全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2016, 42(7): 990999 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由 东北农业大学大豆生物学教育部重点实验室开放基金项目(SB14A04), 国家现代农业产业技术体系建设专项(CARS-04-
CES18), 国家自然科学基金项目(31501329)和山东省自然科学基金项目(ZR2015YL070)资助。
The study was supported by the Open Foundation of Key Laboratory of Soybean Biology of Ministry of Education, Northeast Agricultural
University (SB14A04), the China Agriculture Research System (CARS-04-CES18), the National Natural Science Foundation of China
(31501329), and the Natural Science Foundation of Shandong Province (ZR2015YL070).
通讯作者(Corresponding author): 徐冉, E-mail: soybeanxu@126.com
第一作者联系方式：E-mail: 13854198480@163.com, Tel: 0531-83179348
Received(收稿日期): 2015-12-16; Accepted(接受日期): 2016-03-14; Published online(网络出版日期): 2016-03-28.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160328.1116.008.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2016.00990
大豆盐胁迫相关 GmNAC基因的鉴定、表达及变异分析
张彦威 1,2 张礼凤 1 李 伟 1 王彩洁 1 张 军 1 徐 冉 1,
1 山东省农业科学院作物研究所, 山东济南 250131; 2 东北农业大学大豆生物学教育部重点实验室, 黑龙江哈尔滨 150001
摘 要: NAC基因在植物的逆境胁迫中发挥着重要作用。本研究参照水稻和拟南芥的逆境相关 NAC基因, 采用生物
信息学方法鉴定了大豆逆境相关 GmNAC 基因, 利用荧光定量 PCR 技术分析了 GmNAC 基因在耐盐差异的大豆品种
根部、叶片的表达及其对 NaCl胁迫的应答, 采用反转录 PCR技术克隆了表达差异显著的 GmNAC基因。结果表明, 大
豆 GmNAC 基因家族包含 175 个基因, 其中 11 个基因所编码的 GmNAC 蛋白与水稻和拟南芥的逆境相关 NAC 蛋白
位于同一进化分支, 这些蛋白具有高度保守的 NAC 结构域; 这 11 个 GmNAC 基因在大豆根部的表达均高于在叶片,
而且在叶片和根部均受 NaCl诱导, 部分基因在根部和叶片以及品种间表现出不同的表达规律; 在大豆品种齐黄 34、
徐豆 10和汾豆 95中, Glyma06g11970.1存在 3个同义突变和 1个非同义突变, Glyma06g16440.2存在 1个同义突变。
关键词: 大豆; GmNAC; 进化树; NaCl处理; 表达分析; 序列变异
Identification, Expression and Variation Analysis of Salt Tolerance Related
GmNAC Genes in Soybean
ZHANG Yan-Wei1,2, ZHANG Li-Feng1, LI Wei1, WANG Cai-Jie1, ZHANG Jun1, and XU Ran1,
1 Crop Research Institute, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250131, China; 2 Key Laboratory of Soybean Biology of Ministry of
Education, Northeast Agricultural University, Harbin 150001, China
Abstract: NAC genes play an important role in plant stress tolerance. In this study, bioinformatic method was used to identify the
stress related GmNAC gene in soybean. The expression of candidated GmNAC genes in root and leaf was analyzed in soybean
with NaCl treatment by Real-time PCR. Reverse transcription PCR was performed to clone genes with significant difference in
expression. The results showed that there were 175 genes in soybean GmNAC gene family. There were 11 GmNAC proteins with
highly conserved NAC located on the same evolutionary branch with the stress related NAC proteins in rice and Arabidopsis. The
expression of 11 GmNAC genes in soybean root was higher than that in leaf. The GmNAC genes were all induced by NaCl stress,
but part of the GmNAC genes showed different expression levels between root and leaf in soybean varieties with different salt
tolerances. There were three synonymous mutations and one non-synonymous mutation on the CDS region of Glyma06g11970.1
and one synonymous mutation on the CDS region of Glyma06g16440.2 in Qihuang 34, Xudou 10, and Fendou 95.
