全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(10): 1720−1726 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2012AA10A309, 2006AA100102)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 张增艳, E-mail: zhangzengyan@ caas.cn, Tel: 010-82108781
Received(收稿日期): 2013-02-05; Accepted(接受日期): 2013-04-22; Published online(网络出版日期): 2013-08-01.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20130801.1726.010.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.01720
抗小麦黄矮病相关蛋白激酶 TiDPK1与 BYDV外壳蛋白的互作
汪信东 陈 亮 张增艳*
中国农业科学院作物科学研究所 / 农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程 / 农业部麦类生物学与遗传育种重点实验室, 北
京 100081
摘 要: 小麦黄矮病是由大麦黄矮病毒(Barley yellow dwarf virus, BYDV)引起的小麦重要病毒病。分离于小麦–中间
偃麦草易位系的蛋白激酶编码基因 TiDPK1, 是一个抗小麦黄矮病相关基因。本文报道利用酵母双杂交技术和双分子
荧光互补技术对 TiDPK1与 BYDV外壳蛋白(coat protein, CP)互作的研究结果。酵母双杂交分析结果表明, TiDPK1能
够与 BYDV-GAV、-PAV株系的 CP互作, 双分子荧光互补分析结果进一步表明, TiDPK1可与 BYDV的 CP互作、产
生双分子荧光互补信号, 说明 TiDPK1确可与 BYDV CP相互作用, 该结果对了解 TiDPK1在小麦抗 BYDV反应机制
具有一定意义。
关键词: 小麦; 蛋白激酶 TiDPK1; 大麦黄矮病毒外壳蛋白; 酵母双杂交; 双分子荧光互补; 蛋白互作
Interaction between Wheat Resistance-related Kinase TiDPK1 and BYDV Coat
Protein
WANG Xin-Dong, CHEN Liang, and ZHANG Zeng-Yan*
National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement / Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Triticeae Crops,
Ministry of Agriculture / Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China
Abstract: Yellow dwarf virus disease is one of the important diseases of wheat (Tritium aestivum L.) worldwide. It is caused by
Barley yellow dwarf virus (BYDV) that is vectored by aphids. A kinase protein encoding gene TiDPK1, which is derived from
Thinopyrum intermedium, is an important gene involved in BYDV resistance in wheat-T. intermedium translocation lines. In this
study, we used yeast two-hybrid and bimolecular fluorescence complementation assays to explore the relationship between
TiDPK1 and coat protein (CP) of BYDV (BYDV-CP). The results proved that the protein TiDPK1 interacted with BYDV-CP,
which may offer an insight to the resistance mechanism of TiDPK1.
Keywords: Wheat; Protein kinase TiDPK1; Coat protein of Barley yellow dwarf virus; Yeast two-hybrid: Bimolecular fluores-
cence complementation; Protein–protein interaction
黄矮病是由大麦黄矮病毒(Barley yellow dwarf
virus, BYDV)引起的小麦病毒病, 在世界各地小麦
产区均有发生, 我国西北、华北、西南、华东等近
20个省、市、自治区的冬春麦区每年都有不同程度
的病害, 造成小麦减产 5%~30%, 个别严重地块减
产幅度超过 50%[1], 目前除抗病品种外, 尚无其他
有效的防治措施。优良的抗病资源是抗病育种的关
键之一。小麦栽培品种中缺乏对黄矮病的有效抗源,
仅在少数材料中发现 1 个耐病基因 [2]。偃麦草属
(Thinopyrujm)、冰草属(Agropyron)、赖草属(Leymus)、
披碱草属(Elymus)、鹅冠草属(Roegneria)中十余种小
麦近缘植物对黄矮病免疫 , 其中以中间偃麦草(Th.
intermedia)被研究利用最多。国内外几个研究组分别
将携带抗病基因的中间偃麦草染色体或染色体片段
导入小麦背景 ,育成抗黄矮病的小麦异源染色体
系[3-5]。小麦–中间偃麦草易位系 YW642, 携带源自
中间偃麦草 7X(7Ai-1)染色体长臂的抗黄矮病基因
Bdv2 [6], 抗 BYDV的 PAV-Aus、-MAV、-GAV、-GPV
等多个株系。
BYDV是一类正单链 RNA病毒, 通过蚜虫传播,
第 10期 汪信东等: 抗小麦黄矮病相关蛋白激酶 TiDPK1与 BYDV外壳蛋白的互作 1721


