全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014, 40(9): 17021709 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由国家自然科学基金项目(31170650), 浙江省自然科学基金重点项目(Z3100473), 浙江省农业新品种选育重大专项(2012C2905-3)
和国家现代农业产业技术体系建设专项(CARS-23)资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 王新超, E-mail: xcw75@tricaas.com, Tel: 0571-86653162; 杨亚军, E-mail: yjyang@tricaas.com, Tel:
0571-86650226
第一作者联系方式: E-mail: caohongli@tricaas.com, Tel: 0571-87311569
Received(收稿日期): 2014-01-08; Accepted(接受日期): 2014-04-16; Published online(网络出版日期): 2014-05-16.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20140516.1002.019.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2014.01702
茶树 bZIP转录因子基因 CsbZIP1的克隆与表达定位
曹红利 岳 川 周艳华 王 璐 郝心愿 杨亚军* 王新超*
中国农业科学院茶叶研究所 / 国家茶树改良中心 / 农业部茶树生物学与资源利用重点实验室, 浙江杭州 310008
摘 要: 碱性亮氨酸拉链蛋白(bZIP)作为真核生物中分布最广、最保守的一类转录因子, 参与多种生物学过程, 尤其在
植物抵御各种逆境胁迫中有重要作用。采用 RACE和 RT-PCR技术克隆到茶树 bZIP转录因子基因全长 cDNA序列, 命
名为 CsbZIP1(GenBank登录号为 JX050148.1)。该基因 cDNA全长 1515 bp, 包含 813 bp的完整开放阅读框(ORF), 编码
270个氨基酸, 预测分子量 29.484 kD; 含有 bZIP家族典型的 BRLZ结构域碱性结构域和亮氨酸拉链, 属于 B-zip1家族;
系统发育树分析显示 CsbZIP1属于 bZIP转录因子 F亚家族; 亚细胞定位结果表明 CsbZIP1主要定位于细胞核; qRT-PCR
分析表明, 4℃低温和 NaCl盐胁迫处理均能诱导 CsbZIP1的表达, 表达量变化趋势都是随着胁迫时间先逐渐升高, 到 24 h
时降低, ABA胁迫处理 24 h抑制 CsbZIP1的表达。推测 CsbZIP1与茶树低温、盐等逆境胁迫密切相关。
关键词: 茶树; bZIP转录因子; CsbZIP1; 亚细胞定位; 克隆表达
Molecular Cloning and Expression of a bZIP Transcription Factor Gene
CsbZIP1 in Tea Plant (Camellia sinensis)
CAO Hong-Li, YUE Chuan, ZHOU Yan-Hua, WANG Lu, HAO Xin-Yuan, YANG Ya-Jun*, and WANG
Xin-Chao*
Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences / National Center for Tea Improvement / Key Laboratory of Tea Biology and
Resources Utilization, Ministry of Agriculture, Hangzhou 310008, China
Abstract: The basic leucine zipper proteins (bZIP) are one of the most extensive and conserved transcriptional factors families in
eukaryotes, and plant bZIPs play important roles in many biological processes, especialy for resisting abiotic stresses. In this study,
a bZIP full-length cDNA sequence was cloned using RACE and reverse transcription-PCR(RT-PCR) techniques from tea plant
(Camellia sinensis). The obtained full-length cDNA was named CsbZIP1 with GenBank accession number JX050148.1. It is 1515 bp
in length, containing a 813 bp open reading frame (ORF), encoding 270 amino acid residues with 29.484 kD molecular weight,
and containing a typical BRLZ motif (basic region domain and leucine zipper domain) of B-zip1 family. The phylogenetic tree
analysis revealed that CsbZIP1 belongs to F subfamily of bZIP. The subcellular location showed that CsbZIP1 protein is located in
nucleus. The qRT-PCR analysis indicated that the expression level of CsbZIP1 was up-regulated by cold (4 ) and salt (NaCl) ℃
treatments, and both expression amounts increased at first, then declined after 24 hours. However, the expression pattern was
down-regulated by ABA treatment within 24 hours. These results demonstrated that CsbZIP1 could be associated with cold and
salt stresses in tea plant.