Keywords: Soybean; GmNAC; Phylogenetic tree; NaCl treatment; Expression analysis; Sequence variation
高温、低温、干旱和盐碱等非生物逆境胁迫严
重影响作物的生长, 造成作物大幅度减产 [1]。NAC
蛋白是一类植物特异的参与多种植物生理生化过程
的转录因子 [2], 广泛参与植物生长发育以及逆境应
答。NAC (NAM, ATAF1-2, CUC2)最初起源于NAM
(no apical meristem), ATAF1-2和CUC2 (cup-shaped
cotyledon) [3]。NAC蛋白包含一个保守的N-端DNA
结合域和一个多样化的转录调控域[4]。NAC家族成员
能够激活植物的逆境应答基因, 提高植物对逆境的
耐受性。AtNAC072和AtNAC019是拟南芥的ABA信号
第 7期 张彦威等: 大豆盐胁迫相关 GmNAC基因的鉴定、表达及变异分析 991
通路的关键基因, AtNAC072的表达受高盐、脱落酸
(ABA)、生长素、乙烯、茉莉酸(JA)、脱水、损伤等
多种因素诱导并参与植物的信号传导[5], AtNAC019的
表达 受ABA、热、高盐、JA、干旱应答等因素诱导, 并
调节植物生长发育[6-8]。AtNAC055是拟南芥JA信号通
路的关键基因, 调控JA的生物合成, 并能对高盐、真菌
等多种逆境应答[7-8]。AtNAC102能够参与拟南芥的洪
涝胁迫应答 [9]。OsNAC002[10-13]、OsNAC048[14-15]和
OsNAC068[16]参与水稻的耐旱、耐盐等多种逆境胁迫。
随着对大豆 NAC基因家族研究的深入, 越来越
多的大豆 NAC类转录因子得到了鉴定。孟庆长等首
次在大豆中克隆得到 6个GmNAC基因[17-18]; 韩巧玲
等[19]利用 NTT (核蛋白筛选系统)从大豆耐盐品种铁
丰 8号中克隆得到 GmNAC2a基因, 该基因对干旱、
高温、低温、高盐、ABA、乙烯等多种途径均有响
应 ; 金杭霞等 [20]发现 GmNAC2 参与逆境调控 ,
GmNAC5 参与大豆发育调控; 才华等[21]利用酵母单
杂交的方法从野生大豆中克隆得到能与耐逆相关顺
式元件 MYB1AT特异结合的 GsNAC20基因, 该基因
能够响应高盐、干旱和低温胁迫, 并且在根和叶中
具有不同的表达模式, 超量表达 GsNAC20的拟南芥
提高盐胁迫的敏感性; Tran等[22]在大豆中克隆了 31
个 GmNAC 基因, 发现 9 个 NAC 基因能同时响应干
旱、高盐、冷、ABA 等胁迫应答, 聚类分析发现 9
个 GmNAC基因与前人报道的逆境相关 NAC基因位
于同一分支; Le 等[23-24]利用大豆基因组数据库预测
得到 152个 GmNAC基因, 发现 58个基因可能参与
逆境胁迫应答, 经定量分析发现 25个和 6个基因在
干旱胁迫时分别上调和下调 2 倍以上; 王洋等[25]利
用大豆基因组数据库预测得到 152 个 GmNAC 基因,
并将其划分为 10 个亚家族; Hao 等[26-27]研究发现,
GmNAC11、GmNAC20 通过调节 DREB1A 等相关基
因增强植物高盐胁迫耐性 , 进一步研究表明
GmNAC20 既可以调控生长素信号相关基因促进植
株侧根形成, 又可以激活 DREB/CBF-COR途径增强
植物的高盐胁迫和冷胁迫耐性。
本研究在前期大豆品种耐盐性鉴定的基础上 ,
利用生物信息学手段挖掘大豆中逆境相关的
GmNAC 基因, 采用荧光定量 PCR 技术分析其在不
同耐盐性大豆品种中的表达规律, 探索 GmNAC 基
因对盐胁迫的应答, 克隆盐胁迫相关基因, 分析候
选基因序列变异, 为抗逆转基因品种的培育提供基
因材料及理论基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
选用本课题组前期鉴定的耐盐品种徐豆 10、齐
黄 34和盐敏感品种汾豆 95。
1.2 NAC蛋白质序列的获得
从植物转录因子数据库 PlantTFDB (http://
planttfdb.cbi.pku.edu.cn/)下载大豆 NAC 转录因子序
列, 对去冗余后的蛋白序列根据 Phytozome (http://
phytozome.org/)的功能注释并利用 SMART (http://
smart.embl-heidelberg.de/)分析氨基酸结构域 , 获得
