全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014, 40(9): 15791584 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由国家现代农业产业技术体系建设专项(CARS-3), 国家自然科学基金项目(31101146), 科技部农业科技成果转化基金
(2012C1001009), 江苏省科技支撑项目(BE2013439)和江苏省农业自主创新专项(cx132021)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 马鸿翔, E-mail: hxma@jaas.ac.cn
第一作者联系方式: E-mail: wo616543505@126.com
Received(收稿日期): 2013-11-25; Accepted(接受日期): 2014-06-16; Published online(网络出版日期): 2014-06-27.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20140708.1146.003.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2014.01579
以 EMS 诱变创制软质小麦宁麦 9 号高分子量谷蛋白亚基突变体
张纪元 张平平 姚金保 杨 丹 杨学明 马鸿翔*
江苏省农业科学院 / 江苏省农业生物学重点实验室, 江苏南京 210014
摘 要: 本研究旨在创制遗传背景一致的不同高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)缺失系, 为小麦品质研究和育种提供
材料。将软质小麦品种宁麦 9号, 用 0.4% EMS溶液处理 10 000粒种子, 获得 3781个 M1代单株, 采用“半粒法”对每
个株系进行 SDS-PAGE鉴定, 从中筛选出 299个(7.91%) HMW-GS突变株, 包括 HMW-GS缺失和分子量突变 2种类
型。其中, HMW-GS 缺失突变 176 株, 突变频率为 4.65%, 缺失亚基涉及 Ax1、Bx7、By8、Dx2 和 Dy12, 突变频率
为 0.24%~3.28%; 分子量突变 130 株, 突变频率为 3.44%。将突变体的具胚端种子于温室中繁殖获得 M2代, 再次鉴
定各株系的 HMW-GS, 并经 M3代验证, 最终获得 Ax1、Dx2、Bx7、By8 和 Dy12 缺失突变体, 及 Ax1+By8 双缺失
突变体。用高效液相色谱(HPLC)分析这些突变体的谷蛋白大聚体(GMP)和谷蛋白/醇溶蛋白(GLU/GLI)比值, 发现不
同缺失突变体的 GMP含量都有不同程度的降低, 尤以 Bx7亚基缺失突变体中 GMP含量降幅最大, 高达 42%。另外,
不同缺失突变体的谷蛋白总量和 GLU/GLI比值也低于对照, Ax1+By8双缺失突变体的 GLU/GLI比值最小。
关键词: 小麦; 甲基磺酸乙酯; 高分子量谷蛋白亚基; 谷蛋白大聚体
EMS Induced HMW-GS Mutants from Soft Wheat Ningmai 9
ZHANG Ji-Yuan, ZHANG Ping-Ping, YAO Jin-Bao, YANG Dan, YANG Xue-Ming, and MA Hong-Xiang*
Jiangsu Provincial Key Laboratory of Agrobiology / Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China
Abstract: The objective of this study was to create a series of deletion lines of high molecular weight-glutenin subunit (HMW-GS)
in similar backgrounds for wheat quality research and breeding. A total of 3781 M1 plants of Ningmai 9 (a soft wheat cultivar)
were obtained from 10 000 seeds induced by 0.4% ethyl methane sulfonate (EMS). The HMW-GS compositions of these plants
were identified via SDS-PAGE using half seed. Two hundred and ninety-nine lines with a mutation percentage of 7.91% were
found to be HMW-GS mutants, including HMW-GS deletion and molecular weight mutation. Among them, 176 lines were
HMW-GS deletion mutants, with a mutation percentage of 4.65% containing subunits Ax1, Bx7, By8, Dx2, and Dy12, with the
mutation percentages ranging from 0.24% to 3.28%. The mutants of molecular weight were 130 lines with a mutation percentage
of 3.44%. Each of the half M1 seed with embryo was used to produce M2 generation in greenhouse. Homozygous deletion lines of
HMW-GS Ax1, Dx2, Bx7, By8, Dy12, and Ax1+ By8 were detected using SDS-PAGE and confirmed in M3 generation. The con-
tent of glutenin macropolymer (GMP) and the ratio of glutenin-to-gliadin (GLU/GLI) ratio were determined using high perform-
ance liquid chromatography (HPLC). The results showed that all the deletion mutants had lower GMP contents than Ningmai 9,
particularly, the Bx7 deletion line had the reduced GMP content of 42%. The GLU/GLI ratio of the deletion lines was also smaller
than that of Ningmai 9, and the lowest GLU/GLI ratio was found in Ax1+ By8 deletion line.