Keywords: Tea plant (Camellia sinensis); bZIP transcription factor; CsbZIP1; Subcellular localization; Cloning and expression
茶树(Camellia sinensis)原产于热带及亚热带, 是一种
喜温畏寒的经济作物。茶树生长和茶叶生产受低温、干旱
等环境条件的制约, 发掘茶树抗性基因, 培育抗性较强的
茶树品种有重大意义。转录因子(transcription factors, TFs)
在植物响应逆境胁迫中具有重要的作用。它能够激活或者
抑制下游基因的转录 , 使植物适应或抵御外界环境的变
化。近年来, AP2/EREBP、MYB、NAC、WRKY和 bZIP
等转录因子在植物逆境响应中被广泛研究[1]。其中, bZIP
是真核生物中分布最广、最保守的一类转录因子[2], 与植
物抵御多种逆境胁迫密切相关 , 但在茶树上还没有相关
第 9期 曹红利等: 茶树 bZIP转录因子基因 CsbZIP1的克隆与表达定位 1703
研究报道。因此, 克隆茶树 bZIP转录因子基因, 分析其不
同逆境胁迫下的表达特性 , 为茶树抗性机制研究与抗性
育种提供理论基础有重要意义。
bZIP转录因子(basic region/leucine zipper proetin), 由
一个与 DNA结合的碱性结构域和一个亮氨酸拉链二聚体
组成, 是转录因子中最大家族之一[2]。植物 bZIP蛋白主要
专一结合核心序列为 ACGT 回文结构的顺式作用元件,
如 A-box (TACGTA) 、 C-box (GACGTC) 和 G-box
(CACGTG)等元件[3]。目前已经在拟南芥[4]、水稻[5]和豆
科植物[6]等基因组中发现大量的 bZIP 家族基因。它们参
与多种生物学过程, 包括光信号传导、花的发育、种子成
熟、病菌防御以及各种非生物胁迫的响应等[4,7-10]。近年
来, 已从玉米[11]、番茄[12]、高粱[13]、胡椒[14]、苎麻[15]等
植物中克隆到逆境相关的 bZIP 转录因子, 并证实它们与
植物抗性密切相关。Wang等[16]在烟草中过表达刚毛柽柳
(Tamarix hispida) ThbZIP1, 能显著提高转基因烟草的耐
盐性。Chen等[17]在水稻中克隆到一个 OsbZIP16, 进一步研
究显示OsbZIP16能正调控水稻抗旱性, 并且转基因水稻的
抗寒性显著增强。Liao等[8]在拟南芥中过表达水稻 bZIP转
录因子基因GmbZIP44、GmbZIP46、GmbZIP62和GmbZIP78,
结果显示转基因植株的耐盐性和抗寒性都得到提高。
前期, 本课题组进行了茶树冷驯化转录组测序, 从中
获得了一批受低温诱导差异表达的 bZIP 转录因子的 EST
片段[18]。本研究通过 RACE 技术, 克隆茶树 bZIP基因的
cDNA 全长, 并对其进行生物信息学分析和亚细胞定位,
以实时荧光定量 PCR分析其在低温、ABA和高盐胁迫处
理下的表达模式, 探究 bZIP 转录因子与茶树抗逆性的关
系, 为茶树抗逆基因工程提供候选基因资源和理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料和试剂
所用的茶树品种为特早生国家级茶树品种龙井43,
种植于中国农业科学院茶叶研究所国家种质杭州茶树圃。
参照已报道的茶树胁迫处理 [19-21]及本实验室前期试验结
果[22], 从日光温室中选取生长正常且长势相近的3年生盆
栽茶树若干盆, 分别在低温(4 )℃ 、ABA (100 μmol L–1)和
NaCl (250 mmol L–1)胁迫下试验。
SMART RACE cDNA Amplication Kit和 Advantage
Polymerase Mix 购于 Clontech 公司(Mountain View, CA,
USA); SYBR Premix Ex Taq II (Perfect Real Time)、DNA
Marker、TA Cloning Kit PCR2.1 Vector、大肠杆菌 DH5α
感受态细胞和 Taq 聚合酶为 TaKaRa 公司产品(大连);
DNase I Digestion of RNA Preparation、First-Strand cDNA
Synthesis购自 Invitrogen公司(Carlsbad, USA); 琼脂糖凝
胶回收试剂盒购自 Axygen公司(California, USA); RNA提
取试剂盒购自天根公司(Tiangen, 北京)。脱落酸(ABA)购