具有NAC保守结构域的候选基因; 查询文献获得拟
南芥和水稻逆境胁迫相关的 NAC蛋白质序列。
1.3 NAC蛋白家族系统进化树分析
利用 MEGA 5.05软件内置的 Clustal W程序对
获得的NAC蛋白进行序列比对; 根据多重序列比对
结果 , 使用 MEGA 5.05 软件采用最大似然法
(maximum likelihood, ML)构建系统进化树。
1.4 大豆 GmNAC基因的表达分析
选取与拟南芥和水稻的逆境胁迫相关 NAC 蛋
白位于同一进化分支的大豆 GmNAC 蛋白, 查询文
献或利用 Primer 5 设计引物进行荧光定量分析(表
1)。将大豆种子播种于装有细沙的育苗盘中, 用 1/4
MS培养液浇灌至大豆第一片三出复叶全展, TRIzol
法提取大豆根部和叶片 RNA, 利用 Roche Lightcy-
cler 480II 进行荧光定量 PCR, 利用 2–ΔΔCt数据分析
该基因在根叶中的表达情况; 将大豆种子播种于细
沙的育苗盘中, 用 1/4 MS培养液浇灌至大豆第 1片
三出复叶全展, 移至水培, 添加 150 mmol L–1 NaCl
的 1/4 MS培养液处理, 1/4 MS培养液处理作为空白
处理, 分别采集处理 1、3、6和 12 h的叶片和根提
取 RNA并定量分析表达情况。
1.5 基因克隆及序列分析
根据 GmNAC 的表达结果, 选取相关基因进行
克隆。根据基因的 5 UTR和 3 UTR序列设计引物
(表 2), 分别以徐豆 10、齐黄 34和汾豆 95的 cDNA
为模板进行基因克隆。利用 DNAMAN 对测序成功
的基因进行序列比对, 分析变异位点。
2 结果与分析
2.1 NAC蛋白系统进化树分析
从 PlantTFDB下载大豆 NAC转录因子序列 247
个 , 去冗余后根据 Phytozome 的功能注释并利用
992 作 物 学 报 第 42卷
表 1 荧光定量引物序列
Table 1 Primer sequence for real-time PCR
引物名称
Primer name
上游引物序列
Forward primer sequence (5–3)
下游引物序列
Reverse primer sequence (5–3)
基因曾用名
Former name of gene
PCR产物
PCR
product (bp)
Glyma12g35000.1 GGTCGTTGATTTCGTATCGGGGAAT TGCCTTGCGTCTGGTCCTGC GmNAC092[23,24] 64
Glyma06g38410.1 GTGTTATTGATTCCCGCTTG TCAACCGTCCTTCATCTTGT GmNAC043[23,24] 81
Glyma13g35550.1 GTTCAGAAATTGAACCGGC CCCCACCTATTTACACCAAA GmNAC101[23,24] 76
Glyma12g22880.1 GGCTAGACACATACAATGAATCGG TGCGGTGCTGTGGTGAAA GmNAC085[23,24] 74
Glyma04g42800.1 TTCCCTCCAAAACCAGTGTC ACACGTGTCGCACTAGCAAC GmNAC022[23,24] 72
Glyma02g26480.1 CCCCACCACCACACAATTTCAT TGCGGCCATTGTTGAGAAAGA GmNAC011(GmNAC20)[23,24,26] 79
Glyma14g24220.1 TTGAAAGGTGATGGAGGTGT TCCTTGATCCAAGCCTAACC GmNAC109[23,24] 83
Glyma06g16440.2 ATTAGAGTTGCCACCAGG CATTCTTTCTCGCCGTAG 177
Glyma06g11970.1 GATAAGCCCATTGGTCAG GTAAATACGGCAAAGCAC 186
Glyma04g38560.1 AATCGCAGTCGCAGAGCA AACCCAGGTGGCAACTCT 187
Glyma05g32850.1 TCCCAAGTTCCAAGTCGC GAGTTCTCCTGGCATTCG 77
GmACTIN4 GTGTCAGCCATACTGTCCCCATTT GTTTCAAGCTCTTGCTCGTAATCA 214
表 2 基因克隆引物序列
Table 2 Primer sequence for gene cloning