Keywords: Wheat; EMS; High molecular weight glutenin subunit; Glutenin macropolymer
小麦是主要粮食作物之一, 品质改良是小麦育
种的重要目标。麦谷蛋白是贮藏蛋白的主要成分 ,
对小麦的加工品质影响很大。根据十二烷基硫酸钠
聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE), 麦谷蛋白可分为
高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)和低分子量谷蛋白
亚基(LMW-GS)。HMW-GS 虽然只占小麦贮藏蛋白
的 5%~10%, 但对小麦品质有重要影响, 并在很大
程度上决定加工品质。HMW-GS与面团流变学特性
1580 作 物 学 报 第 40卷
和加工品质的关系已有大量报道, 研究结果在小麦
育种中得到应用[1]。由于遗传背景对 HMW-GS基因
的表达有一定影响, 不同试验材料导致研究结果存
在一定差异。因此创制背景一致的近等基因系或单
一亚基缺失材料非常重要和必要, 目前亟待加强。
甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate, EMS)是
一种可直接作用于DNA鸟嘌呤引起点突变及染色体
损伤的化学诱变剂, 其诱变效果远远高于电离辐射
和自发诱变, 目前应用最广泛、效果最好。利用EMS
技术创制的突变体材料表现形态、生理、生化和抗
病性变异, 是研究基因及其功能的良好材料。在小
麦上, Feiz等[2]利用该技术创建了630株普通软质小
麦突变体库; 李卫华等 [3]研究了不同浓度EMS对新
春11主要农艺性状和抗病性的诱变效应; Kuraparthy
等 [4]利用二倍体小麦EMS突变体库, 对控制分蘖的
tin3基因进行了染色体定位 ; 崔秋华等 [5]用
0.05%~0.80% EMS处理春小麦长春1号和吉麦2号
幼穗, 发现染色体畸变率和微核率明显提高; 赵天
祥等 [6]用0.7%和1.2% EMS诱变偃展4110种子 , 在
M2代中发现了株高为10~15 cm的特矮变异 ; 徐艳
花等[7]用0.8% EMS处理豫农201, 从M2代中鉴定出
HMW-GS缺失1亚基、5亚基、7亚基和10亚基的突
变体。
宁麦 9 号由江苏省农业科学院以扬麦 6 号为母
本、日本品种西风为父本进行有性杂交, 采用改良
集团法选育而成 , 1997年通过江苏省品种审定, 是
江苏省农业科学院育成的优质高产抗病弱筋小麦品
种, 具有丰产性好、弱筋品质稳定、抗赤霉病和小
麦黄花叶病等特点, 而且其穗粒数、弱筋品质指标
和赤霉病抗性的一般配合力较高, 作为亲本已经育
成 12个小麦新品种。为了进一步利用该品种, 本研
究以 EMS 处理进行诱变, 对其后代进行 HMW-GS
突变体的筛选及谷蛋白质量分析 , 预测不同
HMW-GS 缺失对谷蛋白大聚体(glutenin macropoly-
mer, GMP)的影响, 为 HMW-GS 对弱筋品质形成效
应的研究以及弱筋小麦育种提供新的重要种质。
1 材料与方法
1.1 EMS最佳处理浓度筛选
取 1000粒完好的宁麦 9号种子, 用清水在室温
条件下浸种 18 h, 然后换 EMS-磷酸缓冲液缓慢振荡
12 h, 再用流水反复冲洗种子 12 h除去残余的 EMS。
EMS 溶液(w/v)梯度为 0.2%、0.4%和 0.6%; 磷酸缓
冲液(pH 7.0)含 0.1 mol L–1 Na2HPO412H2O 和 0.1
mol L–1 NaH2PO42H2O。将种子晾干后置铺有滤纸的
培养皿中, 保持滤纸湿润, 放入 20℃光照培养箱中,
3 d后统计发芽率, 2次重复。以未处理宁麦 9号种
子为对照。
1.2 EMS诱变突变体库的建立及加代繁殖
用最佳浓度 EMS处理 10 000粒种子, 经冲洗晾
干后于 2010年 10月 27日播于江苏省农业科学院试
验地, 株距 0.05 m, 行距 0.23 m, 常规管理, 成熟后
收获 M1单株种子。采用“半粒法”将含胚的单粒 M1
种子播于温室中, 获得 M2代, 继续采用单株种植获
得 M3代种子。
1.3 HMW-GS鉴定及 GMP检测