于 SIGMA 公司, NaCl、无水乙醇等为国产分析纯试剂。
由上海华津生物技术公司合成引物并测序。
1.2 总 RNA提取和 cDNA合成
参照离心柱型植物总RNA快速提取试剂盒说明书提
取茶树叶片总RNA。检测RNA浓度和完整性后于–80℃保
存备用。用1 μg总RNA为模板, 参照SMART RACE cDNA
Synthesis Kit的操作步骤合成5′和3′的cDNA, 用于RACE
扩增, 以及反转录PCR (RT-PCR)扩增基因的全长开放阅
读框(ORF)和亚细胞定位载体构建的PCR扩增; 以5 μg总
RNA为模板, 按照DNase I Digestion of RNA Preparation和
First-Strand cDNA Synthesis试剂盒说明书合成cDNA, 稀
释 40倍后作实时荧光定量PCR (qRT-PCR)模板 , 进行
qRT-PCR检测。
1.3 CsbZIP1全长 cDNA克隆与生物信息学分析
1.3.1 茶树 CsbZIP1 基因的克隆 根据本实验室茶树
冷驯化转录组测序结果(NCBI 登录号为 SRA061043), 经
Blast比对筛选出与其他植物中报道的 bZIP基因高度同源
的 EST 序列, 设计 5′和 3′-RACE 特异引物 5′GSP/3′GSP
(表 1)。参照 SMART RACE cDNA Synthesis Kit的操作步
骤进行茶树 bZIP基因的 PCR反应, 反应条件为 94℃预变
性 4 min; 94℃变性 30 s, 68℃退火 30 s, 72℃延伸 2 min, 30
个循环; 72℃延伸 10 min。产物经 1%琼脂糖凝胶电泳检
测, 将目的条带回收纯化, 连接到 PCR2.1 载体, 转化大
肠杆菌 DH5α, 蓝白斑筛选阳性菌落, 挑取 10个白色单菌
落进行菌落 PCR 检测, 挑选 3~4 个阳性菌落送上海华津
生物公司测序。经去载体、拼接, 得到茶树 bZIP基因的 5′
和 3′端序列 , 与中间序列拼接 , 得到 bZIP 基因的全长
cDNA序列。在 ORF上、下游区域设计 RT-PCR特异引物
RT-F/RT-R (表 1), 以 PCR扩增验证 ORF序列。反应条件
为 94 4 min℃ ; 94 30 s℃ , 58 30 s℃ , 72 1 min℃ , 35个循
环。PCR产物经回收、连接、转化、测序和拼接后, 获得
完整的茶树 bZIP基因全长 cDNA序列。
1.3.2 CsbZIP1生物信息学分析 利用 NCBI的 BlastX
和BlastP进行核苷酸和氨基酸序列比对分析; 用DNAStar
表 1 试验引物及其序列
Table 1 Sequence of primers in this study
引物名称
Primer
序列
Sequence of primers (5′→3′)
引物名称
Primer
序列
Sequence of primers (5′→3′)
5′GSP TGGAAACCTTGTCTTGAGTTGCGG 3′GSP TCGTGAAGCGGTTCGCAAGTATC
RT-F CCTCTCATTCACACACTTGTCGTC RT-R CCAATCTCCCCTTCAATCCTCCC
CsbZIP1-qRT-F CCTCGGATGTCCACAAGCAA CsbZIP1-qRT-R CGTGAAGCGGTTCGCAAGTA
CsbZIP1-GFP-F AATAGGTACCATGGACGATGGGGAGATTGAT CsbZIP1-GFP-R ATAACTCGAGCCTTGCTGCACGAGTCCCTCCT
18S-F TCTCAACCATAAACGATGCCGACCAG 18S-R TTTCAGCCTTGCGACCATACTCCC
1704 作 物 学 报 第 40卷
软件查询开放阅读框; 用 ProtParam 预测蛋白质分子量和
理论等电点; 用 SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)
进行保守域分析; 用 DNAMAN 进行多序列氨基酸比对;
用 MEGA5.0 软件中的邻近相连法构建系统进化树; 用
NetPhos 2.0 Serve (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)
预测蛋白质磷酸化位点 ; 用 SWISS-MODEL (http://
swissmodel.expasy.org/workspace/)和 PyMol软件预测蛋白
质三级结构; 用 WoLF PSORT (http://wolfpsort.org/)进行
