全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2015, 41(2): 240250 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家现代农业产业技术体系建设专项(CARS-23), 国家自然科学基金项目(31100504, 31170624, 30901159), 浙江省自然科学
基金项目(Y3100291)和国家科技支撑计划项目(2011BAD01B01)资助。
 通讯作者(Corresponding author): 陈亮, E-mail: liangchen@mail.tricaas.com
第一作者联系方式: E-mail: malei220@mail.tricaas.com, Tel: 0571-86650417
Received(收稿日期): 2014-06-18; Accepted(接受日期): 2014-09-30; Published online(网络出版日期): 2014-11-18.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20141118.1702.001.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2015.00240
茶树叶绿素合成相关基因克隆及在白叶 1号不同白化阶段的表达分析
马春雷 1,2 姚明哲 1 王新超 1 金基强 1,2 马建强 1 陈 亮 1,*
1 中国农业科学院茶叶研究所 / 国家茶树改良中心 / 农业部茶树生物学与资源利用重点实验室, 浙江杭州 310008; 2 中国农业科学
院研究生院, 北京 100081
摘 要: 高等植物叶绿素的生物合成对其正常光合作用起关键作用。本文根据前期芯片杂交结果, 采用 RT-PCR 和
RACE 技术克隆了 3 个茶树叶绿素合成相关基因, 分别为谷氨酸-tRNA 还原酶基因(CsGluTR)、叶绿素合酶基因
(CsChlS)、叶绿素酸醋氧化酶基因(CsCAO), 对应的 GenBank 的登录号分别为 HQ660371、HQ660370、HQ660369。
序列分析表明, CsGluTR基因全长 2165 bp, 开放阅读框长 1665 bp, 编码 554个氨基酸, 推测的蛋白分子量约为 60.6
kD, 理论等电点为 8.78; CsChlS基因全长 1463 bp, 其中开放阅读框长 1125 bp, 编码 374个氨基酸, 推测的蛋白分子
量约为 40.5 kD, 理论等电点为 8.58; CsCAO基因全长 2146 bp, 其中开放阅读框长 1611 bp, 编码 536个氨基酸, 推测
的蛋白分子量约为 60.8 kD, 理论等电点为 8.03。比对分析表明, 3个基因编码的氨基酸序列与其他植物中同源基因的
相似性均在 70%以上。利用荧光定量 PCR技术检测 3个基因在不同白化阶段的表达, 表明 CsChlS和 CsCAO基因具
有明显的表达协同性, 它们在叶片中的表达量与叶片的颜色变化高度同步; 而 CsGluTR 在白化叶片和正常叶片中的
表达差异相对较小, 同时在新生芽叶转绿过程中最先恢复正常表达水平。说明在白化叶片中, 叶绿素的合成机制受到
较大影响, 叶绿素合成受阻导致的叶片内色素类物质含量降低或消失是叶片白化的直接原因。
关键词: 茶树; 谷氨酸-tRNA还原酶; 叶绿素合酶; 叶绿素酸醋氧化酶; 基因克隆; 表达分析
Cloning and Expression of Three Genes Involved in Chlorophyll Biosynthesis
at Different Albescent Stages of Tea Plant Variety “Baiye 1”
MA Chun-Lei1,2, YAO Ming-Zhe1, WANG Xin-Chao1, JIN Ji-Qiang1,2, MA Jian-Qiang1, and CHEN Liang1,*
1 Tea Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences / National Center for Tea Improvement / Key Laboratory of Tea Biology and
Resources Utilization, Ministry of Agriculture, Hangzhou 310008, China; 2 Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing
100081, China
Abstract: Chlorophyll is one of the main pigments participating in photosynthesis in plant chloroplasts, and its biosynthesis is
crucial for higher plant. In this article, we cloned and characterized three important genes involved in the biosynthesis of chloro-
phyll which were CsGluTR, CsChlS, and CsCAO (GenBank accession number HQ660371, HQ660370, and HQ660369) lead on
the results of cDNA microarray hybridization. The full-length cDNA of CsGluTR was 2165 bp, containing a 1665 bp ORF encod-
ing a 554 amino acids protein, and its 3′ untranslated region had an obvious polyadenylation signal. The deduced protein molecu-
lar weight was 60.6 kD and its theoretical isoelectric point was 8.78. The obtained cDNA of CsChlS was 1463 bp in length, con-
taining a 1125 bp ORF which encoded 374 amino acid residues. The deduced protein molecular weight was 40.5 kD and its theo-
retical isoelectric point was 8.58. The full-length of CsCAO was 2146 bp, containing a 1611 bp ORF encoding a 536 amino acids
protein. The deduced amino acid sequence of CsGluTR, CsChlS, and CsCAO from tea plant shared high identity with those of
other species, for instance the similarity of 79%, 90%, and 77 % with Vitis vinifera, respectively. The result of Real-time RT-PCR
analysis showed a coordinated expression of CsChlS and CsCAO, which was corresponded with the change of the albino pheno-
type. However, there were small changes in the expression level of CsGluTR between the normal and albino leaves. These results
implied that the biosynthesis of chlorophyll is completely hindered in albino leaves, causing the decline of pigment content and
第 2期 马春雷等: 茶树叶绿素合成相关基因克隆及在白叶 1号不同白化阶段的表达分析 241