可侵染小麦、大麦、燕麦、禾草等上百种植物。BYDV
与介体蚜虫间存在一定的专化性, 每种株系只能由
1种或少数几种蚜虫传播。目前, 已将 BYDV-PAV、
-PAS、和-GAV 株系划分为 Luteovirus 属, BYDV-
RPV 、 -GPV 株 系 划 分 为 Polerovirus 属 , 而
BYDV-SGV和-RMV 株系在 Luteovirus病毒科中尚
未指定种属[7]。其中 PAV、PAS 是欧美国家小麦黄
矮病的主流株系[8], GPV 主要分布于我国及瑞典[9],
GAV 是我国黄矮病的主流株系[10]。近年来, 国内外
分别完成了 BYDV-PAV[11-12]、-MAV[11]、-RPV[13]、
-GAV[14]和-GPV[15]等株系的基因组测序。序列分析
表明, BYDV-GAV基因组包含 6个开放阅读框(open
reading frame, ORF), 分别编码 P1、病毒外壳蛋白
(coat protein, CP)、运动蛋白(movement protein, MP)、
依赖 RNA 的 RNA 聚合酶 (RNA-dependent RNA
polymerase, RdRp)、传毒蛋白 (aphid transmission
protein)和 RNA沉默抑制子(P6)[16]; BYDV-PAV基因
组也包含 6个 ORF, 分别编码 P1、RdRp、传毒蛋白、
CP、MP和 RNA沉默抑制子(P6), 但不同地区的 PAV
序列差异较大。BYDV 的 CP 可能是该病毒感染小
麦的重要致病因子(与王锡锋研究员和刘艳博士的
私人通讯)。
近年研究发现, 蛋白激酶识别病原效应因子或
传递下游信号参与防御反应。水稻抗白叶枯病基因
Xa21 编码受体类蛋白激酶(RLK)、使野生稻具有抗
Xanthomonas oryzae pv. oryzae的性质[17]; 在马铃薯
抗 Pseudomonas syringae反应中, 蛋白激酶 Pto能识
别病原菌的效应因子(AvrPto与 AvrPtoB), 并通过与
抗病蛋白 Prf 互作共同抵御病原菌[18]; 簇毛麦抗白
粉病重要基因 STK-V 编码丝氨酸和苏氨酸蛋白激酶
基因, 为 Pm21 基因簇的关键成员, 使小麦-簇毛麦
易位系具有白粉病抗性[19]。TiDPK1是张增艳课题组
从抗黄矮病易位系 YW642 中分离的一个蛋白激酶
编码基因 , 定位于易位的中间偃麦草染色体片段
上。Virus-induced gene silencing (VIGS)功能分析表
明, TiDPK1 是小麦–中间偃麦草易位系防御 BYDV
反应所需基因(未发表), 但其是否与 BYDV CP互作
目前还不知道。
研究蛋白相互作用的方法主要有酵母双杂交
(yeast two-hybrid, YTH) 、 双 分 子 荧 光 互 补
(bimolecular fluorescence complementation, BiFC)、免
疫共沉淀 (coimmunoprecipitation, CO-IP)及 pull-
down 等。YTH 的原理主要是基于对酵母转录因子
GAL4性质的认识, 即将用于互作研究的 2个基因分
别与 GAL4 N-端的 DNA 结合域(DNA binding do-
main, BD)或 GAL4 C转录激活域(activation domain,
AD)融合、构建在表达载体上, 共同在特别改造的酵
母菌株如 AH109(GAL4-)中表达融合蛋白。若 2个融合
蛋白互作, 功能重建的 GAL4 则能激活下游报告基
因的表达, 使改造酵母菌株在各种缺陷型培养基上
正常生长。因此在 YTH实验中, 可通过对特异改造
酵母菌株在各种缺陷型培养基上生长状况及
X-α-gal颜色反应等来判定蛋白间的相互关系[20]。双
分子荧光互补是 2002年由Hu等[21]报道的用于直观、
快速判断目标蛋白在活细胞中的定位及其互作的技
术。该技术巧妙地将荧光蛋白分子的发光基团分成
2 个互补片段, 分别与其中一个目标蛋白融合表达,
共同转化细胞, 如果荧光蛋白恢复活性、表达荧光,
则表明 2个目标蛋白具有相互作用。
本研究通过 YTH 和 BiFC 技术, 研究 TiDPK1
与 BYDV-GAV、-PAV的 CP间互作关系, 有助于探
究和理解 TiDPK1 抗 BYDV 的作用机制, 对植物与
微生物互作研究亦有一定的意义。
1 材料与方法
1.1 植物材料
盆栽感黄矮病的小麦品系中 8601 (每盆 20 株,
共 2盆)在温室中(昼 25℃, 14 h; 夜 15℃, 10 h)。至
二叶一心期 , 在幼苗基部叶鞘处分别接种带
BYDV-GAV 或 BYDV-PAV 的蚜虫(中国农业科学院
植物保护研究所王锡锋研究员和刘艳博士提供), 各
20株。约 35 d后开始显症, 取感病(含 BYDV)叶片
迅速放置液氮中速冻、−80℃保存。采用 TRIzol
(Invitrogen)方法提取叶片总 RNA, 利用反转录试剂
盒(TaKaRa DRR019)进行反转录获得第一链 cDNA,
用于克隆 BYDV-GAV、BYDV-PAV的 CP完整 ORF。
1.2 基因克隆
根 据 BYDV-GAV (GenBank 登 录 号 为
AY220739.1), BYDV-PAV (EU332308.1)基因组中 CP
序列, 设计克隆 BYDV-GAV 和-PAV 的 CP 的引物
GAV-CP-F、GAV-CP-R、PAV-CP-F和 PAV-CP-R (表
1), 以含 BYDV的中 8601 cDNA为扩增模板, 应用
高保真酶进行 PCR 扩增, 1%琼脂糖电泳分离获得
600 bp扩增产物。回收 PCR产物, 将其产物插入克
隆载体 pMD18-T (TaKaRa D101), 转化至大肠杆菌
TOP10感受态细胞中, 经过筛选、测序, 获得正确的
1722 作 物 学 报 第 39卷


