。红光和高温诱导形成的短藻丝体中, TN F2Α基因接
合转移效率为在正常营养藻丝中的 5～ 6 倍, Sou thern 杂交结果证明 pKT 2TN F 已在受体细胞中复制。W estern 印
迹表明 TN F2Α基因已在受体系统中表达, 放射免疫测定结果显示在短藻丝体中的表达效率提高到在正常营养藻
丝中的 4～ 5 倍。这可能为提高外源基因在丝状蓝藻中的表达效率提供了一条新途径。此外, 研究还分析了人 TN F2Α基因密码子使用偏向性对在鱼腥藻 7120 中表达效率的影响。
关键词: 人肿瘤坏死因子 Α基因; 红光; 高温; 接合转移效率; 表达效率; 鱼腥藻 7120
中图分类号: Q 949. 22　　　　　文献标识码: A 　　　　　文章编号: 10002470X (2003) 0420301207
Eleva ting Express ion of Human Tum or Necros is Factor A lpha Gene in
A nabaena sp. PCC7120 Short F ilam en ts Induced by H igh
Tem pera ture and Red L ight
OU YAN G Ye2X in1, 2, 3, SH ID ing2J i1, ZHON G H u i4, L IAN G Cheng2Ye2,
L I Zhen2J ia4, HU Hong2Jun3
(1. Institu te of B otany , T he Ch inese A cad emy of S ciences, Beijing　100093, Ch ina;
2. S ou th Ch ina Institu te of B otany , T he Ch inese A cad emy of S ciences, Guangzhou　510650, Ch ina;
3. W uhan B otan ica l Gard enöW uhan Institu te of B otany , T he Ch inese A cad emy of S ciences, W uhan　430074, Ch ina;
4. T he Genera l H osp ita l of Ch inese P eop le L ibera tion A rmy , Beijing　100853, Ch ina)
Abstract: T he stra teg ies fo r imp roving the exp ression eff iciency of fo reign genes in cyanobacteria l
ho sts are, so far, focu sing on modifying dono r DNA elem en ts. T h is w o rk described here w as an at2
temp t to physio logica lly change ho st system s and see how they affected the exp ression eff iciency
of fo reign genes in cyanobacteria. O u r p reviou s w o rk p resen ted that f ilam en tou s cyanobacterium
A nabaena sp. PCC7120 cells induced by h igh temperatu re and red ligh t can genera te sho rt f ila2
m en ts (S2H T and S2RL , respect ively) w ith pho to syn thet ic act ivit ies that has the ab ility to no r2
m ally differen t ia te in to vegetab le filam en ts. W e tran sferred here a fo reign gene (hum an tumo rΞ 收稿日期: 2002211227, 修回日期: 2003201224。基金项目: 国家海洋 863 项目资助 (819204211) ; 中国科学院武汉植物研究所所长基金支持。作者简介: 欧阳叶新 (1965- ) , 男, 博士。主要从事遗传学和藻类分子生物学研究。现通讯地址: D ep t. of B io logy &M icrob io logy,U niversity of W isconsin, O shko sh 54901 U SA.本工作主要在中国科学院植物研究所光合作用中心完成。
necro sis facto r2Α, hTN F2Α) in to these sho rt f ilam en ts. A shu t t le exp ression vecto r pKT 2TN F har2
bo ring hum an TN F2Αgene w as con structed and tran scon jugated in to the cells of S2H T , S2RL and
the no rm al vegeta t ive filam en ts (con tro l) by triparen ta l con jugal m at ing, respect ively. T he data
show ed that the tran scon jugat ive eff iciencies of pKT 2TN F s in the S2H T and S2RL w ere 500% -
600% of tho se in the con tro l cells. T he Sou thern b lo t t ing confirm ed TN F2Αgene w as rep lica ted in
tran scon jugat ive cells of S2H T , S2R T and con tro l. T he W estern b lo t t ing suggested that pKT 2
TN F s w ere exp ressed in these cells. T he radio imm unoassay (R IA ) show ed exp ression eff iciency
of pKT 2TN F s in the S2H T and S2RL cells w ere abou t 400% - 500% of tho se in the con tro l cells.