the albino phenotype.
Keywords: Tea plant (Camellia sinensis); Glutamyl-tRNA reductase; Chlorophyll synthase; Chlorophyllide a oxygenase; Gene
cloning; Expression analysis
叶绿素是光合作用的主要色素之一, 也是大多
数植物叶片呈现绿色的主要原因。高等植物叶绿体
中, 从 L-谷氨酞-tRNA 开始, 经多步酶促反应最后
形成叶绿素 a和叶绿素 b, 涉及 15种酶、20多个基
因[1-2]。一般可将其整个生物合成过程大致分为 4个
阶段, 由谷氨酸生成 δ-氨基酮戊酸、叶绿素合成开
始、由 δ-氨基酮戊酸合成原卟啉 IX、在镁离子螯合
酶的作用下原卟啉 IX与Mg2+结合生成镁原卟啉 IX,
再经过酶促反应合成叶绿素酸酯, 进而生成叶绿素
a, 同时进行叶绿素 a和叶绿素 b的相互转化。在这
一复杂而保守的过程中, 任何一个基因的突变都可
能严重影响叶绿素合成的效率, 从而表现出不同的
叶色变异[3]。叶色变异是高等植物中突变频率较高
且易于鉴定的突变性状, 迄今为止, 在水稻、小麦、
大麦、玉米、大豆、棉花、烟草、玉米、向日葵、番
茄、黄瓜、马铃薯、桑树等几乎所有高等植物中都发
现了叶色突变体[4-8]。常见的叶色突变类型主要表现为
黄化、浅绿、深绿、白化、白绿条纹和黄绿条纹等[9]。
通常情况下, 叶绿素含量下降会对作物品质产
生负面影响, 有些甚至会导致植株死亡, 但在茶树
中, 由于以白化或黄化突变体为原料制作的茶样具
有更高的氨基酸含量和更优异的外形, 从而使其经
济价值更高, 如白叶 1号(安吉白茶)、安吉黄茶、景
宁白茶、中黄 1号(天台黄)等白化或黄化品种已成为
当地茶农增收的重要途径。特别是白叶 1 号, 在安
吉县的种植面积已达 6700 公顷、产量 1300 吨、产
值 14.5 亿元[10]。近十多年, 科研人员已从生理学、
生物化学、细胞学等多方面对其叶片白化的机制进
行了研究, 并取得了很大的进展, 但仍未解开引起突
变表型的核心分子机制[11-13]。本课题组在前期进行白
叶 1号不同白化阶段的芯片杂交实验时, 筛选到了一
批可能与其白化表型相关的差异表达基因, 其中包
括多个叶绿素合成途径的催化酶[14]。本研究在此基础
上, 采用 RT-PCR和 RACE技术克隆了其中 3个基因
的全长序列, 并对其表达情况进行了分析, 该研究结
果将为揭示白叶 1号的白化机制提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料采集及 RNA提取
以种植于国家种质杭州茶树圃的白叶 1 号为试
验材料, 采集其春季不同白化阶段的一芽二叶, 以
及一芽五叶的不同部位叶片(一芽一叶、第二叶、第
三叶、第四叶和第五叶), 液氮速冻后, 于–80℃冰箱
保存备用。随后采用植物总 RNA 快速提取试剂盒,
按说明书提取白叶 1号所有样本的总 RNA。用微量
紫外检测仪 NanoDrop 1000 (Pittsburgh, PA, USA)测
定 RNA 样品浓度, 1.2%变性琼脂糖凝胶电泳检测
RNA质量。
1.2 全长基因克隆及序列分析
利用 NCBI 上的 BlastX 软件分别对芯片筛选出
的茶树谷氨酸-tRNA 还原酶(glutamyl-tRNA reduc-
tase, CsGluTR)、叶绿素合酶 (chlorophyll synthase,
CsChlS)和叶绿素酸醋氧化酶(chlorophyllide a oxy-
genase, CsCAO) 3个基因片段进行序列同源比对。同
其他植物相比, 本实验室通过前期转录组测序获得
的 3 个基因序列均是基因的中间片段, 缺少基因的
3′端和 5′端[15]。因此根据基因的已知片段, 设计 12
条嵌套的基因特异引物(表 1), 并参照 Clontech公司
的 SMART RACE cDNA Synthesis Kit试剂盒说明书,
将提取的白叶 1 号一芽二叶新梢总 RNA 反转录为
cDNA, 以稀释 10 倍的 cDNA 为模板进行 PCR, 反
应体系中 10×PCR buffer (Mg2+ plus) 2 μL, 10 mmol
L–1 dNTPs各 0.4 μL, 模板 cDNA 0.4 μL, PCR特异引
物和通用引物(10 pmol μL–1)各 0.2 μL, Taq DNA聚
合酶(5 U μL–1) 0.2 μL, 加水至终体积 20 μL, 反应在
ABI Veriti Thermal Cycler 型 PCR 仪(Applied Bio-
systems, California, USA)上进行, 反应条件为 94℃预变
性 3 min; 94℃变性 45 s, 54℃复性 45 s, 72℃延伸 45
s, 35个循环, 最后 72℃再延伸 5 min。PCR产物经
蒸馏水稀释 10倍, 取 0.4 μL作为模板, 以每个基因
的第 2轮引物和通用引物再次进行 PCR扩增。反应
条件除退火温度升至 60℃以外, 其他均相同。扩增
产物经 1.2%琼脂糖凝胶电泳检测, 用多功能 DNA
纯化回收试剂盒 (Axygen Biosciences, California,
USA)回收扩增产物, 连接到 pTA2 载体, 再转化到
大肠杆菌 DH5α, 蓝白斑筛选, 挑取白色单菌落鉴定,
根据菌落 PCR结果, 选择 3 个阳性克隆进行双向测
序。参照马春雷等[16]的方法对测序结果进行生物信
息学分析。
242 作 物 学 报 第 41卷