引物名称
Primer name
上游引物序列
Forward primer sequence (5–3)
下游引物序列
Reverse primer sequence (5–3)
PCR 产物
PCR product (bp)
Glyma06g16440.2 GAGCCAACAACAAGAAGA ATTCCACATTCCCTGATC 1185
Glyma06g11970.1 ATCGGCTATAAATAAAGGG GTCGCATGGTGAGTCAGAAA 1079
Glyma04g38560.1 GTTTCAAATCGCAGTCGC GCCTAGCCCACATCACAT 1164
SMART进行氨基酸结构域分析获得 175条含有保守
结构域的大豆 GmNAC 序列。通过文献检索(表 3)
分别获得拟南芥逆境相关 NAC 蛋白 4 条 , 即
AtNAC019、AtNAC055、AtNAC072 和 AtNAC102;
水稻逆境相关 NAC 蛋白 3 条 , 即 OsNAC002
(SNAC1)、OsNAC048 (OsNAC6)和 OsNAC068 (Os-
NAC4)。将其与 175条大豆 GmNAC家族蛋白进行进
化树分析(图 1), 有 11 条大豆 GmNAC 蛋白与拟南芥
和水稻逆境胁迫相关NAC蛋白处于同一分支, 分别为
Glyma12g35000.1 (GmNAC092) 、 Glyma06g38410.1
(GmNAC043)、 Glyma13g35550.1 (GmNAC101)、
Glyma12g22880.1 (GmNAC085)、Glyma04g42800.1
(GmNAC022) 、 Glyma02g26480.1 (GmNAC011,
GmNAC20) 、 Glyma14g24220.1 (GmNAC109) 、
Glyma06g16440.2 、 Glyma06g11970.1 、 Glyma04g
38560.1 和 Glyma05g32850.1, 其 中 7 个 基 因
GmNAC011、GmNAC022、GmNAC043、GmNAC085、
GmNAC 092、GmNAC 101和 GmN AC109受干旱胁
迫诱导。
2.2 大豆候选逆境相关 NAC氨基酸序列比对
序列比对发现, 11个大豆 NAC蛋白与拟南芥和
水稻逆境相关的 NAC蛋白结构域高度保守, 具有典
型的 NAC 转录因子结构特征(图 2)。AtNAC072、
AtNAC019、AtNAC055、Glyma12g35000.1、Glyma
06g38410.1、Glyma13g35550.1、Glyma12g2288 0.1
具有较高的同源率 , AtNAC102、 AtNAC002、
Glyma04g42800.1、Glyma02g26480.1、Glyma14g242
20.1、Glyma06g16440.2、Glyma06g119 70.1、Glyma0
4g38560.1、Glyma05g32850.1具有较高的同源率, 这
与基因的进化树分析的结果是一致的。
2.3 GmNAC在大豆根部的表达
荧光定量分析 GmNAC 在大豆根部的表达规律
(图3), 6个 GmNAC 基因 Glyma12g35000.1、Glyma
06g38410.1、Glyma12g22880.1、Glyma06g16440.2、
Glyma04g 38560.1、Glyma05g32850.1在耐盐品种徐
豆10和齐黄34根部的表达量均高于盐敏感品种汾豆
95; 2个 GmNAC 基因 Glyma13g35550.1和 Glyma14
g24220.1等在耐盐品种齐黄34根部的表达量高于盐
第 7期 张彦威等: 大豆盐胁迫相关 GmNAC基因的鉴定、表达及变异分析 993
表 3 水稻和拟南芥逆境相关 NAC基因
Table 3 Stress related NAC genes in rice and Arabidopsis
基因登录号
Gene ID
基因名称
Gene name
基因功能
Gene function
AT1G52890 AtNAC019 ABA信号通路; 参与 ABA、热、高盐、JA、干旱应答; 生长发育[6-8]。
ABA signaling pathway; induced by ABA, heat, high salt, JA, drought; regulate plant growth and development.