T h is m igh t p rovide a novel po ten t ia l avenue to imp rove the exp ression eff iciency of fo reign genes
in filam en tou s cynobacteria. In addit ion,w e also analyzed the effect of genet ic code b ias of hum an
TN F2Αgene on its exp ression in A nabaena sp. PCC7120.
Key words: hTN F2Αgene; R ed ligh t; H igh temperatu re; T ran scon jugat ive eff iciency; Exp ression
eff iciency; A nabaena sp. PCC7120
　　迄今, 外源基因已经在一些模式蓝藻中表达成
功[1 ] , 为利用转基因蓝藻进行生物防治[2 4 ]、解决环
境污染问题[5 8 ]和制备基因工程药物[9, 10 ]等带来了
广阔前景。然而, 外源基因在蓝藻中表达效率不高,
限制了蓝藻基因工程在实际中的应用。真核基因在
原核的光合蓝藻中的转化和表达与多种因素有关,
为提高外源基因在蓝藻中的转化和表达效率, 通常
多采用改进供体DNA 元件[3, 4, 7 9, 11 ] , 但很少有涉及
改善受体细胞本身的报道[12 ]。
人肿瘤坏死因子是迄今发现能直接杀死肿瘤细
胞的一类细胞因子, 有希望发展成为新的抗癌药物。
丝状蓝藻鱼腥藻 7120 (A nabaena sp. PCC7120)是一
类多细胞原核生物, 其细胞之间排列紧密, 细胞外被
胶质鞘[13 ]。我们推测外源基因在鱼腥藻 7120 中的
转化和表达除与供体DNA 相关外, 可能也与其不
同生理状态有关。为了验证其可能性, 我们尝试改变
鱼腥藻 7120 生理状态检测是否能改善外源基因转
化和表达。光和温度是蓝藻较为敏感的外界环境因
子, 红光和高温诱导可引起蓝藻的结构和生理变
化[14 ]。我们以前曾报道高温 (45℃)和红光可以诱导
鱼腥藻 7120 形成具有光合特性的短藻丝体[15 ] , 本
研究报导以这些短藻丝体作为外源基因转化的受
体, 一定程度上提高了外源基因的转化和表达效率,
这可能为外源基因在其它蓝藻中的转化和表达效率
提供借鉴, 也可能成为改善外源基因在丝状蓝藻中
表达效率的新途径。
1　材料和方法
1. 1　材料
1. 1. 1　蓝藻品系、大肠杆菌和质粒　丝状蓝藻鱼腥
藻 7120 野生型 (A nabaena sp. PCC7120) 来自法国
巴斯德研究所; E. coli HB 101 由中国科学院植物研
究所光合作用实验室保存; 质粒 pKT 210、pRL 528
(辅助质粒)和R P 4 (接合质粒) 由美国密执安州立大
学国家植物学实验室W o lk CP 教授赠送, pRL 2TC
(含 TN F2Α基因) 由中国科学院植物研究所光合作
用实验室构建[10 ]。
1. 1. 2　培养基和培养条件　E. coli 于 LB (L u ria
Bertan i) 培养基中 37℃振荡培养。丝状蓝藻鱼腥藻
7120 采用BG211 (无氮) 培养基[13 ] , 置于 Gallekam 2
pe光照控温旋转培养箱中培养, 转速为120 röm in,
培 养 温 度 ( 28 ± 2 )℃, 光 照 强 度 约 为
80 Λmo lõm - 2õs- 1。实验所用抗生素浓度如下: 氨卞
青霉素 (Amp ) , 50 ΛgömL ; 链霉素 (Sm ) , 25 ΛgömL ;
四环素 (T c) , 15 ΛgömL ; 氯霉素 (Cm ) , 85 ΛgömL ;
卡那霉素 (Km ) , 25 ΛgömL。
1. 1. 3　试剂　各种限制性内切酶和 T 4 DNA 连接
酶分别购自Boeh ringer 公司和 P rom ega 公司, 抗生
素为 Sigm a 公司分装产品, 放射性同位素标记系统
(P rim e2a2gene○R L abelling system )购自 P rom ega 公