亚细胞定位预测。
1.4 CsbZIP1基因编码蛋白的亚细胞定位
1.4.1 载体的构建 以 CsbZIP1-GFP-F/CsbZIP1-GFP-
R 为引物, 扩增 CsbZIP1 基因, 纯化扩增产物, 用 Kpn I
和 Xho I 酶切, 回收酶切产物; 再用 Kpn I 和 Xho I 对
P2GWF7质粒进行酶切反应; 最后, 把酶切回收的 PCR产
物和质粒酶切片段连接, 构建载体 p2GWF7-CsbZIP1, 转
入 DH5α, 菌液 PCR、酶切筛选阳性克隆, 并对阳性克隆
进行测序验证。
1.4.2 P2GWF7-CsbZIP1 转化洋葱表皮细胞 取
50 mg mL–1金粉悬液 50 μL于离心管, 依次加入 5 μL质粒
DNA (1 μg μL–1), 50 μL CaCl2 (2.5 mol L–1)和 20 μL亚精胺
(0.1 mol L–1)(每加完一样可振荡 3 s), 静置 10 min; 然后
振荡 1 min, 冰上 10 min, 9400×g离心 10 s, 弃上清; 再用
80 μL 无水乙醇, 洗涤沉淀一次; 重新悬浮沉淀于 10 μL
无水乙醇中; 每次用 10 μL 滴于微粒载膜中央, 平铺, 晾
至完全干燥, 待用。取新鲜洋葱, 用无菌刀片切取肉质较
厚的 3~4 层鳞茎, 用镊子撕出表皮平铺于 MS 培养基上,
25℃预培养 4 h。选用 1100 psi的压力膜, 将 10 μL金粉
DNA 混合物滴在压力膜中央, 将洋葱表皮放在琼脂糖培
养基上, 采用 PDS1000/He型基因枪(Bio-Rad)轰击。将轰
击后的洋葱表皮细胞 25℃暗培养 16 h 后制片, 于激光共
聚焦显微镜下观察并照相。
1.5 CsbZIP1实时荧光定量 PCR表达分析
以茶树 18S 基因作为内参基因, 参照 SYBR Premix
Ex Taq II (Perfect real-time)的操作说明书对 CsbZIP1基因
的表达进行荧光定量 PCR分析, PCR体系为 SYBR Premix
Ex Taq 25 μL、10 μmol L–1上下游引物各 1 μL、ROX Dye
II 1 μL、cDNA 2 μL, 加水至终体积 50 μL。反应在 ABI
PRISM 7500实时定量 PCR仪上进行, 程序为 95 15 s, ℃
94 5 s, 60 34 s, 40℃ ℃ 个循环。反应结束后分析荧光值变
化曲线和熔解曲线, 采用 2–ΔΔCT法分析结果[23], 每个样品
3次重复。
2 结果与分析
2.1 CsbZIP1基因的克隆及生物信息学分析
2.1.1 CsbZIP1 全长 cDNA 克隆与序列分析 根据中
间 EST片段序列, 设计 5′和 3′-RACE特异引物, 分别扩增
出 928 bp和 410 bp的序列(图 1), 用 SeqMan软件把 3段
序列拼接初步得到 cDNA 全长 , 再查找其开放阅读框
(ORF), BlastX比对其 ORF, 在 ORF上下游设计引物进行
RT-PCR扩增验证, 扩增得到 813 bp的序列(图 1)。最终获
得该基因 cDNA 全长序列 1515 bp, 包含 813 bp 的完整
ORF, 编码 270个氨基酸, 理论等电点为 7.175, 推测分子
量 29.484 kD。NCBI比对分析结果表明, 它含有 bZIP家
族典型的 BRLZ 结构域 , 属于 B-zip1 家族 ; 与可可
(Theobroma cacao) EOX97663.1、大豆(Glycine max)
NP-001235033.1 的氨基酸相似性分别为 68%和 66%。
CsbZIP1 蛋白与其他植物 bZIP 氨基酸序列进行多序列比
对表明, 在 N 端具有保守的 bZIP 碱性结构域和亮氨酸拉
链(图 2)。对 CsbZIP1 氨基酸序列分析, 显示氨基酸序列
图 1 CsbZIP1的 RACE及 RT-PCR电泳结果
Fig. 1 Electrophoresis results of RACE fragments and RT-PCR fragments of CsbZIP1
图 2 CsbZIP1与其他植物同源 bZIP的氨基酸多序列比对
Fig. 2 Multiple amino acid alignment of CsbZIP1 with other species homologous bZIP
黑色画线标记为 bZIP家族保守的 N-x7-R/K-x9-L-x6-L-x6-L序列。
Conserved sequence N-x7-R/K-x9-L-x6-L-x6-L of bZIP family is underlined.
