全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014, 40(1): 54−62 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2011AA10A101)资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 邓其明, E-mail: dengqmsc@163.com, Tel: 1388065608; 李平, E-mail: liping6575@163.com, Tel:
13908070452
第一作者联系方式: E-mail: libin15999211540@sina.com, Tel: 18215636447
Received(收稿日期): 2013-05-08; Accepted(接受日期): 2013-06-16; Published online(网络出版日期): 2013-10-22.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20131022.1653.013.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2014.00054
一个粳稻来源抗稻瘟病基因的鉴定、遗传分析和基因定位
李 彬 1 邓元宝 1 颜学海 1 杨 阳 1 刘彭强 1 杜 勇 1 谢 培 1
王德正 2 邓其明 1,* 李 平 1,*
1四川农业大学水稻研究所, 四川温江 611130; 2安徽省农业科学院, 安徽合肥 230031
摘 要: 7001S 是一个广谱抗稻瘟病的粳稻两用核不育系, 对来自全国不同稻区的 22 株稻瘟病菌系均表现为高度抗
性。通过构建 7001S/80-4B F2群体的遗传分析和初步定位表明, F2分离单株对稻瘟病菌的抗性呈明显的抗、感双峰分
布, 抗感分离符合 3﹕1的理论比例, 说明粳稻 7001S对稻瘟病菌的抗性由 1对显性核基因或一个显性 QTL位点控制,
并将该基因初步定位于第 11 染色体长臂末端。进一步通过扩大遗传群体和分子标记开发, 利用基于 BSA 的隐性群
体分析技术, 将目的基因精细定位于 P21-2415 和 RM27322 之间约 310 kb的范围内, 并获得了可用于分子标记辅助
选择的紧密连锁和共分离分子标记, 同时对目标基因所在区域进行基因预测, 初步确定了候选基因。为进一步开展该
抗稻瘟病基因的克隆、功能验证和抗病机理研究, 以及通过分子标记辅助选择技术培育抗稻瘟病水稻新品种等工作
奠定了基础。
关键词: 稻瘟病; 7001S; 抗性基因; 分子标记; 遗传分析; 精细定位
Identification, Genetic Analysis and Gene Mapping of a Rice Blast Resistance
Gene in Japonica Rice
LI Bin1, DENG Yuan-Bao1, YAN Xue-Hai1, YANG Yang1, LIU Peng-Qiang1, DU Yong1, XIE Pei1, WANG
De-Zheng2, DENG Qi-Ming1,*, and LI Ping1,*
1 Rice Research Institute of Sichuan Agricultural University, Wenjiang 611130, China; 2 Anhui Academy of Agricultural Sciences, Hefei 230031,
China
Abstract: 7001S is a male-sterile rice with broad-spectrum resistance to rice blast pathogens and highly resistant to 22 strains of
Magnaporthe oryzae (M. oryzae). The F2 generation of hybrid between 7001S and 80-4B showed significant resistance to rice
blast pathogens. The ratio of resistant plants: susceptible plants was 3:1, indicating that the resistance of 7001S to the rice blast is
controlled by one-dominant karyogene or a QTL locus. Molecular marker analysis showed that the rice blast resistance gene was
located on the terminal long arm of chromosome 11 between P21-2415 and RM27322, with genetic distance of 0.27 cM and
physical distance of 310 kb. Some co-segregated molecular markers were also found in this gene area and could be used for iden-
tifying candidate genes.
Keywords: Rice blast; 7001S; Resistance gene; Molecular markers; Genetic analysis; Fine mapping
水稻是重要的粮食作物, 世界上有一半以上的
人口以稻米为主食。稻瘟病是水稻最严重的病害之
一 , 分布广泛 , 危害严重 , 流行年份可造成水稻减
产10%~20%, 严重时可减产40%~50%以上, 甚至绝
收。据测算, 每年由稻瘟病造成的水稻损失足以养
活6000万人以上[1]。另外稻瘟病菌不仅侵染水稻, 还
能侵染小麦、大麦和粟等禾本科农作物。防治稻瘟
病的方法主要为药剂防治和推广抗病新品种。尽管
药剂防治对稳定水稻产量起了非常重要的作用, 但
所带来的问题也日渐突出: 一方面增加了农民的劳
第 1期 李 彬等: 一个粳稻来源抗稻瘟病基因的鉴定、遗传分析和基因定位 55


