全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014, 40(7): 1174−1181 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(31071484)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 赵开军, E-mail: zhaokaijun@caas.cn, Tel:010-82105852
第一作者联系方式: E-mail: jiashuangwei8@126.com, gaoying@caas.cn, Tel: 010-82108751 **同等贡献(Contributed equally to this work)
Received(收稿日期): 2014-01-27; Accepted(接受日期): 2014-04-16; Published online(网络出版日期): 2014-05-16.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20140516.1125.033.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2014.01174
芥菜锌指蛋白转录因子基因 Bj26的克隆与鉴定
贾双伟 1,∗∗ 高 英 1,∗∗ 赵开军 1,∗
中国农业科学院作物科学研究所 / 农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程, 北京 100081
摘 要: 锌指蛋白是一类重要的转录因子家族, 参与植物基因转录调节、发育及胁迫反应等生理过程。我们前期研
究发现芥菜诱导型启动子 BjC-P的W-box-like-4为其真菌诱导的核心元件, 本研究通过酵母单杂交技术从芥菜 cDNA
文库中筛选到与 W-box-like-4序列特异互作的转录因子基因 Bj26。生物信息学分析表明, Bj26含 735 bp的开放阅读
框, 编码一个新的 C2H2型锌指蛋白, 包括 2个典型的 C2H2型锌指结构及 2个植物特有的 QALGGH氨基酸保守序
列, 等电点 pI为 9.2, 分子量为 26.6 kD。亚细胞定位显示该蛋白位于细胞核。本氏烟瞬时表达分析表明 Bj26蛋白通
过与 BjC-P的真菌诱导核心元件序列特异互作, 激活启动子 BjC-P。实时荧光定量 PCR结果显示 Bj26在真菌诱导下
表达量明显增高。Bj26的 CDS序列与拟南芥和水稻中的 C2H2型锌指蛋白序列比对及进化树分析表明, Bj26与拟南
芥的 C2H2型蛋白同源性高于水稻。以上结果揭示 Bj26蛋白可能介导 BjC-P真菌诱导响应并参与植物抗真菌病原菌
的调控过程。
关键词: 酵母单杂交; C2H2锌指蛋白; Bj26基因; 真菌诱导; 瞬时表达; 实时荧光定量 PCR
Cloning and Characterization of Brassica juncea Zinc Finger Protein Tran-
scription Factor Gene Bj26
JIA Shuang-Wei1,∗∗, GAO Ying1,∗∗, and ZHAO Kai-Jun1,∗
National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement / Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences,
Beijing 100081, China
Abstract: Zinc-finger proteins, forming an important transcriptional factor family, are involved in gene transcriptional regulation,
development and stress-responses in plants. The previous studies revealed that BjC-P is a fungus-inducible promoter from Bras-
sica juncea and W-box-like-4 is the core element responsive to fungal infection. Here, we report the molecular cloning and char-
acterization of a zinc finger protein-encoding gene (designated Bj26). Bj26 was screened out from the Brassica juncea cDNA
library by the Yeast One-Hybrid System. Bioinformatic analysis showed that Bj26 contains open reading frame of 735 bp that
encodes a new C2H2-type zinc finger protein with an isoelectric point (pI) of 9.2 and a molecular weight of 26.6 kD. The protein
consists of two typical zinc-finger domains and contains two conserved QALGGH amino acid sequences. Subcellular localization
showed that Bj26 is located in the nuclear. The histochemical and quantitative GUS assays, through transient gene expression in
Nicotiana benthamiana leaf, showed that Bj26 can bind to the core element W-box-like-4 and activate the function of BjC-P.
qRT-PCR analysis showed that the gene Bj26 expression obviously increased under the induction of the fungal elicitor
(Hexa-N-Acetyl-Chitohexaose). CDS alignments and phylogenetic analysis of Bj26 and other C2H2-type proteins from Arabi-
dopsis thaliana (At) and Oryza sativa (Os) (MEGA 6) showed Bj26 shares high similarity with that from Arabidopsis thaliana
(At). All of the above results suggested that Bj26 protein mediates the process of plant response to fungal pathogen.