阳性克隆 pMD18-T-GAV-CP 和 pMD18-T-PAV-CP。
TiDPK1 (GenBank 登录号为 HQ423150)由本实验室
克隆。
1.3 酵母双杂交载体的构建
为构建与 GAL4-BD 融合的 BYDV-GAV CP/
-PAV CP的酵母表达载体, 设计了在这 2个完整编码
序列两端分别引入 BamH I与 Pst I酶切位点的引物
(表 1), 以 pMD18-T-GAV CP/-PAV-CP质粒为模板、
使用高保真酶扩增、获得加入上述酶切位点的
BYDV-GAV CP/-PAV CP 完整编码序列, 回收 PCR
扩增产物。利用 BamH I、Pst I双酶切上述 PCR回
收产物和酵母表达载体 pGBKT7 (Clontech)质粒, 用
T4 ligase 连接, 转化大肠杆菌 TOP10 感受态细胞,
经过筛选、测序, 获得正确的融合蛋白的酵母表达
载体 pGBKT7-GAV-CP和 pGBKT7-PAV-CP。以同样
的方法将 TiDPK1 克隆到 AD 靶蛋白载体 pGADT7
(Clontech), 构建 TiDPK1与GAL4-AD融合的酵母表
达载体 pGADT7-TiDPK1。
1.4 BiFC表达载体的构建
为将 TiDPK1 和 BYDV-GAV CP 完整的 ORF 分
别融合到 BIFC 基础载体 pSYCE 和 pSYNE 载体中
黄色荧光蛋白的 C 端一半、N 端一半片段上, 利用
Fast PCR Clone Kit (购买自 PUEX公司)构建 BiFC
融合表达载体 (图 2)。设计引物扩增 TiDPK1 和
GAV-CP完整的 ORF, 将线性化载体 Sac I酶切位点
两端邻近 15 bp载体序列分别引入上、下游引物, 选
择内切酶 Sac I分别消化骨架质粒 pSYCE、pSYNE (中
国科学院植物研究所林金星研究员惠赠), 将回收
PCR产物、线性化载体按 2∶1的比例混合, 加入 FC
重组酶, 室温反应 30 min, 冰上放置 5 min, 转化大
肠杆菌 TOP10 感受态细胞, 经过筛选、测序, 获得
正确的重组 BiFC 表达载体 pSYCE-TiDPK1 和
pSYNE-GAV-CP。
1.5 酵母双杂交分析
YTH 中所用酵母菌株为 AH109, 含有 ADE2、
HIS3、MEL1 和 LacZ 等报告基因, 这些报告基因表
达受 GAL4调控。只有在与 GAL4-AD/-BD融合的 2
个蛋白互作、GAL4 活性完整存在下, 酵母 AH109
细胞才能在−Ade/−His/−Leu/−Trp缺陷性培养基上正
常生长, 能把无色底物 X-α-gal水解为蓝色产物。
将AH109菌株在YPDA固体培养基上划线培养
(30℃, 2~3 d), 挑选白色单克隆(直径 2 mm左右)接
种于 1 mL YPDA液体培养基中, 30℃, 230 转 min−1
培养 8~12 h, 转接至 50 mL (于 250 mL三角瓶)继续
振荡培养至 OD600值为 0.15~0.30。室温离心弃上清
液, 将菌体重悬于 100 mL YPDA液体培养基中培养
直至 OD600值为 0.6。室温离心, 弃上清液, 将菌体
重悬于 60 mL无菌水。室温离心, 弃上清液, 将菌体
重悬于 3 ml 1.1倍的 TE/LiAc中, 短暂离心, 弃上清
液, 菌种重悬于 600 μL 1.1×TE/溶液中, 获得了酵母
感受态细胞, 立即用于转化实验。
提取 pGADT7-TiDPK1、 pGBKT7-GAV-CP、
pGBKT7-PAV-CP等载体质粒、浓缩至 1 μg μL−1以
上 , 采用 PEG/LiAc 法转化酵母感受态细胞 [22]。
pGADT7-TiDPK1、pGBKT7-GAV-CP 与 pGBKT7-
PAV-CP 单独转化 , 用于毒理测试及自激活检验 ;
pGADT7-TiDPK1+pGBKT7、pGADT7+pGBKT7-GAV-
CP 和 pGADT7+pGBKT7-PAV-CP 用于对照实验 ;
pGADT7-TiDPK1+pGBKT7-GAV-CP 和 pGADT7-
TiDPK1+pGBKT7-PAV-CP 作为目标蛋白间互作分
析的实验组。
1.6 BiFC分析
取新鲜的黄皮洋葱内第 5 或第 6 层表皮细胞约
4~6 cm2, 内表皮朝下、紧贴于 MS固体培养基中间