动成本, 另一方面还会造成严重的环境污染, 危及
自然界的生物多样性; 同时大量的农药残留对人类
的健康构成潜在威胁。实践证明, 利用水稻自身携
带的抗病基因是控制稻瘟病害最经济、有效、环保
的方法[2]。
到目前为止, 在水稻中至少报道了64个抗稻瘟
病位点共78个主效基因。这些基因成簇地分布于除
第3染色体外的所有水稻染色体上, 其中 Pb1、Pia、
Pib、Pi-d2、Pi-d3、Pik、Pik-h/Pi-54、Pik-m、Pik-p、
Pi-sh、Pit、Pi-ta、Piz-t、Pi1、Pi2、Pi5、Pi9、pi-21、
Pi-25、Pi-36、Pi-37、Pi-50、Pi-56等23个基因已被
成功克隆(Pi2、Pi9、Piz-t 和 Pi-50同为 Piz 位点上
的复等位基因; Pi1、Pik-h/Pi-54、Pik-m、Pik-p 同
为 Pik位点上的复等位基因; Pi-d3与 Pi-25等位)(国
家水稻数据中心)。在这些已报道的稻瘟病抗性基
因中, 除 Pi1、Pi2、Pi9、Pi-20、Pi-33、Pi-40、Pi-gm、
Pik-h 等具有广谱抗性外 , 其余多数表现为生理小
种特异性抗性。同时 , 目前所定位或克隆的稻瘟病
抗性基因多来源于地方品种或野生稻资源 , 而从
具有优良农艺性状的育种材料中定位或克隆抗性
基因的报道不多见。由于携带这些基因的种质资
源本身农艺性状较差 , 及在育种实践中不利基因
的连锁累赘 , 导致这些抗性基因难以被直接利用 ,
难以满足不同生态区域抗稻瘟病育种目标的要
求。因此 , 从农艺性状优良的品种中发掘新的广谱
抗稻瘟病基因 , 将有利于拓宽抗病基因的应用生
态区域 , 并缩短抗病品种的育种周期从而提高育
种效率。
7001S是光敏感核不育水稻农垦 58S与常规品
系 917杂交选育而成的粳型光敏核不育系。经多年
在安徽、四川、云南、贵州等稻瘟病重灾区种植鉴
定表明, 对稻瘟病表现高度抗性, 是一份理想的稻
瘟病抗性研究材料。本研究利用来自全国不同稻区
的 22 株稻瘟病菌系对 7001S 所含抗性基因系统评
价、遗传分析和基因初步定位和精细定位, 获得了
可用于分子标记辅助选择的紧密连锁和共分离的
分子标记, 同时在对该抗病基因精细定位的基础之
上, 对目标基因所在区域进行基因预测, 确定了候
选基因。为进一步开展该抗稻瘟病基因的克隆、功
能验证和抗病机制研究, 以及通过分子标记辅助选
择技术培育抗稻瘟病水稻新品种等方面的工作奠
定了基础。
1 材料与方法
1.1 植物材料
抗性基因供体材料为粳稻两系不育系 7001S (安
徽省农业科学院水稻研究所提供)。高感稻瘟病材料为
粳稻 80-4B (安徽省农业科学院水稻研究所提供)。诱
发品种为江南香糯(四川农业大学水稻研究所保存)。
1.2 供试菌系
用于稻瘟病抗性鉴定的稻瘟病菌系 ZA13、ZB3、
ZB9、ZB13、ZB14、ZB15、ZC15、ZD7、ZF1和 ZG1
由本实验室引进保存; 北1(007)、ZH2-1、91-13-2、
91-17-2和97-65-2由中国农业科学院作物科学研究
所稻病室提供; 菌株11-14、11-15、95-51-1、95-53-1、
95-56-1、97-28-1和97-41-1由四川农业大学水稻研究
所分别从芦山县眉东镇和雅安市草坝镇病株活体采
样分离获得。
1.3 亲本抗性鉴定、抗谱分析和强致病菌株筛选
2011年夏季在温江和雅安草坝将抗病品种
7001S、感病品种80-4B、7001S/80-4B F1和诱发品种
江南香糯按22株接种菌株分组隔离种植。4月8日播
种, 5月12日移栽。翻耙时按750 kg hm–2施水稻专用
复合肥作底肥。分别在三叶期和分蘖期追施尿素90
kg hm–2, 促进秧苗生长嫩绿, 利于病害发生和流行,
实验过程中采用生物防治法防范其他病虫害。分别
于移栽后2周和1个月用鉴定菌菌株的孢子悬浮液喷
雾接种, 接种后覆膜保湿24 h 促进发病。7月下旬,
在叶瘟完全稳定后调查病情并记录, 并筛选出强致
病菌株用于遗传分析群体接种。叶瘟以最高级为鉴
定结果 , 按国际水稻研究所9级制标准调查记录 ,
0~3级为抗病, 5~9级为感病。抗性分级标准如下:
0 级: 无病斑; 1 级: 叶片上产生针头状大小的
褐点型病斑; 2级: 稍大病斑; 3级: 小圆形稍长的灰
色病斑, 边缘褐色, 病斑直径 1~2 mm; 4级: 典型的
纺锤形病斑, 长 1~2 cm, 通常局限在两条主脉间,
危害面积不超过叶面积的 2%; 5级: 典型病斑, 危害
面积不超过叶面积的 10%; 6 级: 典型病斑, 危害面
积为叶面积的 11%~25%; 7级: 典型病斑, 危害面积
在叶面积的 26%~50%; 8级: 典型病斑, 危害面积为
叶面积的 51%~75%; 9级: 典型病斑, 危害面积为叶
面积的 76%至全叶枯死。
1.4 遗传群体构建
2011年夏季在雅安草坝种植 7001S/80-4B F2群
体。4月 8日播种, 5月 12日移栽, 单苗移栽, 栽插
规格为 17 cm × 23 cm, 翻耙时按 750 kg hm–2施水稻
56 作 物 学 报 第 40卷