AT3G15500 AtNAC055 JA生物合成, JA通路, 高盐应答, 菌防卫应答, 器官发育, 调控细胞程序性死亡, 调控防御应答[7-8]。
JA biosynthesis; JA signaling pathway; response to high salt, fungi; organism development; negative
regulation of programmed cell death; negative regulation of defense responses.
AT4G27410 AtNAC072 ABA信号通路, 参与高盐、ABA、生长素、乙烯、JA、脱水、损伤应答, 信号传导[5]。
ABA signaling pathway; induced by ABA, IAA, ethylene, JA, high salt, dehydration, wounding; signal transduction.
AT5G63790 AtNAC102 洪涝等逆境胁迫反应[9]。 Involving in response to stress such as flooding.
DQ394702.1 OsNAC002(SNAC1) 耐寒, 耐盐, 耐氧化胁迫[10-13]。Involving in response to cold, high salt, oxidative stress.
AB028185.1 OsNAC048(OsNAC6)生物和非生物胁迫应答[14-15]。Response to biotic and abiotic stress.
AB028183.1 OsNAC068(OsNAC4)耐旱, 耐盐[16]。Involving in response to drought, high salt.
图 1 NAC蛋白系统进化树
Fig. 1 Phylogenetic tree of NAC proteins
: 大豆干旱胁迫诱导的 GmNAC蛋白; ○: 水稻和拟南芥中逆境相关的 NAC蛋白。
: GmNAC proteins induced by drought in soybean; ○: Stress related NAC proteins in rice and Arabidopsis.
994 作 物 学 报 第 42卷
图 2 候选逆境相关 NAC蛋白序列比对
Fig. 2 Sequence alignment of candidate stress-related NAC proteins
图 3 GmNAC基因在根部的表达
Fig. 3 Expression of GmNAC in root
1: Glyma12g35000.1; 2: Glyma06g38410.1; 3: Glyma13g35550.1; 4: Glyma12g22880.1; 5: Glyma04g42800.1; 6: Glyma02g26480.1;
7: Glyma14g24220.1; 8: Glyma06g16440.2; 9: Glyma06g11970.1; 10: Glyma04g38560.1; 11: Glyma05g32850.1.