表 1 基因克隆及表达分析所用引物序列
Table 1 Primers used in gene cloning and expression analysis
引物编号
Primer code
引物序列
Primer sequence (5′–3′)
引物编号
Primer code
引物序列
Primer sequence (5′–3′)
CsGluTR-3RACE-1 GAAACATCAAATCGGAGGGCAGA CsGluTR-5RACE-1 CCTTGTTAGCCGCCACGACTTCCTT
CsGluTR-3RACE-2 TCAAGGAAGTCGTGGCGGCTAAC CsGluTR-5RACE-2 TCTAACCCGCTTTCCAACGGTGATT
CsChlS-3RACE-1 ACCAGGCTAGTGCCCAACCATTT CsChlS-5RACE-1 CAGGTGTAAGGGTTCCAAACAAA
CsChlS-3RACE-2 TACCGTGCCGAAGCCAAAAGAAG CsChlS-5RACE-2 GGGCCAGACATTAGCATACAAAC
CsCAO-3RACE-1 GAGACGCTGTGGACCAAGGAGCT CsCAO-5RACE-1 TTATTGAGCCAAGGTGAAGAGGAC
CsCAO-3RACE-2 GCAGGCACTCAACAGCTCCTTTA CsCAO-5RACE-2 TGGTGTCATCCTTCAAGTCCGTAGA
18S rRNA-RTS TCTCAACCATAAACGATGCCGACC 18S rRNA-RTA TTTCAGCCTTGCGACCATACTCCC
CsGluTR-RTS ACAGATCCGAGGACAGAGTTGCTG CsGluTR -RTA CGATTTGATGTTTCACGGGAGGGA
CsChlS-RTS AATGGTTGGGCACTAGCCTGGTAT CsChlS -RTA GACTGCTAAATGGATTTGCGTTGG
CsCAO-RTS CTCTACGCATCTTCACCAACTTCA CsCAO-RTA TAACAATTCGGAGATCCTCATTCA

