全 文 ：武汉植物学研究 2000, 18 (3) : 224～ 228
J ourna l of W uhan B otan ica l Resea rch
超薄平板微型聚丙烯酰胺凝胶的
等电聚焦电泳方法
——介绍一种高效、快速的生物同工酶分析方法Ξ
黄宏文
(中国科学院武汉植物研究所　武汉　430074)
提　要　介绍了一种简易、高效、快速的生物同工酶分析方法——超薄平板微型聚丙烯酰胺
凝胶的等电聚焦电泳方法。该方法与目前国内外市场销售的同种用途等电聚焦的产品 (如
B IO 2RAD 公司的model 111 M in i IEF Cell) 相比, 具有以下优点: 实验操作灵活, 用途更广;
谱带清晰; 每次可实验的样本量大; 电泳所需时间短; 实验费用低; 适用于多种酶系统的同工
酶和等位酶分析; 凝胶干燥不需任何设备且能长期保存; 样本用量少。
关键词　凝胶电泳, 等电聚焦, 同工酶
中图分类号: O 657. 15; Q 55　文献标识码: A 　文章编号: 10002470X (2000) 20320224205
UL TRA -TH IN SLAB IEF-PAGE M ETHOD
——A EFFECTIVE B IO -ANALY TIC M ETHOD FOR ISOZYM E ANALY SIS
H uang Hongw en
(W uhan Institu te of B otany , T he Ch inese A cad emy of S ciences　W uhan　430074)
Abstract　T he paper in troduces a simp le, efficien t and fast b io2analytic m ethod fo r isozym e
analysis: u ltra2th in slab IEF2PA GE system. In comparison w ith o ther comm ercia l p roducts
( such as B IO 2RAD model 111M in i IEF cell, etc. ) , the system has m any advan tages: (1)mo re
flex ib ility in app licat ions; (2)w ider range of app licat ions; (3) h igher reso lu tion separat ions;
(4) larger capacity of runn ing samp les; (5) sho rter t im e fo r electropho resis; (6) low er co st; (7)
su itab le fo r various enzym e system s; and (8) no need fo r gel2drying.
Key words　Gel electropho resis, Isoelectripho resis focusing, Isozym es
同工酶电泳自 1957 年H un ter 和M arket 采用酶的催化特异性并以组织化学染色在
电泳凝胶上显示酶带以来, 已经成为非常有效的实验方法, 广泛地应用于生物学研究的各
个领域。尤其近 30 年来, 应用同工酶电泳技术在评价居群的遗传多样性、估测基因流、分
析杂交频率、确立物种界线、研究系统发育关系等诸多方面的研究进展, 使我们对生物微
观和宏观进化的过程有了进一步的认识〔1〕。虽然, 最近各种分子生物学技术及研究方法有
了长足发展, 但同工酶电泳方法随着自身技术改进和应用方法的创新, 仍然是目前生物学
研究各领域的重要实验工具之一。这里介绍一种自制简易的聚丙烯酰胺凝胶的等电聚焦Ξ 收稿日: 1999204220, 修回日: 1999206222。第一作者: 男, 1957 年生, 博士, 研究员, 从事植物遗传育种方面研究。
电泳方法, 特别适用于大批量样本的居群遗传多样性等群体生物学领域的研究。
1　方法的来源及特点
该方法最初来自M u lcahy 等〔2〕在研究南瓜属花粉中酸性磷酸酶时描述的基本实验
方法, 经过多年试验改进而来。该方法与目前国内外市场销售的同种用途等电聚焦的产品
(如B IO 2RAD 公司的model 111M in i IEF Cell)相比, 具有以下优点: ①实验操作灵活, 用
途更广; ②谱带清晰〔3, 4〕; ③每次可实验的样本量大 (每次至少 80～ 100 个样本) ; ④电泳所