表 1 本研究中所用的引物序列
Table 1 Primers used in this study
引物
Primer
正向序列
Forward sequence (5′–3′)
反向序列
Reverse sequence (5′–3′)
GAV-CP ATGAATTCAGTAGGCCGTAG CTATTTGGGAGTCATGTTGG
PAV-CP ATGAATTCAGTAGGCCGTAG CTATTTGGCAGTCATTAGATG
YTH-GAV-CP GCGGGATCCATGAATTCAGTAGGCCGTAG GCGCTGCAGCTATTTGGGAGTCATGTTGG
YTH- PAV-CP ATACCCGGGATGAATTCAGTAGGCCGTAG ATACTGCAGCTATTTGGCAGTCATTAGATG
YTH-TiDPK1 ATACCCGGGATGATTGAGGGGGCAAGGTTC GCGGGATCCGCTGTCGGTGGTCATGGG
pSYNE-GAV-CP GAAAAGTCGACATATATGAATTCAGTAGGCCGTAG CCAGATCTGACTAGTCTATTTGGGAGTCATGTTGG
pSYCE-TiDPK1 GAAAAGTCGACATATATGATTGAGGGGGCAAGG CCAGATCTGACTAGTTCAGTCGGTGGTCATGGG
第 10期 汪信东等: 抗小麦黄矮病相关蛋白激酶 TiDPK1与 BYDV外壳蛋白的互作 1723