第 9期 曹红利等: 茶树 bZIP转录因子基因 CsbZIP1的克隆与表达定位 1705
第 95~127 位为典型的 bZIP 碱性结构域和亮氨酸拉链结
构域(图 3)。因此, 该基因属于 bZIP转录因子家族, 并命
名为 CsbZIP1 (GenBank登录号为 JX050148.1)。
2.1.2 CsbZIP1 蛋白与拟南芥 bZIP 蛋白的系统进化树分
析 根据 Jakoby 等[4]对拟南芥 bZIP亚家族的分类, 从
每个亚家族挑选取 2~3 个拟南芥 bZIP 基因, 采用 MEGA
5.0邻近相连法对CsbZIP1与 21个拟南芥 bZIP氨基酸序列比
对, 并构建系统进化树(图 4), 结果显示 CsbZIP1 与拟南芥
Group F聚为一类, 从理论上推测 CsbZIP1属于 bZIP转录
因子的 F亚家族。
2.1.3 CsbZIP1编码蛋白的磷酸化位点预测 用
NetPhos 2.0 Serve 预测 CsbZIP1蛋白磷酸化位点(图5)表
明 , 含有丝氨酸 (Serine)、苏氨酸 (Threonine)和酪氨酸
(Tyrosine)的多个磷酸化位点中以丝氨酸位点最多, 有13
个, 苏氨酸和酪氨酸位点各1个。由此推测磷酸化作用可
能与 CsbZIP1蛋白的活性调控有关。
图 3 CsbZIP1的 cDNA核苷酸序列及预测氨基酸序列
Fig. 3 Nucleotide and putative amino acid sequence of CsbZIP1
图中阴影部分为碱性结构域(N-x7-R/K-x9); 下画线部分为亮氨酸拉链结构域(L-x6-L-x6-L), 其中黑色反白标识为亮氨酸(Leucine)。
The shaded parts are basic region (N-x7-R/K-x9); underlined parts are leucine zipper motif; and black parts are leucine.
1706 作 物 学 报 第 40卷
图 4 CsbZIP1蛋白与 21个拟南芥 bZIP转录因子蛋白的进化树分析
Fig. 4 Phylogenetic tree analysis of CsbZIP1 protein with 21 Arabidopsis bZIP proteins
图 5 CsbZIP1蛋白磷酸化位点预测
Fig. 5 Phosphorylation site prediction of CsbZIP1 protein
2.1.4 CsbZIP1 编码蛋白的三级结构预测 用 SWISS-
MODEL预测 CsbZIP1蛋白的三级结构, 经过 PyMol软件
模拟分析, 得到 CsbZIP1 蛋白的三维结构图(图 6)。结果
显示与 Jakoby等[4]获得的拟南芥 bZIP蛋白的三级结构模
型图相似, 均含有 bZIP 转录因子典型的 α-螺旋和亮氨酸
拉链结构, 进一步证实获得的 CsbZIP1 属于 bZIP 转录因
子家族。
2.2 CsbZIP1编码蛋白的亚细胞定位
用 WoLF PSORT 软件进行亚细胞定位预测显示 ,
CsbZIP1主要定位在细胞核内。洋葱表皮亚细胞定位试验
的结果也显示 CsbZIP1 融合蛋白位主要定位于细胞核内
(图 7), 但是细胞内其他部位也检测到微弱信号。bZIP 定
位在细胞核内与它的功能密切相关。
2.3 CsbZIP1 在低温、ABA 和 NaCl 胁迫处理下的实时
荧光定量分析
荧光定量 PCR结果表明(图 8), 4℃低温处理能够诱导
CsbZIP1 的表达, 且随着处理时间的延长, 表达量在处理
8 h最大, 达到 11.59, 24 h降低为 6.72。100 μmol L–1 ABA