Keywords: Yeast One-Hybrid System; C2H2-type zinc finger protein; Bj26; Fungal-induction; Transient gene expression;
qRT-PCR
在植物中, 锌指蛋白(zinc-finger protein, ZFP)形 成一类较大的转录因子家族[1]。目前已报道了拟南
第 7期 贾双伟等: 芥菜锌指蛋白转录因子基因 Bj26的克隆与鉴定 1175


芥、矮牵牛、小麦、棉花、大豆、水稻等植物中的
一些锌指蛋白[2]。“锌指” “Zinc-finger”特指一类蛋白
结构域, 在这个结构域中一个锌原子被半胱氨酸残
基和组氨酸残基包围。根据半胱氨酸(C)和组氨酸(H)
残基的数目和位置可将锌指蛋白分为C2H2、C2HC、
C2HC5、C3HC4、CCCH、C4、C4HC3、C6和C8等
类型[1,3-5]。其中, C2H2 (Cys2/His2)型成员最多, 也是
研究最为深入的一类锌指蛋白, 是植物中最重要的
转录调节子家族之一[6-7]。如拟南芥有176个C2H2型
锌指蛋白, 水稻中有189个C2H2型锌指蛋白成员[6-7]。
研究表明该类蛋白在转录调节、发育、病原菌防御
以及胁迫反应等关键过程中发挥着重要的作用[7-11]。
例如水稻ZFP182能增强转基因烟草和水稻对盐胁
迫的抗性[12], 并在ABA诱导的抗氧化防御反应中发
挥重要作用 [11]; 水稻ZFP245和ZFP179过表达能够
增强超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)在
干旱、冷和盐胁迫条件下的活性, 以及增加水稻幼
苗对氧胁迫的抗性[13-14]; 马铃薯StZFP1在晚疫病病
原菌(Phytophthora infestans)侵染后表达增强[15]。
几丁质酶是一类病原相关蛋白, 参与植物生长
发育以及生物与非生物胁迫反应[16]。许多几丁质酶
过表达转基因植株增强了对细菌和真菌的抵抗性[16]。
BjCHI1是目前已知的植物中唯一含 2个几丁质结合
域(CBD)的几丁质酶基因[17]。BjCHI1不仅能抑制真
菌病原体 (Colletotrichum truncatum, C. acutatum,
Botrytis cinerea和 Ascochyta rabiei)的生长, 且能凝
聚革兰 (氏 )阴性菌 (Escherichia coli, Ralstonia so-
lanacearum 和 Pseudomonas aeruginosa)[18-19] 。
BjCHI1的转基因烟草和马铃薯的提取物呈现出抗绿
色木霉活性, 转基因马铃薯增强了马铃薯对立枯丝
核菌侵染的抗性[20-21]。在前期研究中, 我们分离克
隆了 BjCHI1基因启动子序列(BjC-P, GenBank登录
号为 AY714982), 明确了 BjC-P 的真菌诱导特性并
鉴定了真菌诱导核心元件(W-box-like-4)[22]。进一步
以含有 W-box-like-4的 125 bp序列为诱饵, 通过酵
母单杂交技术筛选芥菜 cDNA文库, 获得 10多个与
诱饵序列结合的蛋白。本研究对其中一个 C2H2 型
锌指蛋白(命名为 Bj26)深入分析, 重点研究了 Bj26
与 BjC-P 真菌诱导核心元件的特异性互作、亚细胞
定位、对 BjC-P的激活及 Bj26基因在真菌诱导条件
下的表达, 以期为研究 C2H2 型转录因子在作物抗
真菌病原菌的调控机制提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
芥菜幼苗经 200 µg mL–1的真菌激发子(hexa-N-
acetyl-chitohexaose)[22]叶面喷洒处理 , 处理后 12、
24、48和 72 h取样速冻于液氮中, 用于提取总 RNA。
本氏烟种子由本实验室保存 , 播种于土壤中并于
(23±1)℃、每天 16 h 光照温室中培养, 待第 6 片叶
完全展开时, 第 5 和第 6 片叶用于农杆菌介导的基
因瞬时表达。酵母单杂交筛选所用菌株为 Y1HGold
(Clontech公司产品), 由中国农业科学院作物科学研
究所毛龙研究员惠赠。
1.2 酵母单杂交
酵母菌株为 Y1HGold, 诱饵载体为 pAbAi, 捕
获载体为 pGADT7-SfiI。野生型诱饵片段 Bait1 为
BjC-P 含 有 真 菌 诱 导 核 心 元 件 序 列 (GTAGT
GACTCAT) 的区段(−700 ~ −621)和与其协同作用
的区段(−409 ~ −371)相连而成的片段, 长度为 125
bp。突变体诱饵片段为 Bait1-m, 其 Bait1 中真菌诱
导核心元件序列 (GTAGTGACTCAT)的保守碱基
TGAC突变为 GCAA, 其他序列与野生型 Bait1序列