司, 尼龙膜为M illipo re 公司产品。
1. 2　方法
1. 2. 1　高温和红光诱导鱼腥藻7120形成短藻丝体　
参照文献[ 12, 15 ], 在红光强度为 10 Λmo lõm - 2õ s- 1
下处理 24 h; 高温处理选用 45℃, 其他条件同正常培
养条件。短藻丝体(长度约 3～ 20 个细胞)通过差速离
心而纯化, 以此作为外源基因转化受体。正常细胞及短
藻丝体细胞数均采用血细胞计数法进行计数。
1. 2. 2　D NA 操作方法　大肠杆菌感受态细胞的制
备及质粒DNA 的制备、酶切、连接、转化等均参照
203 武 汉 植 物 学 研 究　 　　　　　　　　　　　　　　　　第 21 卷　
Sam b rook 等[16 ]的方法。
1. 2. 3　细菌与蓝藻的接合转移及筛选　参照 E lhai
和W o lk [17 ]的方法, 以 pRL 528 为辅助质粒。
1. 2. 4　蓝藻质粒的抽提　参照 Engw all 和 Gen2
del[18 ]的方法。
1. 2. 5　Southern 杂交鉴定　按L iu 等[10 ]的方法进
行。
1. 2. 6　SD S-PAGE和W estern印迹鉴定　离心收集对
数生长中期的蓝藻细胞, 经洗涤后重悬于011 mo löL
T ris2HC l (pH 810, 0120 mmo löL D T T ) , 冰水浴中超
声波破碎细胞(光学显微镜下镜检细胞破碎程度) , 4℃
离心后取上清液, 加入SD S2PA GE 上样缓冲液, 沸水
浴 1 m in, 进行SD S2PA GE (5% 浓缩胶, 12% 分离
胶) , 恒压90 V、215 h后在4℃下进行膜转移 (上限
20 V , 30 mA ) 16 h, 再进行单克隆抗体杂交及显色
反应, 参照L iu等[10 ]的方法进行。
1. 2. 7　放射性免疫分析 (R IA ) 　离心收集细胞培
养物, 超声波破碎细胞后离心取上清。测试时做不同
浓度梯度稀释。采用中国人民解放军总医院生产的
TN F2Α作为标准 TN F 用于 R IA k it 检测。标准
TN F 用125 I标定, 测定的有关参数及标准曲线和样
品浓度均预先编制程序 (详细操作见试剂盒说明)。
通过液相竞争法, 在自动 Χ计数器上测定放射活性,
可溶性蛋白质含量测定参照文献[ 19 ]。
1. 2. 8　人 TNF-Α基因密码子偏向性分析　将人
TN F2Α基因序列中的密码子与鱼腥藻 7120 的常用
密码子表进行比较, 由北京大学生命科学学院赵进
东教授帮助分析。
2　结果和分析
2. 1　穿梭表达载体 pKT-TNF 的构建
构建过程见图 1。载体 pKT 210 是由广宿主质
粒R SF1010 衍生而来, 能在 E. coli 和多种蓝藻中复
制[20 ] , 质粒 pRL 2TC 中含有从人的基因文库中克隆
的重组 TN F2Α cDNA 片段[10 ] , 并克隆到来源于
A m a ra tan hy brid 叶绿体强启动子Pp sbA 下游。质粒
pKT 210 和 pRL 2TC 均采用 P st I 和 EcoR I 双酶切,
前者得到含 R SF1010 和 Sm 抗性标记 (约814 kb)
的片段, 后者得到带启动子的目的基因 TN F2Α
cDNA (约 800 bp ) 的片段。经 T 4 DNA 连接酶连接
后, 分别在含 Cm (85 ΛgömL ) 和 Sm (25 ΛgömL ) 的
LB 平板上, 筛选仅抗 Sm 而不抗 Cm 的重组转化
子, 酶切鉴定证实其重组转化子 pKT 2TN F 含有约
800 bp 的目的基因 TN F2ΑcDNA 片段 (图 2)。
图 1　穿梭表达载体 pKT-TNF 的构建
F ig. 1　T he construction of the shu tt le exp ression
vecto r pKT 2TN F
M. ΚDNA digested w ith EcoR I; 1. pRL 2TC digested w ith
EcoR I; 2. pRL 2TC digested w ith EcoR I and P st I;
