全 文 ：武汉植物学研究 2006，24(5)：403～407
Journal Wuhan Botanical Research
镉胁迫引起烟草悬浮细胞程序性死亡
支立峰 ，余 涛 ，朱英国 ，李阳生
(1．湖北师范学院生物系，湖北黄石 435002；2．武汉大学生命科学学院，植物发育生物学教育部重点实验室，武汉 430072)
摘 要：镉胁迫会造成烟草悬浮细胞大规模死亡。通过 TUNEL技术和琼脂糖凝胶电泳技术的检测发现 ，这种细胞
死亡伴随有典型的DNA“梯形带”出现，表明这种由Cd胁迫引起的细胞死亡是一种程序性死亡。受胁迫细胞氧化
性增强及细胞中丙二醛(MDA)水平升高，说明cd胁迫时会在细胞中造成大量活性氧(ROS)，暗示烟草细胞的程序
性死亡可能与 ROS有关。
关键词：烟草；悬浮培养细胞；细胞程序性死亡(PCD)；Cd胁迫 ；活性氧(ROS)
中图分类号：Q942．5 文献标识码：A 文章编号：1000-470X(2006)05·0403-05
Programmed Cell Death of Tobacco Suspension
Cultures Induced by Cd
ZHI Li—Feng。，YU Tao ，ZHU Ying—Guo ，LI Yang—Sheng
(1．Department ofBiology，Hubei Normal University。Huangshi，Hubei 435002，China；
2．Key Laboratory ofMOEforPlantDevelopmentalBiology，Colegeof Sciences，Wuhan University，Wuhan 430072，China)
Abstract：Heavy metals can occur the large—scale cel death of tobacco suspension cultures．TUNEL study
and genomic DNA gel electrophoresis showed that this kind of cell death was accompanied by PCD—speciG
ic DNA ladder．This result supports that cell death caused by Cd is a kind of programmed cell death
(PCD)．We have also found that the oxidative and the malondialdehyde(MDA)levels of the stressed
cels were enhanced in PCD process，this phenomenon SHOWS that the reactive oxygen species(ROS)in
the stressed cel was increased．Th is suggests that the PCD of tobacco cells are tightly linked to the ROS．
Key words：Tobacco；Suspension cels；Programmed cel death (PCD)；Cd stress；Reactive oxygen
species(ROS)
细胞程序性死亡(PCD，或称细胞凋亡)是指细
胞在其内环境保持稳定的情况下，由基因控制的细
胞 自主的有序死亡⋯，它不同于一般的细胞坏死。
染色质浓缩、胞质收缩、核 DNA被切割成核小体倍
性大小的DNA片段以及凋亡小体的产生等是 PCD
的典型细胞学和生化特征 J。利用这些指标可以
将 PCD与一般细胞坏死区分开来。对 PCD的认识
和研究最初是受到两栖动物变态现象的启发。因
此，动物发育过程及遭受不利环境胁迫所引发的各
种 PCD现象被人们广泛关注和研究。与动物细胞
相比，对植物细胞 PCD的研究只是最近十几年的事
情。科学家们已经在植物的许多生命现象，如落叶、
花败、病原菌入侵以及不利环境胁迫等中观察到与
动物细胞 PCD相似的一些典型特征 J。但对这
些过程的遗传性基础仍不是很清楚。在动物中已经
阐明线粒体在细胞凋亡中起着决定性作用。细胞色
素 C(Cyto—C)的释放、半胱氨酸蛋白酶(caspases)的
激活、胞浆 ca¨ 浓度的升高、ATP产量的下降以及
过量活性氧(ROS)的产生等生化事件都说明了线粒
