全 文 ：武汉植物学研究 2001, 19 (4) : 327～ 331
J ourna l of W uhan B otan ica l Resea rch
红豆杉愈伤组织超低温保存有关因素的研究Ξ
叶　芳　 夏　胜　 梅兴国
(华中科技大学生命科学与技术学院, 武汉　430074)
摘　要: 对红豆杉愈伤组织超低温保存中几个主要因素进行了比较, 试验证明: 预培养时间、
预培养基中蔗糖浓度、保护剂的组合以及冰冻降温方法与超低温保存后的相对细胞活力密切
相关。试验结果表明, 在含 8% 蔗糖的 62 号液体培养基中振荡预培养 6 d, 红豆杉愈伤组织在
超低温保存后细胞活力可保持最高。有效的冷冻保护剂为 10% 山梨醇+ 10% DM SO , 冷冻方
法以分步冷冻和慢冻较为适宜, 而经快冻的愈伤组织复苏后活力低下。
关键词: 超低温保存; 细胞活力; 红豆杉愈伤组织
　　中图分类号: Q 943. 1　文献标识码: A 　文章编号: 10002470X (2001) 0420327205
Stud ies on Factors in Cryopreserva tion of Taxus Callus
YE Fang, X IA Sheng, M E I X ing2Guo
(Colleg e of L if e S cience and T echnology , H uaz hong U n iversity of S cience and T echnology , W uhan　430074, Ch ina)
Abstract: T he experim en t compares the m ain facto rs of cryop reservat ion of
T ax us callu s. T he resu lts show that w ith the differences of p recu ltu re t im e,
saccharo se con ten t of cu ltu re m edium , cryop ro tectan ts and freezing m ethod,
the cell vita lity varies rem arkab ly. A fter T ax us callu s w as p recu ltu red in N o.
62 m edium w ith 8% saccharo se fo r 6 days, the T TC value of T ax us callu ses
after freezing and sto rage in LN (liqu id n it rogen) w as h igh. T he mo st effect ive
cryop ro tectan t is the m ix tu re of 10% DM SO and 10% so rb ita l. T he effect ive2
ness of the step 2freezing and slow 2freezing m ethods w as m uch bet ter than that
of the rap id2freezing m ethod.
Key words: C ryop reservat ion; Cell vita lity; T ax us callu s
超低温通常指低于- 80℃的低温, 主要是液氮 (- 196℃)及液氮蒸汽相。超低温保存
是长期保存植物组织和细胞并保持遗传稳定性的有效方法, 在如此低的温度下保存生物
材料, 从理论上讲, 可以降低甚至完全抑制其生活力及基因变异可能性, 因此能够保持生
物材料的遗传稳定性, 这在解决组织、细胞继代培养及自然界中积累性的突变等变异[1 ] ,Ξ 收稿日期: 2000212212, 修回日期: 2001203209。作者简介: 叶芳 (1975- ) , 女, 硕士, 从事分子生物学和生物物理学研究。
保存和抢救物种等方面有极其重要的作用。近年来, 随着植物组织培养工作广泛迅速发
展, 对植物组织细胞离体系统的保存技术的研究也日益引起人们的重视。目前, 已有多种
植物的器官、组织和细胞培养物的超低温保存获得成功[2 ]。国际上从 20 世纪 80 年代起就
开始对紫杉醇进行了大量的研究, 并且肯定细胞培养法是解决紫杉醇药源的一种最优途
径[3 ] , 但目前还未见有关红豆杉细胞超低温保存的报道。由于红豆杉细胞长期的继代培养
会导致体细胞变异和紫杉醇合成能力的下降[4 ] , 因此, 及时保存高产红豆杉细胞株对于紫
杉醇大规模发酵生产有着极其重要的意义。本试验主要探索在何种条件下, 能使经冷冻保