需时间短 (1125 h) ; ⑤实验费用低 (每个样本费用仅为B IO 2RAD 公司的model 111 M in i
IEF Cell 方法的 1ö20 或更低) ; ⑥适用于多种酶系统的同工酶和等位酶分析; ⑦凝胶干燥
不需任何设备且能长期保存; ⑧样本用量少。
2　超薄平板微型聚丙烯酰胺凝胶的等电聚焦电泳方法
电极模块可按图 1 所示用有机玻璃块自制, 安上铂金丝和与电泳仪相接的导线插口。
塑料间隔片规格约为 0. 4 mm ×5 mm ×95 mm (可用文具小尺片裁剪而成)。垫片为
GelBond 胶片或任何光滑胶片。玻片为 1 mm ×50 mm ×75 mm 的显微镜用载玻片 (或其
他自切玻片) , 需做亲水处理以使凝胶与玻片粘牢, 其程序为: 将蒸馏水用 10% 柠檬酸调
至 pH
= 315, 按每 100 mL 水加入 600 ΛL Silane A 174 (F isher 公司)配成溶液, 充分搅匀 (搅 30
m in) ; 将玻片浸泡其中 30 m in, 蒸馏水中过一次后, 风干, 避光保存 (可成批处理玻片)。
211　电泳装置 (见图 1)
图 1　电泳装置示意图
F ig11　D iagram of apparatus of electopho resis
522　第 3 期　　　　　　　　　黄宏文: 超薄平板微型聚丙烯酰胺凝胶的等电聚焦电泳方法
2. 2　凝胶配方 (见表 1)
表 1　等电聚焦聚丙烯酰胺凝胶的配方
T able 1　 IEF po lyacrylam ide gel fo rm ula
凝胶组分储备液
Gel stock so lu tion
溶液浓度
Concen tration
凝胶配法 (所需容量)
Gel fo rm ula (vo l. )
1 块胶
1 gel
2 块胶
2 gels
3 块胶
3 gels
4 块胶
4 gels
丙烯酰胺及双丙烯酰胺储备液
A cryl. + B IS stock
4. 75 g 丙烯酰胺加 0. 25 g 甲叉
双丙烯酰胺溶于 10 mL 水 275 ΛL 550 ΛL 825 ΛL 1 100 ΛL
四甲基乙二胺
T EM ED 0. 20 mL 原液溶于 10 mL 水 50 ΛL 100 ΛL 150 ΛL 200 ΛL
过硫酸铵
Ammonium persu lfate 0. 025 g 溶于 10 mL 水 275 ΛL 550 ΛL 825 ΛL 1 100 ΛL
两性电解质
Ampho lytes
pH 4～ 9 原液或其它 pH 范围配
比液 150 ΛL 300 ΛL 450 ΛL 600 ΛL
蒸馏水W ater 1. 25 mL 2. 5 mL 3. 75 mL 5. 0 mL
2. 3　形成凝胶 (见图 2)
图 2　形成凝胶示意图
F ig12　D iagram of casting gel
将 GelBond 胶片疏水面朝上平放在实验台, 按玻片宽度放好塑料间隔片, 盖上玻片。
将组成凝胶的凝胶试剂按配方充分混合均匀, 用移液管将混合液缓慢滴入玻片与
GelBond 胶片之间, 液体的表面张力和间隙的毛细管作用会使液体扩散至整个玻片; 滴入
时应注意避免气泡的产生; 如有气泡时, 可用塑料隔片将气泡导出。形成凝胶因温度不同
约需 20 m in 至 1 h。可以观察玻片四周是否有折射光线显出的凝胶轮廓, 一旦显现时表明
凝胶聚合已形成并粘合固定在玻片上, 将玻片与 GelBond 胶片分开即可。
2. 4　制样及上样
由于是超薄凝胶样品需要量很少, 一般只需 50～ 100 m g 鲜样加 200～ 300 ΛL 提取缓
冲液〔5〕研磨至匀浆, 用吸管转到 Eppedo rf 1. 5 mL 离心管, 以 5 000 röm in 离心 5 m in, 上
清液即为上样电泳样品液。
将W hatm an 3 号滤纸剪成 1mm ×2 mm 大小用作上样沁子。用尖头镊子将沁子靠近
提出液吸透酶提取的上清液后, 平放在距凝胶一端约 5 mm 处即可 (+ 极或- 极端, 因研
究的酶的等电点而不同) ; 电泳开始后 (50 V ) , 沁中的酶蛋白及其它带电的大分子会进入
凝胶内的电场。一般每块胶可上样 20 至 25 个, 上样时应注意沁子之间距离适当、排列整
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齐, 这样可使最终染色后的谱带整齐。
215　电泳
在凝胶的两端各放上一条 8 mm ×95 mm 滤纸条, 滤纸条的边紧挨凝胶的端边 (但滤