敏感品种汾豆 95; Glyma06g11970.1基因在耐盐品种
徐豆 10 根部的表达量高于盐敏感品种汾豆 95;
Glyma04g42800.1、Glyma02g26480.1等 2个 GmNAC
基因在 3个品种根部的表达量差异不大。
150 mmol L–1 NaCl水培处理徐豆 10、齐黄 34
和汾豆 95, 荧光定量分析 GmNAC 在其根部的表达
量(图 4)。GmNAC 在根部的表达呈现品种间差异。
在徐豆10 根中 , Glyma04g42800.1、Glyma06g164
40.2、Glyma06g11970.1、Glyma04g38560.1、Glyma
05g32850.1在 NaCl处理 1、3和 6 h均下调表达, 但
在 12 h趋于稳定。其他 6个基因在不同时刻小幅上
调或下调表达, 未表现出明显规律。在齐黄 34根中,
除 Glyma04g42800.1外, GmNAC均不同程度的上调
表达, 其中, Glyma06g16440.2、Glyma06g11970.1、
Glyma05g32850.1 在 3 h 达到上调高峰 ; Glyma
13g35550.1、Glyma14g24220.1在 6 h达到上调高峰;
Glyma12g35000.1、Glyma06g38410.1、Glyma12g22
880.1、Glyma02g264 80.1、Glym a04g38560.1在 12 h
达到上调高峰; 除 3 h外, Glyma04g42800.1在其他
取样时间均不同程度的下调表达。NaCl处理 1 h和
3 h时, GmNAC在汾豆 95根中不同程度的上调或下
调表达, 但在 6 h和 12 h时, 所有 GmNAC基因均持
续上调表达, 并在不同时间达到上调高峰。
2.4 GmNAC在大豆叶片的表达
荧光定量分析 GmNAC 在大豆叶片中的表达规
律(图 5), 7 个 GmNAC 基因 Glyma12g22880.1、
Glyma04g42800.1 、 Glyma14g24220.1 、 Glyma06g
16440.1、Glyma06g11970.1、Glyma04g38560.1、Glyma
05g32 850.1在耐盐品种徐豆 10和齐黄 34叶片的表
达量均高于盐敏感品种汾豆 95; Glyma02g26480.1基
因在耐盐品种徐豆 10 叶片的表达量高于盐敏感品
种汾豆 95; 3 个 GmNAC 基因 Glyma12g35000.1、
Glyma06g38410.1、Glyma13g355 50.1在耐盐品种徐
豆 10 和齐黄 34 叶片的表达量均低于于盐敏感品种
汾豆 95。
150 mmol L–1 NaCl水培处理徐豆 10、齐黄 34
和汾豆 95, 荧光定量分析 GmNAC 在其叶片的表达
量(图 6)。几乎所有的 GmNAC在大豆叶片中均高度
上调表达。在徐豆 10 叶片中, Glyma12g35000.1、
Glyma06g38410.1、Glyma13g35550.1、Glyma12g228
80.1、Glyma02g26480.1、Glyma14g24 220.1 和
Glyma06g16440.2 上调表达, 并在 6 h 后达到高峰;
Glyma04g42800.1在 6 h达到上调高峰, 但在 1 h和
12 h 均下调表达; Glyma06g11970.1、Glyma04g38
560.1和 Glyma05g32850.1均在 12 h达到上调高峰,
但在 3 h下调表达。Glyma12g35000.1、Glyma06g38
410.1、Glyma13g35550.1 和 Glyma06g11970.1 在齐
黄 34 叶片中表达规律与徐豆 10 相同, 但表达倍数
稍有不同; Glyma12g22880.1和 Glyma14g24220.1在
齐黄 34 叶片中上调表达 , 并在 12 h 达到高峰 ;
第 7期 张彦威等: 大豆盐胁迫相关 GmNAC基因的鉴定、表达及变异分析 995
图 4 NaCl处理后 GmNAC基因的根部表达
Fig. 4 Expression of GmNAC in root treated with NaCl
图 5 GmNAC基因在叶片的表达
Fig. 5 Expression of GmNAC in leaf
1: Glyma12g35000.1; 2: Glyma06g38410.1; 3: Glyma13g35550.1; 4: Glyma12g22880.1; 5: Glyma04g42800.1; 6: Glyma02g26480.1;
7: Glyma14g24220.1; 8: Glyma06g16440.2; 9: Glyma06g11970.1; 10: Glyma04g38560.1; 11: Glyma05g32850.1.