体在 PCD中的中心作用 。近来对植物 PCD的
生化与分子生物学研究，发现植物线粒体在环境和
发育信号发起细胞死亡的过程 中也起决定性作
用 。最近在植物线粒体膜间隙中发现了一个与
PCD过程相关的 DNase 1]。许多报道也揭示 了过
量 ROS与植物 PCD之间的密切关系 卜H 。
近年来工业、矿业生产中制造的大量重金属被
释放到环境中，镉(Cd)是其中之一。cd胁迫成了
各种生物所面临的一种新的挑战。植物和藻类细胞
虽然可以耐受一定量的 Cd胁迫，但如果环境中 Cd
浓度太高也会造成它们的大量死亡 。在分子水
平，镉能够影响巯基(一SH)和金属鳌合键 的形成和
分离、蛋白质二级结构和细胞内氧化还原状态的改
变，以及影响植物对其生长所必须的金属元素的吸
收、转移和代谢 。另外，在生物体内镉能使在氧
收稿日期：2006-03—16。修回日期：2006-07-02。
作者简介 ：支立峰，(1978一)，男 ，硕士，湖北师范学院生物系讲师，主要从事植物发育遗传学研究(E-mail：zhilifon@yahoo．com．cn)。
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武 汉 植 物 学 研 究 第24卷
化还原或电子转移过程中发挥重要作用的金属蛋白
质发生毒化 ，致使 自由基增多，导致蛋白质、脂类及
其它生物分子发生非特异性破坏Ⅲ 。但对于镉胁
迫引起植物细胞死亡的机制依然不明。本研究以遭
受 Cd胁迫的烟草悬浮培养细胞为材料，阐明了烟
草细胞受 Cd胁迫后的死亡是典型的 PCD，并且初
步证明 Cd胁迫造成烟草细胞 PCD的更深层次原因
可能是由Cd胁迫产生的 ROS。
1 材料和方法
1．1 烟草悬浮细胞系的建立
将培养的烟草(Nicotiana tabacum CV．SRI．)无
菌苗下胚轴切段，用酒精清洗 20 min，接种人 MS固
体培养基上，诱导胚性愈伤组织。取生长旺盛的胚
性愈伤组织2～3 g，转移到盛有20 mL AA液体培养
基(pH 5．8，附加蔗糖 3O g／L，2，4一D 2 mg／L，激动
素0．2 mg／L，赤霉素 0．1 mg／L)的 100 mL三角瓶
中，在回旋式摇床上进行振荡，摇床转速为 120～
140 r／min，温度为(25 4-1)℃，黑暗培养。悬浮培养
初期每隔3 d继代换液一次。45 d后，吸取 10 mL悬
浮细胞转人含 40 mL新鲜培养基的250 mL三角瓶
中，每隔7 d继代换液一次。由此得到分散均匀、细
胞细小的胚性悬浮细胞系。
1．2 镉(Cd)胁迫处理及细胞生长情况测定
在 40 mL新 鲜 培 养 基 中 预 先 加 人 5O～
100~mol／L重金属 Cd，121 oC灭菌 25 min，然后将正
常培养 7 d后的烟草胚性悬浮细胞转人此培养基中
进行胁迫处理，然后观察悬浮细胞的生长状况以及
测定细胞生长量。
细胞生长量的测定参照 Sager等 副¨的方法来计
算。
1．3 丙二醛(MDA)检测
细胞中 MDA的检测采用 Hodges等 ¨的方法。
取 1 L匀质培养物，经 800 g离心 5 min，收集细胞，
用25 mL 80％乙醇萃取。取 1 mL萃取物加人到含
有 1 mL20％(w／v)三氯乙酸(TCA)、0．O1％丁基化
羟基甲苯和 0．65％硫代巴比妥酸(+TBA溶液)的
试管 中，用 力振荡 使溶 液充 分混 合，95％ 加热
25 min，冷却，3 000 g离心 10 min，取上清液，分别测
其在440、532和600 nm的吸收值。MDA浓度的计
算公式参照文献[19]。
1．4 谷胱甘肽 (GSH)和还原型谷胱 甘肽 (GSSG)
的测定
细胞抽提物中 GSH和 GSSG的测定采用 An—
dersonI2叫的方法：取 1 L匀质培养物，经 800 g离心
5 min，收集细胞，用液氮冻融，每克鲜重加人5体积
5％ 5一磺基水杨酸。冻融过程重复 3次以彻底破裂
细胞，20000 g离心 10 min，去除细胞碎片，溶液中
的非蛋白硫醇(thio1)水平用分光光度计进行检测，
以含有 GSH的 Elman试剂 (Sigma公司)做参照。
用 2~mol／L 2一乙烯基吡啶衍生60 min后可以测定
GSSG的水平。样 品 中总 GSH水平 减去氧化态
GSSG水平可以得到还原态 GSH水平。
1．5 TUNEL检测
取对数生长期的正常培养和胁迫处理的烟草细
胞(约5 X 10。+／mL)，细胞爬片，用 4％ (w／v)多