第 9期 曹红利等: 茶树 bZIP转录因子基因 CsbZIP1的克隆与表达定位 1707
图 6 CsbZIP1蛋白三维结构图
Fig. 6 3-D structure of CsbZIP1 protein
处理后 CsbZIP1 的表达被抑制, 2 h的相对表达量最低只有
0.2, 但随着胁迫的继续, 表达量逐渐上升, 在 24 h时表达量
升高到 0.90, 但没有超过 0 h的表达量。250 mmol L–1 NaCl
处理后, CsbZIP1的表达量呈先升高后降低的趋势, 处理 4 h
表达被诱导, 表达量达 3.86, 随着处理时间延长至 24 h, 表
达量降低为 1.21。CsbZIP1 在低温、高盐和 ABA 胁迫下均
响应, 低温能够显著诱导其表达, NaCl短时间内也能上调其
表达, ABA则能迅速抑制其表达。
图 7 CsbZIP1亚细胞定位
Fig. 7 Subcellular localization of CsbZIP1
图 8 逆境胁迫处理下 CsbZIP1的相对表达量
Fig. 8 Relative expression of CsbZIP1 under stress treatments
3 讨论
bZIP 作为一类重要的转录因子, 与植物逆境胁迫响
应密切相关, 但在茶树上鲜见报道。本研究通过 RACE和
RT-PCR技术克隆获得茶树中的一个 bZIP基因, 它与其他
植物 bZIP具有较高的同源性, 序列分析表明含有 bZIP转
录因子家族典型的碱性结构域和亮氨酸拉链结构(氨基酸
序列第 95~127 位), 属于 B-zip1 家族, 命名为 CsbZIP1。
CsbZIP1 蛋白与拟南芥不同亚家族 bZIP 蛋白的系统发育
树分析显示其与 F亚家族聚为一类。目前, 植物中关于 F
亚家族和 B 亚家族的研究报道较少 , 但其他亚家族在
ABA、逆境胁迫、种子发育、抗氧化、光信号转导、光合
作用以及糖信号转导等方面发挥重要作用[4,13,24]; 磷酸化
位点预测结果表明CsbZIP1蛋白含有多个磷酸化位点, 可
能与 bZIP 蛋白的活性调控有关。磷酸化和去磷酸化是
ABA 信号通路中的关键步骤, 低温、干旱和高盐等逆境
胁迫能够刺激植物体内 ABA 含量增加, 从而激活 SnRK2
蛋白激酶 , 将 bZIP 转录因子的保守域磷酸化 , 从而使
bZIP 蛋白活化, 再通过与顺式作用元件结合调控基因表
达, 以此来增强植物的抗逆性[3,25-26]。蛋白质三级结构预
测显示, CsbZIP1蛋白具有高度保守的由 α-螺旋和亮氨酸
形成的 bZIP结构域, 与报道的拟南芥 AtbZIP蛋白的三级
结构模型相似。
亚细胞定位预测显示 CsbZIP1 蛋白最可能定位于细
胞核, 另外还可能定位在叶绿体、质体和胞液。为了进一
1708 作 物 学 报 第 40卷
步验证CsbZIP1定位在核内, 通过洋葱表皮亚细胞定位试
验分析了它的亚细胞定位。试验结果与预测结果相近 ,
CsbZIP1 蛋白主要定位在细胞核, 同时在细胞的其他部位
也能够检测到微弱信号。这与其他植物 bZIP 转录因子的
亚细胞定位研究报道相一致[11,14,27]。
已有研究表明, bZIP 转录因子在非生物胁迫, 如干
旱、低温、高盐等中参与调控基因表达[2,9,13]。本研究用
qRT-PCR 分析 CsbZIP1 在 ABA、低温和盐胁迫下的表达
模式。依据前人[19-21]报道的茶树胁迫处理结果及本实验室
前期[22]的研究结果, 分别选用浓度 100 μmol L–1 和 250
mmol L–1的 ABA 和 NaCl 处理茶树。低温是限制茶树生
长的最重要影响因子之一, 但植物响应低温胁迫与 ABA
信号途径可能密切相关 , 为了分析 CsbZIP1 在低温和
ABA处理后的表达模式变化, 我们选取在处理后 0、2、8