藏后的红豆杉愈伤组织生活力达到最高。
1　材料和方法
1. 1　材料
红豆杉愈伤组织 TD 2 由东北红豆杉 (T ax us cusp id a ta ) 茎尖幼叶诱导而来。在 62 号
(M S 改良培养基)固体培养基上进行继代培养, 培养温度为 26℃, 每 30 d 继代培养 1 次,
将继代培养 7 次生长 30 d 的愈伤组织转入 62 号液体培养基中, 以培养约 10～ 15 d 处于
对数生长状态的红豆杉愈伤组织作为冷冻材料。
1. 2　方法
1. 2. 1　预培养　将培养材料分别转入到含有 4% , 6% , 8% 蔗糖的 62 号液体培养基中培
养, 在各种浓度下培养 4、6、8、10、12、14、16 d。
1. 2. 2　冷冻保护剂的预处理　本次试验设计了多种组合的冷冻保护剂, 其中包括: ①不
同浓度 (6% , 8% , 10% , 12% , 14% ) 的糖、糖醇或醇类物质, 包括甘油、葡萄糖、山梨醇、甘
露醇和聚乙二醇 (PEG) 与 10% 的二甲亚砜 (DM SO ) 分别组合作为冷冻保护剂; ②DM SO
+ 山梨醇+ PEG 多种成分的复合保护剂。将约 100 m g 的预培养后的材料置于冷冻保藏
管内, 加入冷冻保护剂, 使之浸没愈伤组织, 密封保藏管, 在 0℃下静置预处理 30 m in。
1. 2. 3　降温冷冻程序　将完成预处理后的试验材料分别采取快冻、慢冻和分步冷冻 3 种
方法处理。①快冻: 将预处理后的材料从 0℃直接投入液氮中; ②慢冻: 将预处理后的材料
先缓慢降温至- 40℃, 降温速率约为 1℃öm in, 放置 180 m in, 然后投入液氮; ③分步冷冻:
将预处理后的材料降温至- 10℃, 停留 30 m in, 再缓慢降至- 40℃, 静置 180 m in 后投入
液氮中保存。
1. 2. 4　解冻和洗涤　材料经液氮保存后, 取出并立即投入 37℃水浴中解冻, 待保藏管内
的冰刚融化, 立即加入等体积新鲜 62 号液体培养基 (含 3% 的蔗糖) 进行冲洗, 然后吸去
培养液, 再用同样方法洗涤 2 次, 每次停留 10 m in。
1. 2. 5　细胞活力的测定　解冻后的愈伤组织用 T TC 法 (氯化三苯基四氮唑还原法) 测定
其生活力。按 Tow ill 和M azu r 方法[5 ] , 称取 100 m g 洗涤后的愈伤组织, 加入 014% 的
T TC 试剂和pH 7 的 011 mo löL 的磷酸缓冲液各 215 mL , 在黑暗下于 27℃放置 24 h 后倒
掉 T TC 液, 用蒸馏水洗涤 3 次。再加入 95% 乙醇 5 mL , 于 60℃水浴 30 m in, 用 731 型紫
外光分光光度计在 485 nm 处测其吸收峰值。用吸收值表示各处理的愈伤组织在超低温
保存后的细胞活力。
823 武 汉 植 物 学 研 究　　　　　　　　　　　　　　　　第 19 卷　　
2　结果与分析
2. 1　红豆杉愈伤组织超低温保存后的细胞活力与预培养的关系
由于细胞的生理状态与抗寒能力有密切关系, 因此在探索超低温保存条件时, 我们也
特别注意到愈伤组织的预培养条件对保存后细胞活力的影响。以10% 山梨醇与10%
培养天数 (d)
P recu ltu re tim e
蔗糖浓度: —û — 4% 蔗糖;
—■— 6% 蔗糖; —▲— 8% 蔗糖;
Saccharo se con ten t: —û — 4% saccharo se;
—■— 6% saccharo se; —▲— 8% saccharo se
图 1　预培养天数和预培养基中蔗糖含量
对红豆杉愈伤组织超低温保存后TTC 值的影响
F ig11　Effects of p recu ltu re tim e and saccharo se
con ten t of cu ltu re m edium on the T TC value of
T ax us calluses after freezing and sto rage in LN
注: 图 1 中结果为使用 10% 山梨醇+ 10% DM SO 作
为冷冻保护剂时预培养条件对保存后 T TC 值的
影响。
N o te: T he resu lts in fig. 1 w ere the effects of p recu l2
tu re condition on the T TC value after freezing and
sto rage in LN w hen 10% so rb ital+ 10% DM SO
w as used as cryop ro tectan t.