1.3 不同白化阶段 3个基因的表达分析
根据白叶 1 号春季不同时期叶色的变化特征,
分别采集不同白化阶段的一芽二叶和第 5 叶完全白
化时的一芽五叶枝条, 将其分部位提取总 RNA, 并
反转录成 cDNA, 稀释 5倍作为荧光定量模板。采用
相对定量的方法, 以 18S rRNA 为内标基因(表 1),
荧光定量反应体系为 SYBR Premix Ex Taq 25 μL, 10
μmol L–1 上下游引物各 2 μL, ROX Dye II 1 μL,
cDNA 4 μL, 加水至终体积 50 μL。反应在 ABI
PRISM 7500 实时定量 PCR 仪(Applied Biosystems,
Foster City, CA)上进行, 程序为 95℃变性 30 s, 94℃
变性 15 s, 60℃退火延伸 34 s, 40个循环, 于 60℃收
集荧光, 反应结束后分析荧光值变化曲线和熔解曲
线, 每个反应重复 3次, 采用 2−ΔΔCt算法分析结果[17]。
2 结果与分析
2.1 茶树谷氨酸-tRNA还原酶全长 cDNA的克隆
与序列分析
根据已知的CsGluTR基因部分序列设计5′端和3′
端嵌套引物, 经过2轮PCR扩增后, 5′端得到一条约
900 bp的片段, 3′端得到一条约850 bp的片段(图1)。
测序结果表明, 5′端测序的3个克隆为一条长883 bp
序列; 而3′端测序的3个克隆则是相似性极高的不同
序列 , Blast比对分析表明它们均与其他植物的
GluTR基因有较高的同源性, 其中最长的为812 bp,
最短的为802 bp。最后将测序得到5′端序列、原有的
中间片段和最长的3′端序列拼接 , 得到一条全长
2165 bp的cDNA序列, 开放阅读框长1665 bp, 编码
554个氨基酸, 推测的蛋白分子量约为60.6 kD, 理
论等电点为 8.78, 该基因在GenBank的登录号为
HQ660371。同时将另外2个3′端序列用同样方法与原
序列拼接 , 并根据其开放阅读框翻译成氨基酸后 ,
发现他们编码的蛋白质大小一致 , 但有7个位点的
氨基酸发生了置换 , 说明在茶树中 , 谷氨酸-tRNA
还原酶可能是以基因家族或者多基因家族的形式存
在, 其功能是否一致还有待进一步验证。
通过 NCBI-CDS在线分析 CsGluTR基因的保守
结构域[18], 发现其编码的氨基酸序列中存在 NADP
binding site (GxGxxG)和 tRNA binding site (Sx4ExE/
Qx3Q) 2个保守结构域, 它们同属 PLN00203多结构
域, 是谷氨酸-tRNA 还原酶的特征结构。进一步将
CsGluTR 的全长 cDNA 进行 BlastX 同源比对, 结果
显示, 它与其他物种中报道的 GluTR 的相似性均在
60%以上 , 其中与葡萄 (Vitis vinifera)和克莱门柚
(Citrus clementina)的相似性最高, 达 79%。
2.2 茶树叶绿素合酶全长 cDNA的克隆与序列分
析
按照上述方法分别设计 CsChlS 基因的 5′端和 3′

图 1 RACE扩增产物的电泳结果
Fig. 1 Electrophoresis results of RACE
M: 分子量标准; 1~2: CsGluTR的 5′RACE和 3′RACE电泳结果;
3~4: CsChlS的 5′RACE和 3′RACE电泳结果; 5~6: CsCAO的
5′RACE和 3′RACE电泳结果。
M: DNA marker; 1–2: 5′RACE and 3′RACE result of CsGluTR; 3–4:
5′RACE and 3′RACE result of CsChlS; 5–6: 5′RACE and 3′RACE
result of CsCAO.
第 2期 马春雷等: 茶树叶绿素合成相关基因克隆及在白叶 1号不同白化阶段的表达分析 243



图 2 茶树 CsGluTR的全长序列和推测氨基酸序列
Fig. 2 Nucleotide and putative amino acid sequences of CsGluTR from tea tree
开放阅读框用下画线标出, 保守的 tRNA结合位点用方框标出, 保守的 NADP结合位点用阴影标出, 不同克隆的氨基酸置换用粗体标
出, 终止密码子用星号表示, 假定的加尾信号用下画双线标出。
The open reading frame is underlined. Putative tRNA binding site is boxed. Putative NADP binding site is marked in shadow. The amino acid
substitutions are presented in bold. Stop codon is shown with an asterisk. Putative polyadenylation signal is double-underlined.