专用复合肥作底肥。然后分别在三叶期和分蘖期追
施尿素 90 kg hm–2, 促进秧苗生长嫩绿, 利于病害
发生和流行, 实验过程中采用生物防治法防范其他
病虫害。分别于移栽后 15 d和 30 d用筛选出的强
致病菌株孢子悬浮液喷雾接种 , 接种后覆膜保湿
24 h 促进发病。7 月下旬, 在叶瘟完全稳定后调查
病情并记录。
1.5 DNA提取、PCR扩增及电泳分析
在接种结果调查完后, 分别取抗病亲本 7001S、
感病亲本 80-4B 及 7001S/80-4B 的 F2群体极端感病
单株和抗性单株的叶片提取 DNA。采用高效便捷的
水稻叶片 DNA 提取方法[3], 将其溶解在 TE 缓冲液
里(10 mmol L–1 Tris base, 0.1 mmol L–1 EDTA)。每份
DNA统一用 ddH2O稀释成 20 ng μL–1, 作为 PCR扩
增分析的模板。用本实验室已有的均匀分布于水稻
12条染色体上的 972对 SSR引物直接在抗、感亲本
间筛选多态性标记。以上引物由上海英潍捷基贸易
有限公司合成。20 μL的 PCR体系含 DNA模板 2 μL
(<0.5 μg)、SSR 引物 2 μL (0.2~0.4 μmol L–1)、
10×buffer (含Mg2+) 2 μL、dNTP (2.5 mmol L–1) 0.5 μL、
Taq DNA聚合酶 0.2 μL (2.5 U)、ddH2O 13.3 μL。在
美国 Thermo公司 PCR1000上进行扩增反应, 94℃预
变性 5 min, 94℃变性 45 s、55℃退火 45 s、72℃延
伸 1 min、32个循环, 72℃延伸 10 min。扩增产物经
3%的琼脂糖凝胶电泳直接检测。
1.6 BSA与 RCA分析
以粳稻抗病品种 7001S 与普感稻瘟病品种
80-4B 杂交得到 F2 群体作为精细定位群体, 含 376
个极端感病单株和 50 个抗病单株。采用 F2分离群
体分池法(BSA)结合隐性类型分析法(RCA), 对分子
标记和抗性基因进行连锁遗传分析。具体步骤如下:
(1)分别提取抗病亲本 7001S、感病亲本 80-4B 和江
南香糯、以及 F2代分离群体中部分抗病植株和全部
感病单株的 DNA, 选取 10个抗病株 DNA等量混合,
构建抗病池(R池); 选取 10个感病株DNA等量混合,
构建感病池(S池)。(2)利用分子标记对抗病亲本和感
病亲本进行多态性分析, 筛选出具有多态性的标记;
然后用在抗感亲本间具有多态性的标记对抗、感病
池 DNA进行扩增, 获得在抗、感病池间有多态性的
标记。(3)利用池间多态性标记对由 100 株极端感病
单株(隐性个体)组成的小群体进行 PCR 检测, 进一
步确定是否存在连锁关系。如果连锁, 用以对扩大隐
性单株群体进行扩增和连锁分析, 并用 Mapmaker/exp
3.0软件中的Mapdraw构建更加紧密的分子连锁图。
1.7 遗传图谱的构建
当目标基因被两侧的标记界定之后, 再用两侧
最近的标记分析 F2 群体 , 再用新开发的标记对所
有重组体进行检测, 根据重组体的减少情况逐步将
目的基因定位到更小区域内, 根据所有标记与目标
基因之间的遗传距离整合成一张遗传图。再利用
BLASTN分析, 将各个与目标基因连锁的标记锚定
到物理重叠群上, 标明各标记的物理位置和在各自
位点发生的重组数以及各个标记之间的物理距离。
2 结果与分析
2.1 7001S稻瘟病抗谱分析
将 抗 病 品 种 7001S、 感 病 品 种 80-4B、
7001S/80-4B F1 和诱发品种江南香糯按接种菌株分
组隔离种植。每组均种植抗病品种 7001S 及感病品
种 80-4B 各 2 行, 每行 10 株, 用江南香糯诱发。接
菌鉴定方法同抗病分析中采用的方法, 待叶瘟完全
稳定后调查病情, 叶瘟以最高级为鉴定结果, 并按
国际水稻研究所 9级制记录。
从表1可以看出, 在温江和雅安两地, 7001S 对
22个鉴定菌株均表现出高度抗性 , 抗级反应为0~3
级, 而感病品种80-4B 对所有鉴定菌系均表现感病,
其抗级反应为5~9级。所有菌株均能较充分地发病,
其中 ZB13、ZB15、97-28-1和97-41-1致病力最强, 发
病最充分。由此推断7001S对稻瘟病抗性较强, 抗性
稳定, 且抗谱广, 是一份具有重大应用前景的粳稻
抗性材料, 预示其可能含有重要的稻瘟病抗性基因
或稻瘟病抗性 QTL存在, 具有进一步深入研究和开
发的潜力。并将强致病标准菌株 ZB15确定为本研究
后续研究接种菌株。
2.2 7001S/80-4B杂种 F1代的抗性表现
为了进一步明确 7001S 所含稻瘟病抗性基因的
真实性及其基因的显/隐性关系, 以亲本抗性鉴定和
抗谱分析中发病最充分的菌株 ZB15对 7001S/80-4B
F1接种鉴定。从表 2可以看出, 7001S/80-4B杂种 F1
代无论对叶瘟还是穗颈瘟均表现为高抗 , 说明
7001S所含目标抗性基因或抗性QTL表现为显性, 预
示其在粳稻杂交水稻育种上具有广泛的应用前景。
2.3 抗性位点的遗传分析
F2 单株群体人工接种稻瘟病菌后, 待叶瘟完全
稳定后(图 1)调查病情, 调查及记录各株水稻的发病
情况和病斑的大小和多少 , 以最高级为鉴定结果 ,
第 1期 李 彬等: 一个粳稻来源抗稻瘟病基因的鉴定、遗传分析和基因定位 57