聚甲醛溶液于室温固定 30 min，PBS缓冲液洗 2次，
每次 5 min。立即滴加 TdT酶缓冲液，室温放置
5 min，后随即滴加 5O L TdT酶反应液(TdT酶和
FITC标记 的 12一dUTP分别为 5 和 45 ，Pro—
mega)，置湿盒 中于 37％孵育 1 h，PBS缓冲液洗
3次，每次 5 min。再滴加新鲜配置的0．05％ DAB／
H O 溶液，室温显色 5～10 min(镜下控制显色时
间)，用蒸馏水洗 4次，前 3次每次 1 min，最后 1次
5 min。最后用苏木素复染5 min，二甲苯透明2次，
每次 1 min，中性树胶封固。Olympus荧光显微镜观
察并照相。
1．6 DNA分离和琼脂糖凝胶电泳检测
DNA的提取按 CTAB法进行。将悬浮细胞倒
人 48 mL离心管中，800 g离心 5 min。在液氮中迅
速研磨成均匀的粉末，之后把粉末倒人含有2．5 mL
预热CTAB缓冲液的离心管中进行DNA提取。将
得到的DNA沉淀溶解于200 L TE缓冲液中，加人
5 L RNase(10 mg／mL)，37％保温 30 min。上述实
验操作除 RNA消化外，其余步骤均在冰盒中进行。
取 1O L／道 DNA加样，1．5％的琼脂糖凝胶电
泳，滴加0．1 g／mL EB染色，用凝胶成像系统观察
并记录。
2 结果
2．1 Cd的胁迫处理可引起烟草悬浮细胞大量死亡
正常培养的烟草胚性悬浮细胞颜色呈黄色，很
鲜艳。而当将它们转人含有100~mol／L Cd的培养
液中进行培养后，细胞就会大量死亡，到第7 d时，培
养物呈黑褐色。取培养3 d的烟草细胞测其生长量
(见图1)，经100~mol／L Cd胁迫处理的培养物，其
细胞含量较初始接种量不升反降；而未用Cd胁迫的
对照组培养物，其细胞较初始接种量增加了近80％，
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第5期 主立峰等 镉胁迫引起烟草悬浮细胞程序性死T
较处理组细胞高一倍多 这表明毒性重金属cd的
胁迫处理可引起烟草悬浮细胞的大规模死亡。
。
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o
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围 1 正常和胁迫培养烟草细胞生长量测定结果
Fig 1 nl growth~molin[of tobaco ccl1~mdcr r— l
d s1 res~ed cuhivfitc
2．2 TUNEL检 测和 DNA片段化
c cI的胁迫如震引起烟草细胞的程序性死亡．邢
么一 个{R重 要的标 志就 是棱 DNA的 片段 化。周 此
我们 采 用 Td}_介 导 的 rP缺 口末 端 标 记 技 术
(FUNEL)和琼 脂糖凝胶 电淋技 术对培 养 3 d的正常
细胞和胁迫细胞进行俭删 TUNEL技术是利用脱
氧棱糖核曹酸末端转移酶(Td r)将异硫氰酸荧光素
(FI’rc)标记的 I2 dU1 连接到 DNA片段的粘性
3l_OH末端。当细胞发生程序性死亡时．染色件
DNA会发生断裂而产生大量的粘性 3’一OH末端，从
而可以被标记(见图2：A)．而正常的或增殖细胞由
丁DNA的完整性通常不能被标记f见罔2：B)
A i m 蛔 茸¨膻 ；I 蚺 怍 №
A fhe⋯ }q：e1] I 0 l eultivatcd cell
圈 2 TLrNEL技术检测DNA断裂情况
ng 2 n 0N^‰ ⋯ 静d T~INEL
琼脂糖凇胶电泳技／}：也是检测 DNA片段化的方法．
与 TUNEL一起 可 以进 一步 确 定细 胞程 序 性死 亡
因为细胞程序性北亡时．在内源性核酸内切酶的作
用下，染色体 DNA往棱小体间被切割成 180～
200 bp整数倍的单或寡桉苷酸片段．在电泳时会表
现为特征性的DNA“梯形带”(DNA Ladder)。基于
此，我们提取了培养3 d的正常细胞与胁迫细胞的
基尉组总DNA，然后做琼脂糖凝胶屯沐 结果如图
3所示．在经 cd胁迫处理 的细胞中出现丁Pc【)特
征性的DNA“梯形带”，其中蛀小的片段与核小体
DNA的大i1、接近(≥180 bp)。而正常培养细胞中未
检测到这种现象、
h1 Maker I⋯2 L常蚺 抛，]一5 什圳 50 8O、
I仆0 Irnw1】／L Cd胁迫址理细胞