3. pKT 2TN F digested w ith EcoR I and P st I; 4. pKT 2TN F
digested w ith EcoR I
图 2　穿梭表达载体 pKT-TNF 的酶切凝胶电泳图谱
F ig. 2　E lectropho resis of the shu tt le exp ression
vecto r pKT 2TN F digested w ith various
restrict ion endonucleases
2. 2　鱼腥藻 7120 的接合转移
用红 光 和 高 温 ( 45℃) 诱 导 A nabaena sp.
PCC7120 所形成的短藻丝体 (分别简称为 S2RL 和
303　第 4 期　　　　　　欧阳叶新等: 高温和红光诱导的鱼腥藻 7120 短藻丝体中 TN F2Α基因表达效率的提高
S2H T ) 作为受体细胞, 将含目的基因的穿梭表达载
体 pKT 2TN F, 通过三亲接合转移方法转化上述短
藻丝体后用 Sm 筛选, 得到阳性转化子, 并计算接合
转移效率。结果表明: 无论转基因宿主是正常营养藻
丝体细胞 (对照) , 还是 S2RL 和 S2H T , 都显示出相 同的规律, 即藻菌混合比例不同, 转化效率差别较大, 其中以藻菌比为 1∶10 时, 接合转移的转化效率最高 (见表 1)。另外, 红光和高温诱导鱼腥藻 7120形成的短藻丝体细胞 (S2RL , S2H T ) 与对照的转化效率相比, 分别提高了近 4～ 5 倍。
表 1　红光和高温对 pKT 2TN F 在鱼腥藻 7120 中转化效率的影响3
T able 1　Effects of red ligh t and h igh temperatu re (45℃) on the transcon jugative efficiency of
pKT 2TN F in A nabaena sp. PCC71203
R atio of
Cyanobacterium∶Bacterium
T ranscon jugative efficiencies (×10- 5)
Contro l S2RL S2H T
1∶10 1. 19±0. 15 (100% ) 7. 08±0. 21 (595% ) 5. 73±0. 16 (482% )
1∶1 0. 69±0. 12 (100% ) 2. 12±0. 19 (307% ) 2. 06±0. 15 (299% )
10∶1 0. 34±0. 11 (100% ) 0. 87±0. 11 (260% ) 0. 83±0. 21 (240% )3 T ranscon jugative efficiency = T he num ber of transcon jugan tsöthe to ta l cell num ber. Contro l. N o rm al
vegetat ive cells; S2RL. Sho rt filam ents induced by red ligh t; S2H T. Sho rt filam ents induced by h igh
temperatu re
2. 3　Southern 印迹鉴定
图 3 显示的是 Sou thern 印迹鉴定结果, 含有人
TN F2Α基因的质粒 pRL 2TC 和 pKT 2TN F 均表现
出明显的印迹信号带, 说明人 TN F2Α基因可以通过
接合转移方法转入鱼腥藻 7120 的短藻丝体中。由此
可以证实: 含目的基因的穿梭表达质粒 pKT 2TN F
在不同处理的鱼腥藻 7120 宿主细胞中接合转移后
已复制。由于上样量基本相同, 在质粒 pRL 2TC 中
的印迹信号比 pKT 2TN F 强, 说明前者的含量高, 这
似乎与 pRL 2TC 属于高拷贝质粒结果一致。因此,
1. pRL 2TC (from E. coli HB 101) digested w ith EcoR I
and BamH I; 2. pKT 210 (E. coli HB 101) digested w ith
EcoR I; 3. pKT 2TN F ( from transgen ic A nabaena sp.