表 1 亲本抗性鉴定调查结果
Table 1 Result of parents’ resistance identification
温江 Wenjiang 雅安 Ya’an 菌株
Strain
菌株来源
Strain origin 7001S 80-4B 7001S 80-4B
ZA13 四川 Sichuan 0 7 1 9
ZB3 四川 Sichuan 0 5 0 9
ZB9 四川 Sichuan 1 7 1 9
ZB13 四川 Sichuan 2 9 2 9
ZB14 四川 Sichuan 1 5 0 9
ZB15 四川 Sichuan 2 9 3 9
ZC15 四川 Sichuan 1 7 1 9
ZD7 四川 Sichuan 0 7 0 9
ZF1 四川 Sichuan 0 5 1 7
ZG1 四川 Sichuan 0 7 0 9
北 1 Bei 1 中国科学院 Chinese Academy of Sciences 0 7 0 9
ZH2-1 中国科学院 Chinese Academy of Sciences 0 7 1 9
91-13-2 中国科学院 Chinese Academy of Sciences 1 7 1 9
91-17-2 中国科学院 Chinese Academy of Sciences 0 5 0 9
97-65-2 中国科学院 Chinese Academy of Sciences 0 5 0 9
11-14 四川雅安市草坝镇 Caoba, Ya’an, Sichuan 1 9 1 9
11-15 四川雅安市草坝镇 Caoba, Ya’an, Sichuan 1 9 1 9
95-51-1 四川雅安市草坝镇 Caoba, Ya’an, Sichuan 1 9 2 9
95-53-1 四川雅安市草坝镇 Caoba, Ya’an, Sichuan 0 7 1 9
95-56-1 四川雅安市草坝镇 Caoba, Ya’an, Sichuan 1 7 2 9
97-28-1 四川雅安市草坝镇 Caoba, Ya’an, Sichuan 2 9 3 9
97-41-1 四川雅安市草坝镇 Caoba, Ya’an, Sichuan 2 9 3 9