完全一致。 Bait1 序列为 5′-CTCTGCTAGAGA
TAGTGTGGCCCAGCTAGTGAGTAGTGACTCAT
GAGGTAGAGAGAGGGTGGTCCATCATATATCGT
GTTGCATGCGCTAGAGAGAGGGTGGTCCAGCTA
TCGTGTAGAAATATT-3′, Bait1-m 序列为 5′-CTCT
GCTAGAGATAGTGTGGCCCAGCTAGTGAGTAGG
CAATCATGAGGTAGAGAGAGGGTGGTCCATCAT
ATATCGTGTTGCATGCGCTAGAGAGAGGGTGGT
CCAGCTATCGTGTAGA AATATT-3′。酵母单杂交方
法严格按照 Clontech 公司的实验手册操作(Matchmaker
Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System
User Manual)。前期工作已获得了序列正确的诱饵酵
母菌株 Y1HGold [pBait1-AbAi]和 Y1HGold [pBait1-
m-AbAi], 并 确 定 了 Y1HGold [pBait1-AbAi] 和
Y1HGold [pBait1-m-AbAi]抑制自激活的 AbA 最小
浓度分别为 550 ng mL–1和 300 ng mL–1, 获得了和
Bait1 序列互作的阳性克隆, 我们将其中一个称之为
pGADT7-Bj26。
1.3 Bj26基因的生物信息学分析
将酵母单杂交筛选获得的pGADT7-Bj26克隆测
序后, 用GENSCAN软件寻找基因的开放阅读框, 预
测编码氨基酸序列。用Vector NTI (Ver. 11.5)软件分
析Bj26蛋白质的氨基酸序列组成、相对分子质量、
等电点等理化性质。用NCBI中的Protein domain、Blast
1176 作 物 学 报 第 40卷


软件分析Bj26的保守结构域和同源性比对 , 软件
ClustalX 1.81将拟南芥及水稻中与Bj26 CDS序列具
有较高同源性且含有C2H2锌指结构域的基因进行
序列相似性比较, 并通过MEGA 6进行进化树分析。
1.4 Bj26基因真核表达载体构建
以pGADT7-Bj26质粒为模板, Bj26-F: 5′-CGGG
ATCCATGGCGCTCGAGGCTCTCAGTTC-3′, Bj26-R:
5′-GCGTCGACTCAAAAACATTGCAAATCAATG-3′;
扩 增 Bj26基 因 cDNA序 列 , 将 该 基 因 连 接 到
pCAMBIA1307 (pC1307)载体相应的多克隆位点即
BamH I和Sal I位点, 连接产物转化大肠杆菌TOP10
感受态细胞(购自康为世纪公司), 经含有卡那霉素
的LB (Tryptone10 g L–1, 酵母提取物5 g L–1, NaCl
10 g L–1, 琼脂糖15 g L–1, pH 7.0)培养基筛选, 克隆
经PCR及Bam H I、Sal I鉴定呈阳性后, 送美吉公司
测序, 将构建好的载体命名为pC1307-Bj26 (PBj26)。
用BamH I、Sal I双酶切载体pCAMBIA1205-GFP
(pC1205-GFP)和 pC1307-Bj26, 分别胶回收载体
pC1205-GFP和Bj26目标片段, T4 DNA连接酶16℃连
接12 h, 转化TOP10, 涂布于含40 µg mL–1的氯霉素
(Chl)的LB培养基上。Bam H I、Sal I双酶切鉴定阳性
克隆, 将构建好的载体命名为pC1205-GFP-Bj26。
1.5 GFP-Bj26的亚细胞定位
将上述载体pC1205-GFP-Bj26、pC1205-GFP电
击转入农杆菌EHA105中, 以PCR鉴定质粒是否成功
转入, 引物为Bj26F/R。将含有pC1205-GFP-Bj26、
pC1205-GFP质粒的农杆菌株EHA105涂布在含利福
平(30 µg mL–1)和氯霉素(40 µg mL–1)的LB培养基上,
28℃培养2 d, 刮取菌体, 用MMA缓冲液(10 mmol
L–1 MgCl2, 10 mmol L–1 MES (pH 5.5), 100 µmol L–1
As)悬浮, 调节菌浓度OD600=1.0, 28℃培养箱中孵育
3 h。用1 mL去针头的塑料注射器, 从叶片背面将菌
液注入生长约6周的本氏烟叶片 , 于人工温室培养
24 h后, 撕取本氏烟叶片背面表皮, 用荧光显微镜
OLYMPUS IX71观察Bj26的表达位置。
1.6 本氏烟瞬时表达及 GUS染色与荧光定量分析
将构建好的pC1307-Bj26(PBj26)载体电击转入
农杆菌感受态细胞EHA105, 将转化产物涂布在含
卡那霉素(50 µg mL–1)和利福平(30 µg mL–1)的LB培
养基上, 以PCR鉴定阳性克隆, 引物为Bj26F/R。将
获得含阳性质粒PBj26的农杆菌菌株、含真菌诱导核