Glyma04g42800.1在 1 h、3 h和 6 h均下调, 但在 12
h上调表达; Glyma02g26480.1在 6 h达到上调高峰,
但在 1 h下调表达; Glyma06g16440.2和 Glyma06g11
970.1 在 12 h 达到上调高峰, 但在 3 h 下调表达;
Glyma04g38560.1在 12 h达到上调高峰, 但在 3 h和
6 h均下调; Glyma05g32850.1在 1 h达到上调高峰,
并在 3 h 开始下调之后持续上调表达。Glyma12g3
5000.1、 Glyma06g38410.1、 Glyma13g35550.1 和
996 作 物 学 报 第 42卷
Glyma02g26480.1 在汾豆 95 叶片的表达规律和徐豆
10相同, 但表达倍数稍有不同; Glyma04g42800.1在
汾豆 95 中下调表达; Glyma12g22880.1、Glyma14g
24220.1、 Glyma06g16440.2、Glyma06g11970.1、
Glyma04g385 60.1 和 Gly ma05g 32850.1在汾豆 95
叶片中均上调表达并在 3 h达到上调高峰。
2.5 候选耐盐相关 NAC基因的序列变异
表达分析表明, 4 个新发现的逆境候选 GmNAC
基因中, Glyma05g32850.1在大豆叶片和根部的表达
量都很低, 虽然受 NaCl 胁迫诱导, 但在耐盐差异品
种中未表现出特异的规律。选择其余 3 个表达差异
显著的新基因(Glyma04g38560.1, Glyma06g11970.1
和 G lyma0 6g16440 .2 )进一步的克隆分析表明 ,
Glyma04g38560.1在徐豆 10、齐黄 34、齐黄 35中序
列一致。Glyma06g11970.1 (图 7-a)存在 3 个同义突
变和 1 个非同义突变, 其中, 距起始密码子 174 bp
图 6 NaCl处理后 GmNAC基因的叶片表达
Fig. 6 Expression of GmNAC in leaf treated with NaCl
图 7 GmNAC基因在大豆品种中的序列变异
Fig. 7 Sequence variations of GmNAC in soybean varieties
a: Glyma06g11970.1在大豆品种中的序列变异; b: Glyma06g16440.2在大豆品种中的序列变异。
a: Variations of Glyma06g11970.1 in soybean varieties; b: Variations of Glyma06g16440.2 in soybean varieties.
第 7期 张彦威等: 大豆盐胁迫相关 GmNAC基因的鉴定、表达及变异分析 997
处发生同义突变, 突变类型为 C/T; 距起始密码子
444 bp 处发生 T/G 的非同义突变, 导致所编码的氨
基酸从天冬氨酸转变到谷氨酸, 但未引起蛋白质疏
水性的变化; 距起始密码子 591 bp处发生 A/G的同
义突变; 距起始密码子 611 bp处发生 G/C的同义突
变。Glyma06g16440.2 (图 7-b)在距起始密码子 681 bp
处存在 1 个同义突变, 突变类型为 G/A。这些变异
是否导致基因功能的变异还需进一步的功能分析。
3 讨论
3.1 逆境相关 GmNAC基因的挖掘
高温、低温、干旱、盐碱等非生物逆境胁迫严
重影响大豆的生长, 造成大豆的大幅度减产甚至绝
产。NAC 类转录因子在水稻、拟南芥等植物的生长
发育、衰老、细胞分裂、逆境胁迫等途径中发挥着
重要的作用。前人利用大豆基因组数据库获得 152
个 GmNAC 基因[23-25], 本研究利用植物转录因子数
据库获得 175个GmNAC基因, 这可能是基于的数据
库不同造成的。李伟等[28]在分析 22种 NAC蛋白进
行时发现非生物逆境相关的 NAC 蛋白聚成一类。
You等[29]利用同源分析鉴定了 18个可能参与非生物
逆境应答的二穗短柄草 NAC基因, 同时分析 101个
二穗短柄草的NAC基因在非生物逆境胁迫和逆境相