端嵌套引物, 经2轮PCR扩增, 电泳检测均得到一条
约400 bp的清晰条带(图1), 与预期目的片段大小相
符, 测序结果分别为395 bp和325 bp, 通过DNAstar
的SeqMan程序将其与已知序列拼接, 最终得到一条
全长1463 bp的cDNA序列 , 开放阅读框长1125 bp,
编码374个氨基酸, 推测的蛋白分子量约为40.5 kD,
理论等电点为8.58, 该基因在GenBank的登录号为
HQ660370。
序列分析表明, CsChlS编码蛋白具有典型的叶
绿素合酶的活性位点NDDDND[aS]D, 即2个富含天
冬氨酸(D、143、146、150、272、279)的结构域[19]。
将CsChlS的全长cDNA进行BlastX同源比对, 结果显
示, 与其相似性较高的序列均为其他物种中的叶绿
素合成酶蛋白, 其与葡萄、克莱门柚、黄瓜(Cucumis
sativus)、烟草(Nicotiana tabacum)、野草莓(Fragaria
vesca subsp. vesca)等的相似性分别为90%、88%、
87%、87%和86%。
2.3 茶树叶绿素酸醋氧化酶全长 cDNA的克隆与
序列分析
茶树叶绿素酸醋氧化酶基因按照同样方法设计
引物, 经 2轮 PCR扩增, 5′RACE和 3′RACE电泳结
果显示, 分别在 800 bp和 400 bp处有 2条较清晰的
电泳带, 测序结果为 774 bp和 388 bp, 将其与原有
中间片段拼接, 最终得到一条全长 2146 bp的 cDNA
序列, 开放阅读框长 1611 bp, 编码 536 个氨基酸,
推测的蛋白分子量约为 60.8 kD, 理论等电点为 8.03,
该基因在 GenBank 的登录号为 HQ660369。序列分
析表明, CsCAO 编码的氨基酸包含氧化酶所必有的
2个保守的结合位点, 即 Rieske-type (2Fe-2S)蛋白结
合位点和单核心铁结合位点[20]。将 CsCAO 的全长
cDNA 进行 BlastX 同源比对 , 结果显示 , 其与橙
(Citrus sinensis)、葡萄、桑树(Morus notabilis)、可
可 (Theobroma cacao)的 CAO 蛋白相似性分别为
78%、77%、76%和 76%。
244 作 物 学 报 第 41卷


图 3 茶树 CsChlS的全长序列和推测氨基酸序列
Fig. 3 Nucleotide and putative amino acid sequences of the CsChlS of tea plant
开放阅读框用下画线标出, 功能结构域及保守氨基酸位点分别用阴影和粗体标出, 终止密码子用星号表示, 假定的加尾信号用下画双
线标出。
The open reading frame is underlined. Functional domains are marked in shadow. Putative active sites are presented in bold. Stop codon is
shown with an asterisk. Putative polyadenylation signal is double-underlined.

图 4 茶树 CsChlS编码氨基酸序列的保守结构域
Fig. 4 Conserved domain of CsChlS protein in tea plant

蛋白质磷酸化是蛋白质翻译后最常见和最重要
的一种修饰方式, 分析茶树 CsCAO 编码氨基酸的潜
在磷酸化位点, 有助于了解茶树 CsCAO 蛋白在翻译
后水平上的调控方式。本文采用在线软件 NetPhoS
2.0 对该基因编码蛋白的潜在磷酸化位点进行预测显
示, 共存在 25 个潜在的磷酸化位点(图 5), 且主要分
布于多肽链的前半部分, 其中丝氨酸、苏氨酸和酪氨
酸的磷酸化位点数分别是 15、7和 3, 说明对于CsCAO
蛋白, 磷酸化与否对其发挥催化功能至关重要。
2.4 3个基因的系统树分析
对来自葡萄 (Vitis vinifera)、克莱门柚 (Citrus
clementina)、黄瓜(Cucumis sativus)等 16个不同物种
的谷氨酸-tRNA 还原酶、叶绿素合酶和叶绿素酸醋
氧化酶蛋白进行多重比对, 并采用 Mega5.0 邻近相
接法(Neighbor-Joining, NJ)构建系统进化树。分析结
果表明(图 7), 来自不同物种的共 48条序列首先按照
功能可清晰地分为 3 类, 且不同物种的叶绿素合酶
和叶绿素酸醋氧化酶在进化上的关系更近; 但在 3
个不同类群下, 则无明显的物种聚类规律, 如在叶
绿素合酶的大分支下 , 茶树最先与玄参科猴面花
(Mimulus guttatus)和马铃薯(Solanum tuberosum)聚
为一类; 在叶绿素酸醋氧化酶的大分支下, 茶树则
与葡萄(Vitis vinifera)和马铃薯(Solanum tuberosum)
聚为一类 ; 而在谷氨酸-tRNA 还原酶的大分支下 ,
茶树与玄参科猴面花 (Mimulus guttatus)和大豆
(Glycine max)等聚为一类。由此说明, 基于单基因的
系统进化分析可作为基因功能判定的有力证据, 但
并不适合用来研究不同物种之间的进化关系。
2.5 3 个叶绿素合成相关基因在白叶 1 号不同白
化阶段的表达
本实验室经多年田间观察发现, 白叶 1 号春季
的表型变化可分为如下几个阶段: 春季新发嫩芽的
芽头为浅绿色, 展开叶先呈黄绿色, 随着芽叶生长,
叶片逐渐变大 , 叶脉呈绿色 , 叶面转白 , 至一芽三
第 2期 马春雷等: 茶树叶绿素合成相关基因克隆及在白叶 1号不同白化阶段的表达分析 245