位置, 避免产生气泡。密封后, 避光 30℃培养 4~5 h。
提取 pSYCE-TiDPK1和 pSYNE-GAV-CP重组载体质
粒, 各 3 μg 制作转化的金弹, 按照 PDS 1000/He
Particle Delivery System (Bio-Rad)手册进行基因枪
转化上述培养的洋葱表皮细胞。同时转化 4 组不同
组合的质粒 , pSYCE-TiDPK1+pSYNE-GAV-CP、
pSYCE+pSYNE、pSYCE+pSYNE-GAV-CP和 pSYCE-
TiDPK1+pSYNE, 每组组合中质粒按等量混合(各 3
μg)。转化后的洋葱表皮细胞, 密封、避光 30℃培养
约 16 h, 在共聚焦显微镜(Zeiss, LSM700) 513 nm波
长下观察黄色荧光信号。
2 结果与分析
2.1 酵母双杂交重组载体及 BiFC重组表达载体
以含 BYDV的中 8601 cDNA作为模板, 扩增获
得 BYDV-GAV CP和 BYDV-PAV CP完整ORF, 大小
为 600 bp (图 1)。序列比较结果表明, 与 GenBank
中注册的序列相比, BYDV-GAV CP 序列完全一致,
而 BYDV-PAV CP序列一致性为 99%, 存在 2个碱基
的差异。


图 1 BYDV-GAV和 BYDV-PAV外壳蛋白(CP)基因
开放阅读框的 PCR扩增结果
Fig. 1 PCR products of coat protein (CP) gene sequences of
BYDV-GAV and BYDV-PAV
1: BYDV-GAV CP; 2: BYDV-PAV CP; M: marker II.

将 TiDPK1 和 BYDV-GAV CP/-PAV CP 的全长
ORF 分别构建到 YTH 载体 pGADT7, pGBKT7 中,
获得重组表达载体 pGADT7-TiDPK 和 pGBKT7-
GAV-CP/-PAV-CP (图 2-A)。
将 TiDPK1和 GAV CP完整的 ORF分别融合到
BiFC 基础载体 pSYCE、pSYNE 载体中黄色荧光蛋
白的 C端一半、N端一半上, 获得 BiFC融合表达载
体 pSYCE-TiDPK1和 pSYNE-GAV-CP (图 2-B)。
2.2 酵母双杂交分析 TiDPK1 与 GAV CP/-PAV
CP间互作
将 pGADT7-TiDPK1 与 pGBKT7-GAV-CP 或
pGBKT7-PAV-CP 转化的酵母菌株分别涂布于
SD/–Leu和 SD/–Trp固体培养基, 30℃、培养 2 d, 挑
取单克隆于 SD/–Leu/Amp+和 SD/–Trp/Kan+液体培
养基中进行毒理检测。30℃下 230 转 min−1培养过
夜, 经检测, 培养基 OD600值为 0.923 (>0.8), 表明
pGADT7-TiDPK1、pGBKT7-GAV-CP 与 pGBKT7-
PAV-CP表达的融合蛋白对酵母细胞无毒副作用。


图 2 酵母双杂交系统(A)及 BiFC系统(B)中 TiDPK1和 BYDV
CP的表达载体示意图
Fig. 2 Scheme of TiDPK1 and CP expression vectors in YTH
(A) and BiFC (B)