关激素处理下的表达模式, 证实这 18个基因可能在
非生物逆境应答中发挥功能, 进一步证实基于进化
树分析的功能预测在逆境相关 NAC基因挖掘上的可
行性。Tran等[22]在大豆中克隆了 31个 GmNAC基因,
发现 9个 NAC基因能同时响应干旱、高盐、冷、ABA
等胁迫应答, 且与前人报道的逆境相关 NAC基因聚
成一类, 本研究经聚类分析发现 11 个大豆 GmNAC
基因与拟南芥和水稻中报道的逆境相关的 NAC基因
位于同一分支, 推测这 11 个 NAC 为大豆逆境相关
基因。王洋等[25]将大豆 NAC基因分为 10个亚家族,
其中第 6 亚家族包含的 11 个基因与本研究推测的
逆境相关候选基因相同。研究表明 , 11个基因中 ,
GmNAC011、GmNAC022、GmNAC043、GmNAC085、
GmNAC092、GmNAC101和 GmNAC109受干旱胁迫
诱导[23-24], 同时过表达 GmNAC011 的拟南芥能够提
高盐胁迫和冷胁迫耐性[26-27], 说明位于同一分支的
11 个候选基因可能均参与大豆逆境胁迫的应答。本
研究同时发现, GmNAC11 (Glyma19g28476)等 [26-27]
多个逆境诱导基因位于相邻分支, 可能暗示大豆中
存在着更多的逆境相关 NAC基因。Glyma12g13710.1
等[23-24]干旱诱导基因距离水稻和拟南芥的逆境相关
NAC 基因较远, 这些基因参与其他未知的逆境调控
途径。
3.2 候选 GmNAC基因的盐胁迫诱导
植物的逆境胁迫应答由多个复杂的网络通路共
同调控, NAC受多种逆境、激素诱导。AtNAC019、
AtNAC055、AtNAC072等基因参与高盐应答反应[5-8],
其在大豆中的同源基因在本研究中均受 NaCl诱导。
大豆逆境相关候选 GmNAC 基因的表达在根部高于
叶片, 这与前人的结果是一致的。NaCl 胁迫下, 候
选 GmNAC 在根部和叶片的表达模式不同, 这可能
暗示大豆对盐胁迫应答存在组织特异性。
Glyma12g35000.1、Glyma06g38410.1、Glyma13g35
550.1在耐盐品种齐黄 34和徐豆 10中表达量均低于
在盐敏感品种汾豆 95 中 , Glyma14g24220.1、
Glyma06g16440.2、Glyma06g11970.1、Glyma04g3856
0.1 和 Glyma05g32850.1 在耐盐品种齐黄 34 和徐豆
10中表达量均高于在盐敏感品种汾豆 95中, 这可能
与大豆品种的耐盐性差异有关。Hao等[26-27]研究表明,
NaCl 胁迫下 GmNAC011 在叶片中的表达量显著上
升, 并在 12 h达到表达高峰; 本研究表明, NaCl诱
导下 GmNAC011 在叶片中的表达量显著上升, 但在
6 h时达到表达高峰, 这可能与取样时间、大豆品种、
NaCl 处理浓度等多种因素有关 , 本研究还发现 ,
GmNAC011 在大豆根部受 NaCl 的诱导程度弱于在
叶片。NaCl胁迫下, 除 Glyma12g22880.1外, 其他
10 个基因在叶片中的变化程度远大于在根部 , 且
同一个基因在根和叶片中表现出不同的表达规律 ,
这可能与基因参与的代谢通路有关。NaCl 胁迫下,
数个基因在汾豆 95的表达高峰比齐黄 34和徐豆 10
中相对提前可能与品种的盐敏感程度有关。
Glyma06g11970.1 和 Glyma06g16440.2 在齐黄 34、
徐豆 10 和汾豆 95 中存在序列差异, 这可能与品种
的耐盐性有关, 这些变异位点的作用还需要进一步
的功能分析。
4 结论
获得了 3 个盐胁迫相关的 GmNAC 基因
(Glyma04g38560.1、 Glyma06g11970.1 和 Glyma0
6g16440.2), 其 中 Glyma06g11970.1 和 Glyma0
6g16440.2在徐豆 10、齐黄 34和汾豆 95中存在 SNP
位点。
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