图 5 茶树 CsCAO氨基酸序列翻译后的磷酸化修饰预测
Fig. 5 Predicted phosphorylation sites in CsCAO by NetPhos 2.0

图 6 茶树 CsCAO的全长序列和推测氨基酸序列
Fig. 6 Nucleotide and putative amino acid sequences of the CsCAO of tea plant
开放阅读框用下画线标出, 功能结构域及保守氨基酸位点分别用阴影和粗体标出, 终止密码子用星号表示。
The open reading frame is underlined. Functional domains are marked in shadow. Putative active sites are presented in bold. Stop codon is
shown with an asterisk.

叶期, 叶面全部为白色。随后新叶转绿, 一芽四叶期
顶叶为绿色, 其他叶片为白色; 一芽五叶期的一芽
一叶转绿, 表现为白绿相间, 其余三叶仍为白色。随
后新生叶片恢复至正常绿色叶片, 早期白化叶片则
逐渐干枯掉落。从表型看, 并无白化叶返绿过程, 复
绿表型主要是由于特定时间的新生叶片转为绿色 ,
而原一芽三叶期的成熟白叶则慢慢老化脱落, 个别
芽头一芽三叶期时的一叶, 即主脉仍为绿色的新叶
随后有返绿特征, 而最初两叶很难复绿。根据这一
表型变化过程, 我们从白叶 1 号的一芽二叶期开始,
每周采集其新稍一芽二叶, 至新稍完全复绿; 同时
采集其新稍生长至一芽五叶期后的各部位叶片。随
后利用荧光定量 PCR技术对本试验克隆的 3个叶绿
素合成途径中的关键催化酶的表达规律分析表明
(图 8), 在白叶 1 号到达一芽二叶期后的约 2 周内,
其叶绿素合成途径已被破坏, 3个叶绿素合成主要结
246 作 物 学 报 第 41卷


图 7 茶树谷氨酸-tRNA还原酶、叶绿素合酶和叶绿素酸醋氧化酶的系统进化分析
Fig. 7 Phylogenetic tree of the deduced amino acid sequence of GluTR, ChlS, and CAO from different species
Vitis vinifera: 葡萄; Citrus clementina: 克莱门柚; Cucumis sativus: 黄瓜; Mimulus guttatus: 玄参科猴面花; Glycine max: 黄豆; Solanum
tuberosum: 马铃薯; Theobroma cacao: 可可; Populus trichocarpa: 杨树; Cicer arietinum: 鹰嘴豆; Eucalyptus grandis: 巨桉; Phaseolus
vulgaris: 芸豆; Arabidopsis thaliana: 拟南芥; Brachypodium distachyon: 二穗短柄草; Setaria italica: 谷子; Ricinus communis: 蓖麻;
Oryza brachyantha: 短花药野生稻。
第 2期 马春雷等: 茶树叶绿素合成相关基因克隆及在白叶 1号不同白化阶段的表达分析 247


构酶的表达量相继到达最低水平, 其中 CsGluTR 在
第 7天和第 14天的相对表达量均为 0.57, 与对照相
比表达量降低了近一半; CsChlS和 CsCAO在第 7天
的相对表达量分别为 0.57和 0.47, 在第 14天的相对
表达量分别为 0.68 和 0.63; 对应的表型观测结果表
明, 这一时期也是白叶 1 号新梢处于完全白化的阶
段。随后 CsGluTR基因的相对表达量在第 3周恢复
到 1.73, 并随着新稍发育逐渐增强; 同时 2 个基因
CsChlS 和 CsCAO 的相对表达量也在 3 周后显著提
高, 分别为 0.89 和 0.76, 这一时期属于白叶 1 号的
一芽四叶期, 也是新生芽叶转绿的阶段; 当新稍到
达一芽五叶期后, 新生芽叶中的 3个基因的表达都
恢复至较高水平, 其相对表达量分别为 18.70、16.19
和 16.94; 表达量最高的 CsGluTR基因是其最初一芽
二叶的近 20倍。
另外, 对3个基因在不同部位叶片的表达检测结
果也表明 , 3个基因的表达与其表型变化密切相关
(图9) , 特别是与叶绿素合成直接相关的2个基因
CsChlS和 CsCAO, 其表达量在第四和第五叶中达到
最低水平, 在第四叶中分别为 0.42 和 0.14; 在完全
白化的第 5叶中分别为 0.06和 0.22, 其中 CsChlS在
第五叶中的相对表达量与一芽一叶中的相差约 17
倍。说明在白化叶片中, 叶绿素合成机制可能已被
破坏, 叶绿素合成受阻导致的叶片内色素类物质含
量降低或消失是叶片白化的直接原因。