将 pGADT7-TiDPK1和 pGBKT7-GAV-CP/-PAV-
CP转化的酵母菌株分别涂布于 SD/−Leu和 SD/−Trp
固体平板, 30℃培养 2 d, 挑取单克隆于 0.5 mL YPD
液体培养基中。30℃下 230转 min−1培养过夜, 稀释
后分别涂布于营养缺陷性 SD/–Leu/–His和 SD/–Trp/
–His固体平板(添加 30 mmol L−1 3AT, 3-amino-1,2,
4-triazole, 自激活抑制剂)。30℃倒置培养 3 d, 均未
出现生长细胞 , 表明 pGADT7-TiDPK1、pGBKT7-
GAV-CP和 pGBKT7-PAV-CP转化的酵母无自激活现
象, 可用于后续实验。
将对照组和实验组重组质粒转化的酵母分别涂
布于 SD/–Leu/–Trp固体平板。30℃、培养 3 d, 所有
菌落正常生长。将上述单克隆的菌液涂布于含 3AT
的 SD/–Ade/–His/–Leu/–Trp 四缺营养缺陷性固体平
板上(添加 30 mmol L−1 3AT以增加可靠性。3AT是
HIS3 产物竞争抑制剂, 只有 HIS3 高表达酵母才能
成活 ), 30 ℃下培养 3 d 后 , pGADT7-TiDPK1+
pGBKT7-GAV-CP 及 pGADT7-TiDPK1+pGBKT7-
PAV-CP 转化的菌株开始出现菌落, 5 d 后上述实验
组的菌落生长良好 (图 3), 而 pGADT7-TiDPK1+
pGBKT7、pGADT7+pGBKT7-GAV-CP和 pGADT7+
pGBKT7-PAV-CP等对照菌株均未正常生长, 初步说
明 TiDPK1蛋白能够与 BYDV-GAV、-PAV的 CP互
作。将对照组和实验组的酵母分别涂布于含 X-α-gal
1724 作 物 学 报 第 39卷


的 YPD 固体培养基上, 结果对照组菌落无颜色变化,
而 pGADT7-TiDPK1+pGBKT7-GAV-CP与 pGADT7-
TiDPK1+pGBKT7-PAV-CP实验组菌落变蓝(实验 2 h
后开始变蓝, 6 h后深蓝), 进一步表明 TiDPK1在酵
母双杂交系统内与 BYDV-GAV和 BYDV-PAV的 CP
具有相互作用(图 3)。
2.3 BiFC分析 TiDPK1与 BYGA-GAV CP相互
作用
利用基因枪将 4 种组合质粒(pSYCE+pSYNE、
pSYCE+pSYNE-GAV-CP、pSYCE-TiDPK1+pSYNE、
pSYCE-TiDPK1+pSYNE-GAV-CP)共转化至洋葱表
皮细胞中, 瞬时表达。共聚焦荧光显微镜检测黄色
荧光信号。结果表明 , 共同转化 pSYCE-TiDPK1+
pSYNE-GAV-CP 的洋葱表皮细胞能表达 YFP 荧光
信号(图 4-A), 而三组对照质粒的洋葱表皮细胞在共
聚焦显微镜中检测不到 YFP 荧光信号(图 4-B, -C,
-D), 进一步证明 TiDPK1 与 BYDV-GAV-CP 能相互
作用。


图 3 酵母双杂交系统检验 TiDPK1与 BYGA-GAV CP/-PAV CP互作
Fig. 3 BYDV-GAV CP/-PAV CP interacts with TiDPK1 in the YTH system
1: 转化实验组质粒(pGADT7-TiDPK1+pGBKT7-GAV-CP, pGADT7-TiDPK1+pGBKT7-PAV-CP)的酵母在四缺营养选择培养基上生长良
好, 在 X-α-gal定性实验变蓝; 2和 3: 转化对照组质粒的酵母(pGADT7-TiDPK1+pGBKT7、pGADT7+pGBKT7-GAV-CP和
pGADT7+pGBKT7-PAV-CP)不能在四缺培养基上生长, 同时 X-α-gal定性实验无颜色变化。
1: Yeast colonies containing pGBKT7-CP/pGADT7-TiDPK1 grew well on SD/–Ade/–His/–Leu/–Trp medium and turned blue in X-α-gal
assays; 2 and 3: Yeast colonies containing controls plasmids unable to grow on SD/–Ade/–His/–Leu/–Trp medium and turned blue in X-α-gal
assays.