表 2 7001S/80-4B杂种 F1代的抗性鉴定结果
Table 2 Resistance identification in F1 population of cross between 7001S and 80-4B
叶瘟 Leaf blast 穗颈瘟 Panicle and neck blast
材料
Material 反应型
Reactive
最高级别
Highest
level
调查穗数
Survey number
of panicles
穗瘟
Panicle
blast
颈瘟
Neck
blast
病穗率
Diseased panicle
rate (%)
颈瘟率
Neck balst
rate (%)
穗颈瘟表现
Panicle and neck
blast features
F1 Resistant 0 63 1 0 1.56 0 Grade 1
80-4B Susceptible 9 64 6 39 9.38 60.94 Grade 9

调查记载标准按国际水稻研究所 9 级制进行抗感分
级。将统计结果绘制成分布曲线图(图 2)。从图 2可
以看出, F2单株对稻瘟病的抗性呈明显的抗、感分布,
可清晰地划分为抗病集团和感病集团。分别将分布
于抗性集团和感病集团的单株数统计和卡方检验 ,
结果表明: 在 F2代群体的 946 株中, 抗稻瘟病单株
为 694 株, 感病植株 252 株, 分离比为 2.75∶1.00,
卡方检验χ2 = 1.3545 (χ20.05,1 = 3.84）, 符合 3∶1的
理论比例, 说明 7001S 对稻瘟病菌的抗性由 1 对显
性核基因或一个显性 QTL位点控制。
2.4 多态性标记筛选和抗性基因初步定位
用本实验室已有的均匀分布于水稻 12条染色体
上的 972对 SSR引物对抗、感亲本进行多态性分析,
获得多态性标记 78 对。然后分别利用 F2群体中的

图 1 稻瘟病抗病区与感病区的对照图
Fig. 1 Cross reference map of the resistant area and
susceptible area to the blast
58 作 物 学 报 第 40卷



图 2 F2群体抗感分布
Fig. 2 Distribution of the resistance and susceptibility in F2
population
0~3抗病株; 6~9感病株。
0–3: resistant plants; 6–9: susceptible plants.

感病和抗病单株建立抗病池和感病池, 对 78对多态
性标记进一步筛选, 获得抗病池和感病池间的多态
性标记 RM4112和 RM2064 (图 3)。利用 RM4112和
RM2064对由 100株极端感病单株(隐性个体)组成的
小群体进行 PCR 检测表明, 目标基因与其具紧密连
锁关系, 目标基因被初步定位于第 11染色体长臂末
端 RM4112 和 RM2064 之间, 并将该抗稻瘟病基因
暂时命名为 Pi-ja。
2.5 抗性基因精细定位
在初步定位基础上, 在目标基因区域开发了相
应的 SSR、InDel和 CAPS标记, 其中有 9个标记与
目标基因连锁 , 分别是 S3-13、 I7-1、P21-2415、
N22-550、N22-3600和 S10-4 (表3和图4)。其中 S3-13
检测到2个重组体, 位于 RM27274一侧; P21-2415只
检测到了1个重组体也位于 RM27274一侧, 而 I7-1、
N22-550、N22-3600三个标记没有检测到重组体, 说
明这3个标记和目标基因共分离。另一个标记 S10-4
检测到了1个重组体与 RM27322检测到的重组体相
同, 说明 S10-4位于 RM27322一侧。最终将目的基因
定位在 P21-2415和 RM27322之间, 且与标记 I7-1、
N22-550、N22-3600共分离。