图 8 茶树 CsGluTR、CsChlS和 CsCAO基因在白叶 1号不同白
化阶段的表达
Fig. 8 Expression of CsGluTR, CsChlS, and CsCAO genes in
the different albescent stages of tea plant variety Baiye 1

图 9 茶树 CsGluTR、CsChlS、CsCAO基因在白叶 1号不同部位叶片的表达
Fig. 9 Expression of CsGluTR, CsChlS, and CsCAO genes in different positions of tea plant variety Baiye 1

3 讨论
叶片是作物光合作用的主要器官, 叶片的突变
对其光合作用以及整个生长过程都有重要的影响。
研究叶色突变体, 发掘与叶绿体形态建成以及叶绿
素合成代谢相关的新基因, 探究作物光合作用机制,



具有重要的理论意义和应用价值。在高等植物中 ,
叶色变异种类繁多, 不同突变体的分子机制也较为
复杂。总的来说, 突变基因通过不同的调控方式, 直
接或间接影响叶绿素的合成及稳定, 最终导致叶色
表型变化。根据目前对叶色突变体的研究结果, 叶
248 作 物 学 报 第 41卷

色突变机制主要有叶绿素生物合成和降解途径中基
因突变、血红素代谢途径的基因突变、编码其他叶
绿体蛋白基因突变、与光合系统无直接关系基因突
变几类[21]。其突变类型可能是数量性状, 也可能是
质量性状; 可能是细胞核遗传, 也可能是细胞质遗
传。通常情况下, 为了确定突变性状的遗传模式, 需
通过正反杂交试验验证, 但由于茶树属于多年生木
本植物, 受限于杂交周期、结实率及自交不亲和性,
难以得到像大田作物那样的重组近交系用于遗传作
图, 分离群体的规模也受到很大限制。目前为止, 已
报道的可用于遗传分析的茶树分离群体还不足10个,
其中没有一个是基于叶色突变建立的[22]。因此, 构
建合适的茶树叶色突变分离群体, 将是解答叶色突
变机制的重要途径。本实验室通过多年的重复杂交,
已初步建立了一个白化性状在子代中能有效分离的
F1群体, 进一步的遗传分析还在进行中。
大量研究表明, 叶绿素的合成是由一系列酶共
同作用的生化反应过程。其中任何一个编码酶基因
的突变都有可能使相关酶的活力发生改变甚至丧失,
影响相关蛋白质的合成, 从而导致叶绿素合成过程
受阻, 使叶色表现出不同程度的变化。在高等植物
中, 参与叶绿素合成过程的所有酶编码基因均已被
克隆鉴定[23]。但茶树作为重要的多年生叶用经济作
物, 有关这一途径的功能基因研究却仍处在起步阶
段, 目前仅有4个基因在GenBank登录, 分别为镁离
子鳌合酶H亚基基因、谷氨酸-tRNA还原酶基因、叶
绿素合酶基因和叶绿素酸醋氧化酶基因[24], 均为本
实验室提交。其中谷氨酸 t R N A还原酶是叶绿
素合成的第一个关键酶, 它催化谷氨酰-tRNA转化
为谷氨酰-半醛。研究表明, 该酶是一个具有一个V
型折叠结构的二聚蛋白, 主要在叶绿体基质中发挥
作用[25]。Kumar和Soll[26]将谷氨酞-tRNA还原酶的反
义RNA转入拟南芥后, 转基因植株间即存在明显的
叶色差异, 并且叶色变异程度与HEMA基因的表达
水平成反比。在大多数植物中, 编码该酶的基因以
多基因家族的形式存在[27]。例如在大麦中, 发现了3
个不同的克隆能够编码该蛋白 , 其中克隆BHA1和
BHA87具有一致的开放阅读框, 但3非编码区的长
度不一样 ; 而克隆BHA1和BHA13则有87个不同的
核苷酸, 从而导致编码蛋白的11个氨基酸置换[28]。在
茶树中我们也发现相似的情况, 通过RACE测序, 共
克隆了3条序列相似度很高的茶树谷氨酸-tRNA还原
酶基因, 序列分析表明它们具有相同的开放阅读框,
但在3端存在7个氨基酸置换位点, 这些位点的存在
是否对其编码酶活性有影响还需进一步鉴定。叶绿
素合酶是叶绿素合成途径中的一种关键酶, 定位在
类囊体膜上, 催化叶绿素酸醋植醇化, 生成叶绿素a
或叶绿素b, 这一步骤对叶绿素辅基蛋白的翻译和积
累, 类囊体膜组分的稳定装配具有重要意义[29-30]。在
大多数高等植物中, 叶绿素合酶多以单拷贝基因的
形式存在[31]。Lopez等[32]研究发现, 叶绿素合酶与细
菌叶绿素合成酶属于聚异戊烯转移酶家族, 具有典
型的聚异戊烯焦磷酸结合位点(domain II)。Schmid
等[33]研究了燕麦叶绿素合酶基因异源表达蛋白特性,
揭示半胱氨酸、精氨酸残基和Mg2+是酶催化活性所
必需。另外, 通过定向突变叶绿素合酶残基His-197,
能够使其活性丧失, 说明His-197可能与叶绿素酸酯中
Mg2+的结合有关[34]。叶绿素a氧化酶是由叶绿素a生成
叶绿素b的关键酶, 该酶编码基因的突变会导致叶绿
素b的合成受阻, 甚至不能合成叶绿素b [35]。Tanaka
等[27]利用插入诱变技术获得6个衣藻叶绿素b缺失突
变体, 并从中首次克隆出叶绿素a氧化酶基因。Lee
等 [36]在水稻基因组分离出2个与CAO高度同源的基
因, 并命名为OsCAO1基因和OsCAO2基因, 它们均
位于水稻的第10染色体上, OsCAO1在光合组织中表
达并受光的诱导, OsCAO1基因的失活将导致植株体
内叶绿素b的合成受阻、含量减少和表现出苍白叶表
型, 严重时甚至不能合成叶绿素b, 致使植株不能正
常进行光合作用而早衰早亡。
白叶1号是浙江省安吉县茶农发现的一个温度
敏感型白化突变资源, 因为其特异的外观特征与内
在品质, 成为制作高档名优茶的理想原料。已有研
究认为 , 白叶1号阶段性返白是其内部基因突变的
结果, 突变基因在一定温度范围内得以表达或表达
加强[12], 其温度阈值被普遍认为在20~22℃之间, 当
外界温度超过23℃度时, 白化叶片便开始复绿。但
本实验室经多年田间观察发现, 最初白化的叶片基
本不能完成复绿过程, 普遍在七月初干枯脱落, 复
绿现象只能发生在叶脉尚未白化的新生叶芽, 说明
叶片内部结构的破坏程度也是影响叶片复绿的一个
重要因素。王新超等[37]利用mRNA差别显示技术研
究了其正常叶片和白化叶片的基因表达差异, 结果
从58个差异表达的片段中鉴定出12个阳性克隆, 通
过Blast比对得到了5个有注释信息的基因片段, 分
别为血红素结合蛋白家族中心区域基因、甲硫氨酸
合酶基因、转座子基因、3-磷酸甘油醛脱氢酶假基
第 2期 马春雷等: 茶树叶绿素合成相关基因克隆及在白叶 1号不同白化阶段的表达分析 249