DM SO 组合作为冷冻保护剂使用时为例, 显示
不同预培养条件对保存后细胞活力的影响。所
获结果的趋势列于图 1。曲线表明, 红豆杉愈伤
组织在经含 4% 蔗糖中预培养 14 d, 在 6% 蔗糖
中预培养 12 d, 在 8% 蔗糖中预培养 6 d 后, 再
进行超低温保存细胞具有较高的活力, 其中以
在 8% 蔗糖中预培养 6 d 的愈伤组织在冷冻保
存后细胞活力最高。如图 1 所显示的, 预培养
时间短于 8 d 的 T TC 值最高点出现在用含
8% 蔗糖的 62 号培养基进行预处理的材料中,
因此, 用高糖浓度的培养基进行较短时间的预
培养对于红豆杉愈伤组织的超低温保存是适
宜的。而超过 8 d 后, 抗冻能力最强的是经 6%
的较低糖浓度处理后的材料, 这说明红豆杉愈
伤组织在经高糖浓度处理时间较长后, 抗冻能
力会有所下降。
我们使用其它冷冻保护剂时也发现了类
似的结果 (见表 1) , 即 T TC 值最高值一般出现
在用含高浓度蔗糖预培养 4～ 6 d 的培养物中。
表 1　使用各种冷冻保护剂在保存后达到最高 TTC 值时
预培养天数和预培养基中的蔗糖含量
T able 1　P recu ltu re t im e and saccharo se con ten t of cu ltu re m edium w hen 　
differen t cryop ro tectan ts w ere used to reach their m axim um T TC value
冷冻保护剂
C ryop ro tectan ts
蔗糖
Saccharo se
葡萄糖
Gluco se
甘油
Glycero l PEG
山梨醇
So rb ital
PEG+ 山梨醇
PEG+ So rb ital
预培养基中蔗糖含量
Saccharo se con ten t of
cu ltu re m edium
8% 8% 6% 8% 8% 8%
预培养天数
P recu ltu re tim e (d) 4　 6　 6　 6　 6　 6
2. 2　冷冻保护
剂的影响
迄今, 已报
道了多种类型的
冷冻保护剂, 我
们在红豆杉愈伤
组织的超低温保
存中进行了几类
保护剂的试验, 各种保护剂按 6%、8%、10%、12% 和 14% 的浓度梯度分别处理红豆杉愈
伤组织, 经液氮中保存, 复苏后进行 T TC 法测定。T TC 测试的结果列于表 2, 这些结果表
明: 以山梨醇同 10% DM SO 的结合处理效果最好, 山梨醇最佳浓度为 10% , 这与Chen 等
在长春花 (Ca tha ran thus roseus)细胞培养物的超低温保存试验中的结果是一致的[6 ]。另外
我们也发现 PEG 与 10% DM SO 组合进行处理也有一定效果, 其最佳浓度为 6% , 但
T TC 的值要低很多。而其它 3 种保护剂, 从 T TC 的值来看几乎未能起到保护的作用, 解
冻后细胞活力极低。除以上几种组合外, 还尝试将效果较显著的 6% PEG 与 10% 山梨醇
923　第 4 期　　　　　　　　　　　叶 芳等: 红豆杉愈伤组织超低温保存有关因素的研究
组合, 并加入10% DM SO , 发现其T TC值虽略高于6% PEG+ 10% DM SO 的效果, 但比
10% 山梨醇单独作用时效果要差得多。
表 2　不同种类冷冻保护剂同 10% DM SO 结合的最佳浓度及其对
红豆杉愈伤组织超低温保存后 TTC 值的影响
T able 2　Best concen tra t ion of cryop ro tectan ts in com bination w ith 10% DM SO and
effects on the T TC value of T ax us calluses after freezing and sto rage in LN
冷冻保护剂
C ryop ro tectan ts
蔗糖
Saccharo se
葡萄糖
Gluco se