从每个M1单株取一粒种子, 切下不含胚的一半,
采用 SDS-PAGE 方法[8-9]鉴定 HMW-GS。经鉴定确
认的突变材料 , 对其 M2 代种子用相同方法进行
HMW-GS鉴定。
取单株种植的 M3 代种子, 采用高效液相色谱
(HPLC)方法[10]检测 GMP, 测定 GMP含量和谷蛋白/
醇溶蛋白比值。
利用 SAS9.0软件作方差分析。
2 结果与分析
2.1 最佳 EMS处理浓度筛选
EMS浓度对宁麦 9号的种子发芽率有显著影响,
随 EMS 浓度提高, 发芽率和相对致死率升高, 浓度
0.4%接近半致死剂量(表 1)。用 0.4% EMS溶液处理
10 000粒种子, 获得M1代 3781单株, 由此建立了宁
麦 9号突变体库。田间调查表明, 200个对照行的平
表 1 不同浓度 EMS 诱变处理的种子发芽率
Table 1 The percentages of seed germination affected by
different concentrations of EMS
EMS浓度
EMS concentration
发芽率
Germination rate
(%)
相对致死率
Relative lethal ratio
(%)
对照 Control 91.0 a 0
0.2% 56.6 b 37.8
0.4% 45.6 bc 49.9
0.6% 33.6 c 63.1
以不加 EMS 处理为对照。每个 EMS 浓度处理 1000 粒种
子, 发芽率 = 发芽种子数 /种子总数 100, 相对致死率 = 1 –
(处理发芽率 / 对照发芽率)。发芽率后不同字母表示处理间有显
著差异(P < 0.05)。
EMS-free solution was used as the control. Each treatment
induced 1000 seeds. Germination rate = number of seeds germi-
nated / total seed number 100; Relative lethal ratio = 1 – (germina-
tion rate of treatment / germination rate of control). Germination rates
followed by different letters are significantly different at P < 0.05.
第 9期 张纪元等: 以 EMS诱变创制软质小麦宁麦 9号高分子量谷蛋白亚基突变体 1581
均田间出苗率为 80%, 按成苗率计算, 0.4% EMS处
理的致死率为 52.7%。因此 0.4%为最佳处理浓度。
2.2 宁麦 9号突变体的 HMW-GS鉴定
2.2.1 M1代 HMW-GS 突变筛选 SDS-PAGE 检
测表明, 宁麦 9号的HMW-GS组成为(1, 7+8, 2+12)。
在 3781个M1单株中共检测到 7种 HMW-GS突变类
型, 包括单亚基缺失的 Ax、Bx、By、Dx 和 Dy 缺
失型及双亚基缺失的Bx+By和Ax+By缺失型(图 1)。
图 1 以 SDS-PAGE 检测 M1 代 HMW-GS 缺失突变体
Fig. 1 HMW-GS mutant detection of M1 plants using
SDS-PAGE
A图为第 3089至第 3100号单株, 其中第 9泳道为 Bx+By双缺
失, 第 10泳道为 Ax缺失; B图为第 37至第 51号单株, 其中第
11泳道为 Ax+By双缺失, 第 14泳道为 By分子量突变。
Panel A shows the SDS-PAGE result of lines from 3089 to 3100
plants, including Bx+By deletion (lane 9) and Ax deletion (lane 10).
Panel B shows the SDS-PAGE result of lines from 37 to 51 plants,
including Ax+By deletion (lane 11) and molecular weight mutant of
HMW-GS By (lane 14).