因和ACC合成酶基因。李娟等[38]用SSH技术, 构建
了白叶1号全白期与全绿期叶片的正反向消减文库,
并从中筛选到80个差异表达序列 , 推测有3个基因
片段可能与白叶1号高氨基酸形成相关。本实验室则
采用芯片技术分析了白叶1号不同白化阶段的基因
表达谱, 筛选到差异表达基因671个, 在所有差异表
达基因中包含多个叶绿素合成相关的重要催化酶[14],
本研究通过RACE技术克隆了其中3个主要结构酶的
全长序列。表达分析表明, CsChlS和CsCAO基因具有
明显的表达协同性, 它们在叶片中的表达量与叶片
的颜色变化高度同步; 而谷氨酰tRNA还原酶的荧光
定量试验结果显示, 它在白化叶片和正常叶片中的
表达差异相对较小, 同时在新生芽叶转绿的过程中,
它的表达最先恢复到正常水平。通过以上结果, 我
们可以初步推测叶绿素合成途径受阻是安吉白茶白
化表型的直接原因, 但具体是哪种突变引起了该连
锁反应还有待进一步研究。
4 结论
从茶树中克隆了 3个编码叶绿素合成途径的重
要催化酶基因 CsGluTR、CsChlS和 CsCAO, 它们均
具有典型的结构特征, 且编码的氨基酸序列与其他
植物中同源基因的相似性均在 70%以上。通过对不
同白化程度和不同部位茶树叶片中 3 个基因的表达
进行分析, 发现 CsChlS 和 CsCAO 的表达量与叶片
颜色变化密切相关。推测叶绿素合成受阻导致的叶
片内色素类物质含量降低是安吉白茶白化表型的直
接原因。
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