甘油
Glycero l PEG
山梨醇
So rb ital
PEG+ 山梨醇
PEG+ So rb ital
最佳浓度
Best concen tration 10% 8% 14% 6% 10% 6% + 10%
T TC 的值
V alue of T TC 0. 047 0. 121 0. 133 0. 436 4. 333 0. 523
2. 3　愈伤组织冷冻后的生活力与冷冻方法的关系
超低温保存早期大多采用冻结化保存技术, 至今报道的降温方法有 3 种: ①快速冷冻
表 3　降温冷冻方法对红豆杉愈伤组织
超低温保存后 TTC 值的影响
T able 3　Effects of freezing m ethods on the T TC
value of T ax us callus after sto rage in LN
冷冻方法
F reezing m ethods
T TC 值
T TC value
0℃ LN 0. 178
0℃ - 40℃, 180 m in LN 3. 4
0℃ - 10℃, 30 m in - 40℃, 180 m in LN 4. 333
法; ②慢速冷冻法; ③分步冷冻法。
我们主要探讨对于红豆杉愈伤组
织, 哪一种冷冻方法最为适宜。为
此, 我们使用较好的预培养条件 (在
含 8% 蔗糖的 62 号培养基中预培
养 6 d) 和较好的冷冻保护剂 (10%
山梨醇+ 10% DM SO ) 处理红豆杉
愈伤组织, 再分别进行快冻、慢冻和
分步冷冻。表 3 是其中一次具有代表性的结果。这些结果表明, 快速冷冻法, 即从 0℃直接
投入液氮, 对红豆杉的超低温保存是不适宜的, 愈伤组织复苏后细胞活力低, 而经分步冷
冻和慢冻的材料均有较高的 T TC 值。
3　讨论
材料的生理状态与超低温保存后的细胞活力密切相关。因此, 冷冻材料的预培养可明
显影响其超低温保存后的细胞活力[7 ]。试验结果表明, 在 8% 蔗糖浓度下预培养 4～ 6 d 红
豆杉愈伤组织在冷冻保存后细胞活力较高。可能由于高糖浓度培养基使细胞自由水的含
量下降, 降低在冷冻过程中所形成的冰晶对细胞膜系统和细胞结构的破坏, 从而使冻藏后
的红豆杉细胞保持较高活力。
冷冻保护剂的选择对植物组织和细胞的超低温保存十分重要[8 ]。从本试验结果来看,
红豆杉细胞愈伤组织超低温保存最有效的冷冻保护剂是 10% 山梨醇+ 10% DM SO 的混
合物; 其次是 6% PEG+ 10% DM SO ; 而其它 3 种保护剂起到保护的作用不大, 解冻后细
胞活力极低。DM SO + 山梨醇+ PEG 多种成分的复合保护剂比 10% 山梨醇+ 10%
DM SO 的作用效果要差得多。
超低温保存早期大多采用冻结化保存技术, 主要有 2 种方法: ①快速冷冻法, 降温速
率超过 40℃öm in, 或将材料直接放入液氮 (LN ) 或其蒸汽相中; ②慢速冷冻法[8 ] , 即采用
合适的降温速率, 既能有效地阻止细胞液或液泡结冰, 又能防止细胞质中溶液浓度过高,
有害物质积累太多, 破坏细胞膜的结构, 降温速率在 011～ 10℃öm in 之间, 但这一方法存
033 武 汉 植 物 学 研 究　　　　　　　　　　　　　　　　第 19 卷　　
在降温速率难以把握或保存材料存活率过低的问题[9 ]。现在超低温保存技术较常用分步
冷冻法 (step 2freezing) , 就是将材料放入液氮前, 经过一预冷阶段, 达到逐步降温的目的。
对于红豆杉愈伤组织, 冷冻方法以分步冷冻和慢冻较为适宜, 而经快冻的愈伤组织复苏后
细胞活力低下。
本研究优化了红豆杉愈伤组织超低温保存中几个主要条件, 为红豆杉高产细胞株种
质保存打下了坚实的基础。本试验所有的愈伤组织在液氮中均只保存 24 h, 更长期的超
低温保存试验及保藏时间与复苏后细胞活力和遗传稳定性关系的研究还在继续进行。
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