纸条不能叠摞在胶上)。用移液管在正极端滤纸滴透pH = 4 的 T ris 缓冲液, 负极端滴透
pH = 9 的 T ris 缓冲液 (两极的缓冲液因凝胶设定的pH 范围而定)。将电极模块放在滤纸
条上, 使铂金丝紧贴滤纸并使滤纸中的缓冲液饱和铂金丝 (必要时可沿模块两端滴加缓冲
液)。电泳程序为: 电压 50、100、200、300 和 400 V 各 15 m in。电泳完成后就可以根据不同
的研究目的进行各种同工酶的染色〔5〕, 由于是超薄微型凝胶, 可大大节省染色试剂用量,
且电泳结果所得谱带清晰 (见图 3)。
1. 栗属植物苹果酸酶; 2. 栗属植物莽草酸脱氢酶; 3. 美洲泡泡果属磷酸葡萄糖异构酶;
4. 美洲泡泡果属还原型辅酶 I心肌黄酶; 5. 猕猴桃属过氧化物酶; 6. 猕猴桃属酯酶
1. M alic enzym e in genus Castanea; 2. Sh ik im ate dehydrogenase in genus Castanea;
3. Pho sphogluco isom erase in genus A sim ina; 4. NADH 2diapho rase in genus A sim ina;
5. Perox idase in genus A ctin id ia; 6. E sterase in genus A ctin id ia
图 3　超薄平板聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳方法的几种植物的同工酶谱带
F ig13　 Isozym e banding patterns of several p lan t species by u ltra2th in slab IEF2PA GE m ethod
　
该方法除了电泳仪外, 其他部件均自己制做, 运用非常灵活; 而且如通过并联的方式
与电泳仪相接, 实际上一次可以分析 100 个以上的样品, 所以很适用于群体生物学方面的
大批量样本的分析。
722　第 3 期　　　　　　　　　黄宏文: 超薄平板微型聚丙烯酰胺凝胶的等电聚焦电泳方法
　　致谢　美国麻省大学M ulcahy 教授对本人在方法的改进研究中曾提供大量的帮助; 美国奥本大学
Fenny D ane 博士在同工酶电泳方面曾提供过许多有益的建议; 本所雷一东帮助绘图; 在此一并致谢。
参　考　文　献
1　M urphy R W , Site J W , Buth J r D G et a l. P ro teins: isozym e electropho reis. In: H illis D M ,M o rizt C,M able B K
eds. M o lecu lar System atics. Sunderland M A : Sinauer A ssociate, Inc. , 1996.
2　M ulcahy D L , Robinson R W , Ihara M et a l. Gam etophytic transcrip tion fo r acid pho sphatase in po llen of Cucu rbita
species hybrids. J H ered , 1981, 72: 353～ 354
3　H uang H (黄宏文) ,D ane F, N o rton J D. Genetic analysis of 11 po lymo rph ic isozym e loci in chestnu t species and
characterization of chestnu t cu lt ivars by m ulti2locus allozym e geno types. J A m er S oc, H ort S ci, 1994, 119: 840～
849
4　H uang H (黄宏文) ,D ane F,W ang Z et a l. Isozym e inheritance and variation in A ctin id ia. H ered ity , 1997, 78: 328～
336
5　So ltis D E, So ltis P S. Isozym es in p lan t b io logy. Po rtland, OR: D io sco rides P ress, 1989. 5～ 33
822 武 汉 植 物 学 研 究　　　　　　　　　　　　　　　第 18 卷