图 3 SSR标记在池中的电泳分离图
Fig. 3 Segregation patterns of the SSR markers in the pool
1: 7001S; 2: 80-4B; 3: 抗病池; 4: 感病池。
1: 7001S; 2: 80-4B; 3: resistant pool; 4: susceptible pool.

图 4 S3-13、P21-2415、N22-550、N22-3600、S10-4在 F2群体中重组体检测
Fig. 4 Recombinant detection in F2 population by S3-13 , P21-2415, N22-550, N22-3600, and S10-4
P1: 7001S; P2: 80-4B; 1~22: 极端感病个体; S3-13中 3、21, P21-2415中 3, S10-4中 16是重组单株。
P1: 7001S; P2: 80-4B; 1–22: susceptible individuals; 3, 21 in S3-13, 3 in P21-2415, 16 in S10-4 are recombinated individuals.

2.6 Pi-ja基因区域精细遗传连锁图
根据上述目标区域分子标记与目标基因 Pi-ja 的
遗传重组情况, 进一步整合遗传距离, 将连锁的标记
整合到遗传图谱上。在 F2 群体中 Pi-ja 被定位在
P21-2415和 RM27322之间的 0.27 cM区域内, 目标
基因Pi-ja与这 2个标记之间均只发生了 1次重组, 并
与 I7-1、N22-550、N22-3600三个标记共分离(图 5)。
2.7 Pi-ja基因区域物理图构建
根据各标记在物理重叠群上着陆的位置, 构建
了 Pi-ja基因区域的电子物理图(图 6)。从 RM27274
到 P21-2415之间一共 9个重叠克隆组成的重叠群覆
盖了 Pi-ja 基因区域, 本研究中用于定位 Pi-ja 基因
的主要分子标记被锚定在此图上, 目的基因最终被
定位在标记 P21-2415和 RM27322之间约 310 kb的
范围内。
2.8 候选基因的预测与分析
利用 RGP在线基因预测软件 RiceGAAS (http://
ricegaas.dna.affrc.go.jp/), 结合在线数据库 GRAMENE、
TIGR、NCBI的基因注释, 在 Pi-ja定位区间内确定
了 3个具有抗病基因结构特征的候选基因(表 4), 其
第 1期 李 彬等: 一个粳稻来源抗稻瘟病基因的鉴定、遗传分析和基因定位 59


表 3 在 F2群体中与抗性基因连锁的标记
Table 3 Markers linked to resistance gene in F2
标记
Marker
引物序列
Primer sequence (5–3)
标记类型
Type of marker
内切酶
Enzyme
F: GGTTCAATGCTTACCTGCGTAGC
RM27274
R: AGCAAAGGTGCACAACAATGAGC
SSR
F: AGAGCCCATGTAGCTACGCCTTCG
RM27322
R: AATCATGCCGGCTGAAATTGTACC
SSR
F: CGCCAATGCCAACATGACAG
S3-13
R: GCCGACAAAGTCCGTGGTAT
SSR
F: ATGTAGCTACGCCTTCGTGG
S10-4
R: CCCAGTCAAGCACTGTAGGG
SSR
F: GCCAGAAGTGGAATTAGCCGA
I7-1
R: GCAGGTGCTGGTAGGATAATCG
InDel
F: ACTGCCAGAAACTGTATTG
P21-2415
R: AAGTTGCCAGATGTAAGTG
CAPS Dra I
F: GGCAGGCCAACTGCAAACTATAT
N22-550
R: GCCAATGCCAATCAGGTGGT
CAPS Bal I
F: CTGTGGGCTCACACGAACTC
N22-3600
R: TCGCTGAGTTGTGCGCTCTA
CAPS Ssp I

表 4 目标区域基因的预测结果
Table 4 Results of gene prediction in target regions
基因
Gene
起始位置
Start
终止位置
End
功能
Function
LOC_Os11g45980 27348695 27353306 NBS-LRR type disease resistance protein
LOC_Os11g46100 27435847 27437430 NBS-LRR type disease resistance protein
LOC_Os11g46200 27506754 27511983 Leucine Rich Repeat family protein