和 24 h的样品试验。为了分析 NaCl处理在短时内对表达
的影响, 我们分析了处理后 4 h的表达, 通过与 0 h和 24 h
时的表达比较, 明确 CsbZIP1在短时(4 h)内的表达模式。
结果表明, CsbZIP1对低温和ABA处理的响应模式不尽相
同, ABA处理 2 h表达被迅速抑制, 从 2~24 h的过程中,
表达逐渐恢复到处理前的水平; 低温处理 2 h则诱导其表
达, 且在处理的 24 h 内表达均是上调的。说明在低温和
ABA处理后, 短时内(2 h)调控作用相反, 但在 2~24 h过
程中能够诱导 CsbZIP1表达, 与处理前相比, 低温下的表
达上调更显著, 表明CsbZIP1在低温胁迫响应过程中起着
重要作用。盐胁迫下, 4 h时的表达被显著上调, 24 h的表
达比 4 h低, 但仍比处理前 0 h的表达量高, 推测在处理
24 h内表达上调。Zou等[28]研究水稻 bZIP基因表明, 250
mmol L–1 NaCl处理 24 h内的表达量是上调的, 且 5 h的
表达量最高。说明 NaCl 处理对 bZIP 基因的诱导可能在
4~5 h 内就能够达到最大, 这为以后深入研究其在抗盐胁
迫中的功能提供了参考。
大量的研究结果表明, 不同的 bZIP 基因在逆境胁迫
中的表达模式不尽相同。Liao 等[8]将大豆 GmbZIP 44、
GmbZIP 46、GmbZIP 62和 GmbZIP 78 4个基因转到拟南
芥中过表达, 发现这 4个基因均能增强对高盐和低温逆境
的抗性, 而 GmbZIP 44、GmbZIP 62和 GmbZIP 78的过表
达能减弱 ABA 的敏感性, 表明这 3 个基因有可能通过上
调 ABI1 和 ABI2 基因的表达来参与 ABA 信号途径, 对
ABA、盐和低温逆境起负调控作用。Zou等[28]对水稻 bZIP
转录因子基因 OsABI5的表达研究表明, 4℃低温处理 24 h
后, 前 5 h的表达量是下调的, 10 h后表达量逐渐上调。
Orellana等[29]分离的番茄 bZIP转录因子基因 SIAREB1同
时受 ABA和 NaCl胁迫诱导, 100 μmol L–1 ABA处理 24 h
后, SIAREB1在叶片和根中的表达量是上升的; 300 mmol
L–1 NaCl处理 72 h后, 叶片和根中的表达量都是在 6 h最
大, 其后表达量降低。Ying等[11]克隆的玉米 ZmbZIP72基
因的表达结果显示, NaCl胁迫(200 mmol L–1)处理 24 h后,
表达量是增加的, 且在 24 h表达量最大; 而 4℃低温处理
24 h后, 表达量变化不大。Gao等[6]研究大豆 GmbZIP1在
不同逆境胁迫下的表达结果表明, 4℃低温处理 24 h 后,
GmbZIP1的表达量是逐渐升高的, 24 h的表达量最大, 与
本试验 4℃低温表达模式相似。另外, Schlögl等[30]对甘蔗
bZIP转录因子基因研究发现, 在 100 μmol L–1 ABA处理
12 h 后, ScbZIP29 和 ScbZIP31 的表达量是上调的, 而
ScbZIP24的表达量是下调的, 这与本试验的 ABA表达模
式是相似的。可见, bZIP基因在 ABA信号途径中可能起
正调控作用, 也可能是负调控作用。CsbZIP1可能还参与
其他生物学功能, Cheng等[31]认为 F亚家族的 bZIP转录因
子可能参与植物的光形态建成, 茶树 bZIP 的功能及其他
家族基因有待后续发掘。但是, 从表达结果来看, CsbZIP1
极有可能与茶树低温、盐、ABA胁迫等方面有密切关系。
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