PCC7120 in no rm al vegetat ive cells) digested w ith EcoR I
and P st I; 4. pKT 2TN F (from transgen ic A . PCC7120 in
S2RL ) digested w ith EcoR I and P st I; 5. pKT 2TN F (from
transgen ic A . PCC7120 in S2H T ) digested w ith EcoR I
and P st I
图 3　转 TNF-Α基因鱼腥藻 7120 的 Southern 印迹鉴定
F ig. 3　Southern b lo tt ing pattern of transgen ic
A nabaena sp. PCC7120 obtained using EcoR I2BamH I
hTN F fragm ent from pRL 2TC as the p robe
供体DNA 的选择, 特别是质粒DNA 的拷贝数直接
影响了外源基因在宿主中的表达效率, 这支持了目
前所得到的结论[7 9, 11 ]。
2. 4　SD S-PAGE 和W estern 印迹鉴定
如图 4: a 结果显示, 转基因藻鱼腥藻 7120
(Con tro l, S2RL 和 S2H T )中明显比野生型中多出一
条约 17KD 的特异表达蛋白带, 其分子量大小和位
置与 TN F2Α的单体分子量一致。用抗人 TN F2Α单
M. W eigh t m ass standard of p ro tein (KD a) ; 1. W ild type
of A nabaena sp. PCC7120; 2. Contro l ( transgen ic A .
PCC7120 in no rm al vegetat ive cells) ; 3. S2RL (transgen ic
A . PCC7120 in S2RL ) ; 4. S2H T ( transgen ic A . PCC7120
in S2H T )
图 4　转 TNF-Α基因鱼腥藻 7120 的 SD S-PAGE (a)和
W estern 印迹 (b)
F ig. 4　SD S2PA GE (a) and w estern b lo tt ing (b) of
transgen ic A nabaena sp. PCC7120
403 武 汉 植 物 学 研 究　 　　　　　　　　　　　　　　　　第 21 卷　
克隆抗体 (辣根过氧化物酶标记) 进行W estern 杂
交分析 (如图 4: b 所示) , 结果表明各种转基因藻鱼
腥藻 7120 细胞中的特异表达蛋白具有和 TN F2Α单
克隆抗体结合的抗原性, 这证明所构建的穿梭表达
载体质粒 pKT 2TN F 在不同处理的鱼腥藻 7120 细
胞 (Con tro l, S2RL 和 S2H T )中表达了 TN F2Α。
2. 5　放射性免疫分析
放射免疫分析方法是目前普遍采用的对 TN F2Α含量进行较为精确定量的一种方法, 我们采用此
法对转 TN F2Α基因鱼腥藻 7120 中表达的 TN F2Α
进行定量。经多次放射免疫分析测定, 确证了 TN F2Α基因在鱼腥藻 7120 中的稳定表达, 结果见表 2。从
中可看出, 经红光或高温诱导的短藻丝体作为受体
得到的转基因鱼腥藻 7120 细胞中外源基因的表达
效率比正常营养藻丝体中的提高了 3～ 4 倍。
表 2　红光和高温对 TN F2Α基因在鱼腥藻 7120 中
表达效率的影响
T able 2　Effects of red ligh t and h igh temperatu re
(45℃) on the exp ression efficiencies of TN F2Α
gene in A nabaena sp. PCC7120
R ecip ien t cells3 Conten ts of TN F2Α(Λgöm g so lub le to ta l p ro tein)
W T 0
Contro l 1. 55±0. 26 (100% )
S2RL 7. 52±0. 43 (485% )
S2H T 6. 29±0. 36 (406% )3 W T. W ild type of A . PCC7120; Contro l. T ransgen ic
A . PCC7120 in no rm al vegetat ive cells; S2RL. T rans2
gen ic A . PCC7120 in S2RL ; S2H T. T ransgen ic A .