图 5 F2群体中 Pi-ja遗传连锁图
Fig. 5 Genetic linkage map of Pi-ja in F2

中LOC_Os11g45980和LOC_Os11g46100两个是NBS-
LRR类型的基因, LOC_Os11g46200是LRR类型基因。
测序结果表明, 候选基因 LOC_Os11g46100全
长 1.6 kb, 在抗性亲本 7001S和感病亲本 80-4B之
间序列完全相同, 因此将 LOC_Os11g46100排除。
候选基因 LOC_Os11g46200 编码 LRR 类抗病蛋白,
含 3个外显子, 基因总长 3378 bp, 编码 1125个氨
基酸, 对该基因的蛋白质结构预测显示, 它包含 1
个 ATP 激酶结合位点和一个富亮氨酸重复序列结
构域。候选基因 LOC_Os11g45980在 Gramene上的
注释是编码 NBS-LRR抗病蛋白, 含有 3个外显子,
基因总长 3821 bp, 编码 1135个氨基酸。测序发现
其基因序列、cDNA和氨基酸序列在亲本间均存在
差异: 在抗性亲本 7001S中 LOC_Os11g45980具有
4个外显子, 基因总长 5255 bp, cDNA全长 2976 bp,
编码 991 个氨基酸; 而在感病亲本 80-4B 中 LOC_
Os11g45980仅具有 2个外显子, 基因总长 5272 bp,
cDNA全长 3402 bp, 编码 1133个氨基酸(图 7)。根
据序列差异设计了 2 个 CAPS 标记 N22-3600 和
N22-550, 2个标记在定位群体中均未检测到重组体,
表现为共分离。
60 作 物 学 报 第 40卷



图 6 Pi-ja基因区域的物理图
Fig. 6 Physical mapping of Pi-ja gene locus
染色体; BAC克隆; 点线表示各个标记的物理位置。
rice chromosome; BAC clone; Dot lines indicates the physical location of each marker.

图 7 7001S和 80-4B中 LOC_Os11g45980氨基酸序列的差异
Fig. 7 Difference of LOC_Os11g45980 amino acid sequence in 7001S and 80-4B
阴影部分表示抗感亲本氨基酸差异。
The shading parts indicate amino acid differences between resistant and susceptible parents.

3 讨论
近年来, 各国科学家对稻瘟病的发生机理以及
水稻的抗性机制进行了大量研究并取得了巨大突
破。然而, 由于稻瘟病小种的快速变异以及环境的
复杂性, 含有单一抗病基因的品种种植几年后就会
失去其原有的抗性。因此, 挖掘新的抗病基因资源,
采用分子标记进行多基因聚合育种, 培育新的具有
广谱抗性的水稻品种成为水稻抗病育种的关键。
7001S对 ZA13、ZB3、ZB9、ZB13、ZB14、ZB15、
ZC15、ZD7、ZF1 和 ZG1, 中国农业科学院作物科
学研究所稻病室提供的北 1 (007)、ZH2-1、91-13-2、
91-17-2 和 97-65-2, 以及由四川农业大学水稻研究
所分别从芦山县眉东镇和雅安市草坝镇病株活体采
样分离获得的 11-14、11-15、95-51-1、95-53-1、
95-56-1、97-28-1 和 97-41-1 等 22 株强致病性菌株
都有很好的抗性, 是理想的稻瘟病抗性资源。该基
因的鉴定、定位克隆和应用, 将对我国水稻特别是
粳稻稻瘟病抗性改良发挥重要的作用。
稻瘟病抗性基因遗传相当复杂, 一般由1个或2
个主效 R基因控制, 有些由3个或更多主效 R基因控
制, 少数情况下由隐性 R 基因或不完全显性 R 基因
控制, 不同 R基因间相互独立或存在互作关系[4]。到
目前为止在水稻中至少报道了64个抗稻瘟病位点 ,
其中已经成功克隆24个抗病基因 [5-16], 同时也克隆
了7个[8]对应的无毒基因。从染色体分布来看, 这些
抗性基因在水稻基因组第3染色体以外的其余11条
第 1期 李 彬等: 一个粳稻来源抗稻瘟病基因的鉴定、遗传分析和基因定位 61