突变体库中 HMW-GS 缺失突变单株共 299 个,
突变频率为 7.91%。其中 HMW-GS分子量改变的材
料(包括 3 份同时含 Ax 缺失的突变体)130 份, 突变
频率为 3.44%。在 172个(突变频率 4.55%) HMW-GS
缺失突变体中, Ax1亚基缺失频率最高, 共 124份(包
括 3份 Ax缺失+分子量突变及 3份 Ax+By双缺失),
突变频率为 3.28%; 其他 HMW-GS缺失突变型都低
于 15份, 突变频率低于 0.4%, 尤以双缺失突变型最
少(表 2)。
2.2.2 M2代 HMW-GS 分析 由 M1代 HMW-GS
缺失突变体种子加代获得的 M2 代种子 , 经 SDS-
PAGE 检测, 仅发现 25 个株系在 B、D 位点控制的
HMW-GS有缺失突变, 部分M1突变株系在M2代恢
复正常, 表明部分 M1 代的突变体株系不能稳定遗
传。M2代鉴定的 Ax1、Bx7、By8、Dx2、Dy12 单
亚基缺失及Ax1+By8双亚基缺失突变株系能够稳定
遗传至 M3代, 且 M3代基因型纯合(图 2)。
表 2 高分子量谷蛋白亚基突变体数目及频率
Table 2 The number and percentage of mutants on HMW-GS
突变类型
Type of mutant
株数
No. of plants
突变频率
Mutation ratio (%)
HMW-GS缺失 HMW-GS deletion
Ax 118 3.12
Bx 13 0.34
By 11 0.29
Dx 14 0.37
Dy 9 0.24
Ax+By 3 0.08
Bx+By 1 0.03
分子量突变 Molecular weight (MW) mutant
127 3.36
复合型 Compound
Ax缺失+分子量突变
Ax deletion + MW mutant
3 0.08
总计 Total 299 7.91
图 2 以 SDS-PAGE 检测 M2 代 HMW-GS 缺失突变体
Fig. 2 HMW-GS mutant of M2 lines detected using SDS-PAGE
CK: 宁麦 9号; 1: Ax1缺失突变体; 2: Dx2缺失突变体; 3: Bx7缺
失突变体; 4: By8缺失突变体; 5: Dy12缺失突变体; 7: Ax1+By8
双缺失突变体。
CK: Ningmai 9; 1: Ax1 deletion mutant; 2: Dx2 deletion mutant;
3: Bx7 deletion mutant; 4: By8 deletion mutant; 5: Dy12 deletion
mutant; 7: Ax1+By8 deletion mutant.
2.3 M3代 HMW-GS缺失突变体的 GMP分析
不同 HMW-GS 缺失突变体间及其与对照间的
GMP 含量及 GLU/GLI 比值差异显著 , 各突变体
Ax、Dx、Bx、By、Dy和 By+Dy缺失突变体的 GMP
含量分别比对照宁麦 9 号低 9.18%、14.69%、
17.79%、9.76%、14.86%和 13.8%, 以 Bx缺失突变
体的降低量(14.69%)和降低百分率(42%)最大 , Dy
和 Dx缺失突变体其次, Ax和 By缺失突变体降幅最
小。由于编码 HMW-GS 亚基的缺失, 导致谷蛋白
1582 作 物 学 报 第 40卷
总量的减少, 最终不同缺失突变体的 GLU/GLI 明
显降低, Bx缺失类型的 GLU/GLI比仅为 1.07 (表 3)。
值得一提的是, Ax+By 双缺失系的 GMP 降幅并非
最大, 可能在这些缺失突变体中, 除 HMW-GS 缺
失外, 还有其他影响谷蛋白和醇溶蛋白合成、翻译
的相关基因突变。
表 3 HMW-GS 缺失突变体谷蛋白组成差异
Table 3 Variations of glutenin in HMW-GS deletion mutants
HMW-GS缺失突变体
HMW-GS deletion mutant
GMP含量
GMP content (%)
GMP降低量
GMP reduction (%)
GMP降低百分率
GMP reduction percentage (%)
谷蛋白/醇溶蛋白比值
GLU/GLI ratio
对照 CK 42.72 a — — 1.26
Ax 33.54 b 9.18 21 1.17
Dx 28.03 bc 14.69 34 1.11
Bx 24.93 c 17.79 42 1.07
By 32.96 b 9.76 23 1.17
Dy 27.86 bc 14.86 35 1.14
Ax+By 28.86 bc 13.86 32 1.00
对照: 宁麦 9号; GMP: 谷蛋白大聚体。GMP含量数据后不同字母表示不同突变体间存在显著差异(P < 0.05)。
CK: Ningmai 9; GMP: glutenin macropolymer. GMP contents followed by different letters are significantly different at P < 0.05.