PCC7120 in S2H T.
2. 6　密码子偏向性对外源基因表达的影响
将人TN F2Α基因 (cDNA ) 序列密码子使用情况
与鱼腥藻7120常用密码子使用情况进行比较 (图5)。
A、B 和C 代表 TN F2ΑcDNA 链推测的 3 种不同的读码框
A ,B and C rep resen t the TN F2ΑcDNA strand w ith
th ree pu tat ive differen t k inds of open reading fram e
图 5　遗传密码偏向性对人 TNF-Α基因鱼腥藻 7120 中表达的影响
F ig. 5　T he effect of genetic code b ias of hum an TN F2Α
gene on its exp ression in A nabaena sp. PCC7120
其中, A , B 和 C 分别代表 TN F2Α基因编码链的 3
种读码方式 (纵轴代表密码子使用频率相似程度, 横
轴代表碱基所处位置) 。显然, 只有图A 这种读码方
式是正确的转录方式, 其间没有转录终止的现象。另
外还可以看出: 人 TN F2Α基因 (cDNA ) 序列的第
100～ 250 bp 间的密码子与鱼腥藻 7120 密码子存
在较大偏向性, 这可能是影响人 TN F2Α基因在鱼腥
藻 7120 表达的主要原因。尽管如此, TN F2Α基因在 鱼腥藻 7120 仍能进行有效的表达, 这为利用鱼腥藻7120 产业化生产人 TN F2Α药物提供了可能性。3　讨论3. 1　蓝藻生物反应器的特点证明了其广阔的应用潜力利用植物、动物作为生物反应器生产基因工程产品已有大量报道[21, 22 ]。蓝藻作为生物反应器与之
503　第 4 期　　　　　　欧阳叶新等: 高温和红光诱导的鱼腥藻 7120 短藻丝体中 TN F2Α基因表达效率的提高
相比较的优势在于其培养简便、生长迅速, 生物量
大, 因而成本低廉; 尽管外源基因在蓝藻中的表达效
率比在大肠杆菌中表达效率低[10 ] , 但却不象在大肠
杆菌中那样形成包涵体, 因此无需进行复杂的变性
和复性处理, 大大简化了下游工程[10 ]; 同时, 多数蓝
藻中无内毒素, 并且有些还含有许多有益的营养成
分和一些具有药用价值的物质[23 ]。因此, 如果提高
外源基因在蓝藻中的表达效率, 以转基因蓝藻作为
一种新型的生物反应器制备口服的基因工程药物具
有大肠杆菌、植物和动物等生物反应器无法比拟的
优势, 因而具有广阔的应用前景。本文的研究正是对
提高外源基因在蓝藻中的转化和表达效率的有益尝
试。
3. 2　鱼腥藻 7120 密码子使用偏向性与 hTNF-Α表
达分析证明对受体系统改造仍具潜力
本研究采用的人 TN F2Α基因是从人 cDNA 文
库克隆而来, 其中部分片段由人工合成, 以便提高在
大肠杆菌中表达[10 ]。对于与大肠杆菌同属原核生物
的鱼腥藻 7120 是否也具有促进作用, 我们分析了
hTN F2Α基因密码子在鱼腥藻 7120 中的使用情况。
结果表明, 密码子使用偏向性一定程度上影响了人
TN F2Α基因在鱼腥藻 7120 中的表达。因此, 对外源
基因直接进行改造不失为最直接、最为有效的方法,
但价格过于高昂使得我们考虑对受体系统改造的可
能性。同时, 密码子分析说明, 一定程度上人 TN F2Α
基因 (cDNA ) 序列在鱼腥藻 7120 中仍可有效表达,