图 4 BiFC重组质粒共转化洋葱表皮细胞的共聚焦荧光及明场图像
Fig. 4 Fluorescence and merged with bright-field images for the indicated proteins transiently
expressing in onion epidermal cells
A: pSYCE-TiDPK1(CE-TiDPK1), pSYNE-GAV-CP(NE-CP); B: pSYCE-TiDPK1(CE-TiDPK1)+pSYNE(NE); C: pSYCE
(CE)+pSYNE-GAV-CP(NE-CP); D: pSPYNE(NE)+pSPYCE(CE).
第 10期 汪信东等: 抗小麦黄矮病相关蛋白激酶 TiDPK1与 BYDV外壳蛋白的互作 1725


3 讨论
植物在长期进化中形成精细的内在免疫系统 ,
以抵御入侵的病原微生物。植物通过细胞表面的
pattern recognition receptors (PRRs)感知保守的病原
相 关 分 子 (pattern-associated molecular patterns,
PAMPs), 诱导产生初级的主动防御反应——表型激
发免疫(PAMP-triggered immunity, PTI)。然而, 病原
微生物又进化出抑制植物 PTI 的方法, 如通过分泌
效应子(effector)到植物细胞内; 一旦病原获得抑制
植物初级防御的能力, 植物即发展出第二层免疫反
应—效应子激发免疫 (effector-triggered immunity,
ETI), 主要由 R 基因编码蛋白产物直接识别或间接
识别相应的病原微生物效应子 , 激活防御反应信
号、产生超敏反应和一系列防御反应物质, 最终产
生抗病性[23]。蛋白激酶作为识别病原 PAMPS 的受
体、辅助蛋白或传递信号的重要因子, 在植物抗病
防御反应中具有重要作用[24]。
张增艳课题组发现 TiDPK1 蛋白激酶, 分布于
细胞膜和细胞核中(待发表), 暗示其具备接收或传
递病原信号的潜能。BYDV CP为黄矮病毒感染小麦
的主要致病因子。因此, 研究 TiDPK1与 BYDV CP
之间的关系, 对研究 TiDPK1 的作用机制具有重要
意义。YTH技术在研究植物抗病基因与病原物互作
中被广泛应用。利用该技术已发现 Pto与 AvrPto [25]、
RRS1-R 全长蛋白与 PopP2 [26]及 RIN4 与 AvrB 或
AvrRpm1 [27]存在互作, RIN4与 AvrB或 AvrRpm1互
作为 RPM1 介导的抗病反应所必需[27]。尽管 YTH
具有操作简单、结果明显等优点, 但在实验中难以
彻底避免假阳性或假阴性结果, 因此相关结果常需
用其他技术的实验验证。近年来, BiFC 技术亦在植
物与病原物互作研究中被广泛应用。同时使用 YTH
系统和 BiFC系统, 能进一步降低假阳性, 为后续试
验提高可靠的依据。Bar 等[28]通过 YTH 及 BiFC 分
析, 证明 BAK1 与 LeEix1 互作, 在烟草及马铃薯中
促进了 LeEix2 对病原效应子 EiX 的反应 ;
Burch-Smith 等[29]通过 BiFC、细胞生物化学和免疫
共沉淀分析, 发现烟草抗病蛋白N与TMV病毒效应
子 p50 互作, 并进一步指明 N 蛋白中的 TIR亚结构
域是二者互作所必需的。Wang 等[30]通过 YTH 及
BiFC 等分析, 证明拟南芥抗病蛋白 RPW8.2 通过与
PAPP2C 互作, 进而防御白粉菌。本研究通过 YTH
证明 TiDPK1 能与 BYDV-GAV-CP、BYDV-PAV-CP
互作, 通过及 BiFC 系统进一步验证该实验结果。
BYDV 的 CP 是重要的致病因子, 本文通过 YTH 和
BiFC 实验证明 TiDPK1 可与 BYDV CP 互作, 为
TiDPK1抗 BYDV作用机制提供重要依据。
4 结论
酵母双杂交实验结果和双分子荧光互补实验结
果表明, TiDPK1 蛋白激酶能与 BYDV-GAV、-PAV
的 CP互作。

致谢: 感谢中国农业科学院植物保护研究所王锡锋
研究员和刘艳博士提供带 BYDV的蚜虫、中国科学
院植物研究所林金星教授惠赠 BiFC基础载体。
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