3 讨论
麦谷蛋白是小麦籽粒贮藏蛋白的主要成分, 对
加工品质起重要作用。高分子量麦谷蛋白是小麦种
子贮藏蛋白的重要组成部分, 其数量和质量对小麦
面筋含量及面粉烘烤品质有直接影响。因此, 小麦
高分子量麦谷蛋白基因的表达和沉默备受关注[11]。
利用同一品种诱变产生高分子量谷蛋白亚基缺失系,
可以克服不同品种遗传背景对实验结果的影响, 同
时可以为小麦品质育种提供新的种质资源。EMS因
其突变效率高、频率高和范围广等优点广泛用于农
作物化学诱变[12], 一般使用半致死剂量作为最佳处
理浓度[11]。在已报道的 EMS诱变小麦构建突变体库
试验中, 小麦品种各不相同, EMS 处理浓度差异也
很大, 有的用 0.3% [13], 有的用 0.8% [7], 还有的用
1.2% [6]。本研究设计了 3个 EMS浓度梯度, 通过发
芽率试验和田间出苗率验证, 认为 0.4%是最佳处理
浓度, 其种子发芽的致死率为 49.9%, 成苗的致死
率为 52.7%, 接近半致死剂量。用该浓度 EMS 诱变
宁麦 9号 10 000粒种子, 得到包含 3781个株系的突
变库。由此可见, 不同小麦品种对 EMS敏感程度各
异, 实际操作中有必要针对不同品种摸索最佳处理
浓度。
利用 EMS诱变构建突变体库, 其大小与目的基
因大小有关。Feiz 等[14]发现小麦每隔 12 kb 就会有
一个突变体产生; Slade 等 [15]报道普通小麦平均每
24 kb就有一个点突变出现, 而硬粒小麦每 40 kb有
一个点突变。本研究构建的突变体库包含 3781个突
变株系, 编码 7、8、2、12各亚基的基因分别为 2388、
2163、2508和 1977 bp, 根据 Feiz等[14]和 Slade等[15]
推算的突变频率, 该突变体库的大小不仅可满足对
HMW-GS 研究的需要, 而且可用于其他基因研究。
徐艳花等[7]用 0.8% EMS 室温下诱变豫农 201 种子
12 h, 从 930个株系中鉴定出 HMW-GS缺失突变株系
21 个, 突变频率 2.26%。本研究从 3781 个突变株系中
检测到 299个 HMW-GS突变株系, 突变频率为 7.91%,
其中含有缺失突变的株系为172个, 突变频率为4.55%。
突变频率的差异可能与品种等因素有关。
麦谷蛋白在面筋中以聚合体形式存在, 谷蛋白
聚合体在非解离状态下由一系列大小不同的聚合体
组成, 在 SDS 缓冲液中可分为可溶性和不溶性谷蛋
白聚合体两类, 它们分别决定面团的延伸性和弹性,
两种聚合体的分子量和粒度大小显著不同[14], 其中
不溶性谷蛋白分子量较大, 即 GMP, 其含量与面团
形成时间、面团最大抗延阻力、和面仪参数等显著
相关[17-18]。不同粒度的 GMP均由 HMW-GS和低分
子量谷蛋白亚基 (LMW-GS)组成 , 但 GMP 中
HMW/LMW比值较高[19-21]。因此, HMW-GS作为谷
蛋白聚合体中的骨架, 其缺失会直接导致谷蛋白聚
合体分子量的降低, 最终降低 GMP含量。研究表明,
GMP 总的 x/y-HMW 比例较低 , 谷蛋白聚合体中
HMW-GS和 y-HMW的相对含量提高时, GMP含量
增加, 面筋强度加大[22-24]。我们构建的突变体库涉
及 5个HMW-GS缺失, 所有缺失突变体都导致GMP
含量显著降低。由于 HMW-GS 的 5 个亚基中 X 型
亚基数量显著大于 Y型亚基, 其中 Bx含量最高, 因
第 9期 张纪元等: 以 EMS诱变创制软质小麦宁麦 9号高分子量谷蛋白亚基突变体 1583
此 Bx 缺失突变体导致 GMP 含量和 GLU/GLI 比值
降低最多, 这可能有利于提高弱筋小麦加工品的质
量。然而, 本研究仅考虑了 HMW-GS 5个位点的缺
失, 未分析 LMW-GS以及影响谷蛋白表达的其他基
因及加工品质, 这 5种缺失类型与GMP和GLU/GLI
比值的关系, 及对面粉及加工品质的影响仍需进一
步探讨。此外, 本研究获得的含有不同谷蛋白亚基
缺失突变的突变材料可作为育种材料直接利用, 也
可通过彼此之间获得不同亚基组合的突变富集, 再
应用于育种。
4 结论
0.4% EMS处理种子 12 h是诱变弱筋小麦品种
宁麦 9号的最适浓度。用此方法处理 10 000粒种子,
获得包含 3781株的突变体库, 对 M1、M2和 M3代进
行 SDS-PAGE 检测, 获得遗传稳定、基因型纯合的
Ax1、Bx7、Bx8、Dx2、Dx12 单缺失及 Ax1+By8
双缺失的 HMW-GS 突变体 , 不同缺失突变体的
GMP 含量和 GLU/GLI 比值均比宁麦 9 号有不同程
度的降低。
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