染色体均有分布, 但在第6、第11和第12染色体上分布
尤为集中。这些已克隆的抗稻瘟病基因中除 Pi-21[17]
为隐性抗病基因外 , 均是显性基因 ; 除 Pi-21和
Pb1 [18]为数量性状基因外, 都是质量性状的抗性基
因; 从基因结构特征看, 除 Pi-21和 Pi-d2 [19]分别编
码一个富含脯氨酸蛋白和类受体激酶外 , 都属于
NBS-LRR 类基因。另外 , 在长臂末端 SSR 标记
RM1233~RM27369之间存在一个大的基因簇[20], 包
含 Pik [21]、Pik-p [22]、Pik-m [5]、Pi1 [7]、Pi5 [22]和 Pia [23]
6个基因 , 这些基因均需要其对应基因座的两个紧
密连锁的 NBS-LRR基因同时存在才能发挥抗病性。
Pik 位点存在多个等位基因可能是平衡选择的结
果 [21]。平衡选择理论认为自然选择的作用没有使某
基因位点的等位基因频率上升或下降, 而是使该基
因座上2种或2种以上的等位基因保持平衡[24]。Tian等[25]
发现抗病基因呈等位分布的情况在其他植物中也广
泛存在, 比如小麦抗白粉病基因[26]位点与亚麻抗锈
病基因 L 位点[27], 也发现拟南芥抗病基因座 RPS5
同时存在多个功能等位基因, 并认为这是植物抵抗
病原菌的一种选择机制。本研究采用 BSA 和 RCA
分析方法,将7001S的广谱抗性基因Pi-ja精细定位在
第11染色体的标记 P21-2415和 RM27322间约310 kb
的范围内。定位标记等位分析结果表明 , pik-h 和
pi-54在标记 RM224和 Y6855A 之间2 cM, 而 pi-54
和 RM206紧密连锁。Pik-m在 RM254和 RM144之间
1.2 cM, 并且与之紧密连锁 , 而 Pi-ja 定位于
P21-2415和 RM27322之间。经 Gramene数据库比对
发现 Pi-ja 在 Pik-m 和 Pik 的定位标记范围之内, 但
与 Pi-54 (Pik-h)和 Pik-p 等位位置略有不同。说明
Pi-ja 可能属于 Pik 基因簇的一个等位变异基因。但
本研究发现的主效抗性基因 Pi-ja 与 pik、Pik-m 及
Pik-p的具体关系, 还有待进一步深入研究。
近年全国两系杂交稻种植面积占杂交稻播种面
积的 25%以上[31], 两系法已成为水稻杂种优势利用
的主要途径之一。然而, 目前生产上使用的水稻两
用核不育系对稻瘟病抗病和耐病能力普遍较低 [32],
因此培育对稻瘟病具有持久广谱抗性的粳型两用核
不育系将对两系杂交水稻的发展具有重要作用。本
研究精细定位 7001S 的主效抗性基因 Pi-ja, 一方面
为进一步通过图位克隆该抗性基因奠定了基础; 另
一方面 , 获得的与目标基因紧密连锁的分子标记
P21-2415和 RM27322, 为通过分子标记辅助选择技
术改良水稻两用核不育系的稻瘟病抗性提供了实用
的分子标记。
4 结论
来源于粳稻两系不育系 7001S 的抗稻瘟病基因
受 1对显性基因控制, 对来自全国不同稻区的稻瘟病
菌株均表现较强的抗性, 具有抗性强、抗谱广的特点,
是一份理想的稻瘟病抗性资源。将目的基因定位在第
11染色体上 P21-2415和 RM27322之间约 310 kb的
范围内, 构建了 Pi-ja 基因区域的精细遗传连锁图谱
和物理图谱, 开发了与目的基因共分离的分子标记
I7-1、N22-550 和 N22-3600, 此标记已经完全满足分
子标记辅助选择的要求, 在目的基因成功克隆之前,
可以利用这些分子标记开展分子标记辅助育种, 将
目标基因导入目前大面积推广的粳稻品种中, 改良
粳稻品种的稻瘟病抗性。获得 2 个候选基因
LOC_Os11g45980 和 LOC_Os11g46200, 目前正在进
行转基因功能验证和干涉实验验证其功能。
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