M Mak r I一2 N～ l cuhivaled cel1．3 —5 s 日 ccU
⋯ lv 50．80 m 0~rn．d／l Ed
圈 3 DNA琼 脂糖 凝胶 电 渌
Fig 3 Ihe⋯ s gel el~tmphoresis tobacco DNA
2．3 受胁迫细胞中GSH水平降低、MDA水平升高
为了进一步弄清镉胁迫引起细胞程序性死亡的
r能机制．我 J对培养3 d的』E常细胞和胁迫细胞
的GStt水平及 GStl／GSSG比率进行了榆测。当细
胞受毒性镉胁迫时．细胞内 GSSG的水平较正常培
养细胞增加了3倍(她圈4：C)。同时细胞中还原型
和氧化型 GSH 比(GSH：0 5GSSG)较正 常细 胞 明显
下降4倍(如图4：D) 这些数据说Ⅲ]．受胁迫细胞
胞质的还原性要强于正常细胞。
cd s 嘲 f⋯ l Cd st f m l
Cd Slrea~f帅 0lm 1 Cd St" “ul1 Im I
A细胞 MI)A古 匕齄i B 绑胞 GSH音量 }匕鞋 c !I盯胜 C．KSG
☆ 较：D蜘 腿进匾， 化 tGSPt：O 5GS~Sg．) m轻
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c⋯ ；c c啪 p⋯ n nf GSSG c ¨ cc¨I L。；D Cnt”Il椰 ll0n of
GSIt：O 5c
圈4 正常培养和胁迫处理细胞的 MDA含量和
细胞氯化还原状态(GSI：0 5GSSG)
Fig 4 The MDA⋯ cen⋯ 鲫d GSIt：0 5GSSG
nr⋯ 1al and⋯ ⋯d el1
受胁迫细胞中GSSG水平增加．说明在毒性镉
的影响下．细胞中产生了很多氧化物质。已有的研
究证实镉的确能够破蝌：正常电子转移过程而引起细
胞叶]IIOS水平的增加 因此我们推测受胁迫细胞
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中产生的氧化物质很可能为 ROS。为此，我们对正
常细胞和胁迫细胞的丙二醛(MDA)水平进行了检
测。MDA是脂类受 ROS过 氧化反应后的产物，
MDA水平可 以反映细胞 中 ROS的状况。当用
100 I~mol／L毒性镉处理后 ，受胁迫细胞中MDA水平
较正常细胞提高近 70％。这反映了受 Cd胁迫后，
会造成烟草细胞中 ROS的大量增加，ROS的增加使
得细胞胞质氧化性增强(图4：A)。
3 讨论
烟草悬浮细胞受 Cd胁迫后会发生大规模死
亡。对受胁迫细胞进行 TUNEL检测，观察到大量阳
性结果(图2：A)。细胞总 DNA的琼脂糖凝胶电泳
结果表明，这种细胞死亡伴随有明显的 DNA“梯形
带”(图3)出现，同时受胁迫细胞氧化还原状态发生
很大逆转(图 4：D)。这些现象充分说明由重金属
镉胁迫引起的大规模细胞死亡是一种 PCD。
在动物细胞 PCD的研究中发现，线粒体膜电势
的功能失调会导致细胞 ATP产量的下降，引发ROS
的增加，又进而导致细胞的PCD 。这暗示细胞
程序性死亡与内源性 ROS增加造成的伤害有紧密
联系 ¨。在植物和动物细胞中，ROS是一种很重要
的信号分子 J。在动物细胞中许多证据都已表明，
ROS是直接或间接引发细胞凋亡的因素 ’2 。近
来，也有研究报道 ROS在植物细胞的 PCD过程中
发挥重要作用 J。。。ROS被看作是超敏反应、干旱
冷害胁迫及衰老过程中植物细胞死亡的关键介质。
植物对病原菌的超敏反应就是由于 ROS的增加激
活了防御系统，同时也引起了植物细胞的 PCD。而
且深人的研究表明，如果细胞清除ROS毒害的能力
降低，那么在超敏反应过程中由病原菌所致的 PCD
就会加强 ¨。在我们的研究中发现，镉的胁迫造成
了细胞 内氧化 性增 强、还原性 降低 (即 GSH：
0．5GSSG降低)，而通过对细胞中 MDA的检测，证
实造成细胞氧化性增强的原因是由于细胞内 ROS
的大量产生。这暗示 ROS很可能是 Cd胁迫引起细
胞凋亡的直接原因。
综上所述，我们首次揭示了 Cd胁迫引起烟草
细胞的大量死亡是一种 PCD，而不是细胞坏死；而
主导烟草细胞 PCD的很可能不是 Cd元素本身，而
是由 Cd胁迫细胞中产生的大量 ROS。至于 ROS是
通过什么样的信号途径引发 PCD过程，这个信号途
径与动物细胞中的信号途径是否一致，这些问题有
待进一步研究。
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