说明对受体系统的改造提高其有效的表达仍具有潜
力, 从而为利用鱼腥藻 7120 产业化生产人 TN F2Α
药物提供了更大的可能性。
3. 3　鱼腥藻 7120 短藻丝体对人 TNF-Α基因接合
转移效率和表达效率的影响
丝状蓝藻鱼腥藻 7120 作为模式生物表达了一
些有用的外源基因[3, 4, 10 ] , 以及尝试提高外源基因表
达效率的报道[7 9, 11 ] , 但涉及改善受体细胞本身的报
道不多[12 ]。由于其细胞外有胶质鞘[13 ] , 我们推测可
能会影响外源基因的接合转移效率。近来有实验证
明超声波处理鱼腥藻 7120 营养藻丝, 可改变细胞膜
的通透性, 提高外源基因接合转移效率[12 ] , 但超声
波处理对鱼腥藻 7120 藻丝体的机械损伤较大, 操作
处理重复性较差, 而且需要过夜静置恢复[12 ]。本研
究利用红光和高温诱导鱼腥藻 7120 形成的具有光
合作用活性的短藻丝体[15 ] , 首次作为外源基因的转
化受体, 结果一定程度上增加了外源基因的接合转
移效率。由于红光和高温诱导可引起蓝藻的细胞膜
和细胞超微结构变化和相应的生理变化[14 ] , 因此我
们推测这可能同超声波处理有类似的改变细胞膜的
通透性机制, 从而提高了外源基因的接合转移或转
化效率。另外, 红光和高温 (45℃) 处理比超声波处
理温和, 对藻的机械损伤较小、无需过夜静置恢复,
可重复性高, 在处理后可立即进行基因转移。因此,
此法不失为一种较为理想的增加丝状蓝藻的接合转
移或转化效率的方法。
有趣的是, 高温和红光诱导短藻丝体的形成发
生在接合转移试验之前, 为何在接合转化子培养形
成正常营养藻丝体后仍能增加人 TN F2Α基因, 其机
理尚不清楚。有文献报道, 高温和红光均可诱导丝状
蓝藻发育形成藻殖段 (Ho rmogon ium ) [21, 22 ]。在丝状
蓝藻眉藻 (Ca loth rix ) 藻殖段形成过程中, 红光因影
响了质体醌库的氧化还原, 从而影响了光合作用和
呼吸作用的电子传递[24 ]; 而高温则可能使一种抑制
藻殖段分化的其化学本质尚不清楚的物质失活从而
引发藻殖段的形成[25 ]。但鱼腥藻 7120 是一种实验
室培养品系, 据认为缺失了丝状蓝藻发育形成藻殖
段这一机制[13 ]。鱼腥藻 7120 本身是否存在或保留
有藻殖段相关基因片段, 或发育形成藻殖段的机制
是否在长期实验室驯化培养过程中丢失或部分丧
失, 仍是个谜。而我们用红光和高温对鱼腥藻 7120
的处理是否与在眉藻等其它丝状蓝藻中诱导藻殖段
形成机理类似, 从而影响了转基因鱼腥藻的光合作
用和呼吸作用以及其它代谢过程, 尚待进一步证实。
另外, 外源基因在宿主中表达势必增加宿主系统的
代谢负荷, 红光和高温处理是否间接调控了这种代
谢的平衡均也有待于进一步研究。
致谢: Sou thern 印迹实验在中国科学院遗传与发育生物
学研究所植物发育分子生物学实验室完成, 感谢陈凡博士和
吴乃虎教授提供方便及无私的帮助! 北京大学生命科学学院
赵进东教授帮助分析了人 TN F2Α基因序列中的密码子偏向
性, 特此致谢!
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703　第 4 期　　　　　　欧阳叶新等: 高温和红光诱导的鱼腥藻 7120 短藻丝体中 TN F2Α基因表达效率的提高