心元件的启动子质粒p16菌株、含真菌诱导核心元件
突变质粒p53菌株[22]及含内标载体p57菌株培养在含
卡那霉素(50 µg mL–1)和利福平(30 µg mL–1)的LB培
养基上, 28℃生长2 d, 用MMA缓冲液悬浮, 调节菌
浓度OD600=1.5, 28℃培养箱中孵育3 h。菌液PBj26、
内标载体p57菌液及p16菌液或p53菌液按1∶1∶1混
合。用1 mL去针头的塑料注射器, 将菌液注入生长
约6周的本氏烟叶片中, 48 h后取一片叶样进行GUS
组织化学染色, 一旦染色即终止反应, 用梯度酒精
脱色。对称的另一片叶样用于蛋白提取液(CCLR,
Promega, Madison, WI, USA)提取总蛋白, 离心吸取
20 µL蛋白提取液加480 µL GUS反应液(0.1 mol L–1
pH 7.0的磷酸盐缓冲液, 0.5 mol L–1 EDTA pH 8.0,
0.1% Triton X-100, 10 mmol L–1 β巯基乙醇, 0.1% 月
桂酰基肌氨酸钠, 1 mmol L–1 4-甲基伞形酮-bete-D-
葡萄糖醛酸酐)混合, 迅速吸取反应混合液100 µL加
到900 µL反应终止液(200 mmol L–1 Na2CO3)中, 将
剩余的反应液放37℃水浴锅中反应, 30 min后取出,
快速吸取100 µL反应液加到900 µL反应终止液中混
匀, 用HITACHI F-4600 FLUO-RESCENCE SPECTR
OPHOTOMETER仪器测0 min、30 min GUS活性。根
据 Promega公司 Luciferase Assay System的说明 ,
20 µL蛋白提取液加100 µL荧光素酶反应(Luciferase
Assay Reagent, Promega, Madison, WI, USA)混匀,
用TriStar LB 941仪器测LUC活性。
1.7 实时荧光定量 PCR
分别取200 µg mL–1真菌激发子处理的芥菜叶片
在12、24、48、72 h及对照0 h (未处理)取样, 于液氮
中速冻研碎 , 采用TIANGEN公司的植物总RNA提
取试剂盒提取芥菜总RNA, 并用无RNAase污染的
DNAase处理, 去除RNA中基因组DNA的污染。并用
TIANGEN公司RNA反转录试剂盒合成cDNA第一
链。反转录产物cDNA第一链用作实时定量PCR分
析。实时定量PCR运用SYBR Premix Ex Taq试剂盒
(TaKaRa)和ABI 7500快速实时定量PCR仪进行, 具
体步骤参见试剂盒的使用说明和实时定量PCR仪的
操作说明。芥菜持家基因Actin作为内参基因, 通过
其在不同样品间的表达水平对不同样品的PCR产物
进行水平校正。对所有样品的实时定量PCR产物都
进行溶解曲线分析, 以确保反应产物为一种特异的
产物。下面的引物序列用作实时定量PCR: Bj26-F:
5-TCGAGGCTCTCAGTTCAC-3, Bj26-R: 5-CAGA
CGCTGCACTTGTAG-3; BjActin-F: 5-CTTCTTACC
GAGGCTCCTCT-3, BjActin-R: 5-AAGGATCTTCA
TGAGGTAATCAGT-3。
第 7期 贾双伟等: 芥菜锌指蛋白转录因子基因 Bj26的克隆与鉴定 1177


2 结果与分析
2.1 Bj26 蛋白与 BjC-P 的真菌诱导核心元件的
特异性互作
将前期实验获得的 pGADT7-Bj26转入Y1Hgold
[pBait1-AbAi]和 Y1Hgold [pBait1-m-AbAi]酵母菌株,
分别在不含抗生素 AbA 和含 550 ng mL–1 AbA 的
SD/–Leu 缺陷性培养基上培养, 检测它们的生长情
况。结果如图 1-A 和图 1-C 所示, pGADT7-Bj26 和
阴性对照质粒 pGADT7不论转入野生型酵母菌株还
是转入突变体酵母菌株, 在不含抗生素 AbA的缺陷
性培养基上均能长出健康的克隆, 说明所用酵母及
转化没有问题。但在含有 550 ng mL–1 AbA缺陷性培
养基上只有 pGADT7-Bj26 质粒且仅在 Y1HGold
[pBait1-AbAi]野生型酵母菌株中能够长出健康的克
隆, 在突变体酵母菌株中不能生长, 阴性对照质粒
均不能生长(图 1-B 和图 1-D)。这些结果说明 Bj26
蛋白与 BjC-P真菌诱导核心元件特异互作。

图 1 pGADT7-Bj26及空载体 pGADT7与诱饵载体
pBait1-AbAi及 pBait1-m-AbAi间的酵母单杂交
Fig. 1 Yeast one-hybrid assay between pGADT7-Bj26,
pGADT7 and pBait1-AbAi or pBait1-m-AbAi in Y1HGold yeast
strain
A, B: pGADT7-Bj26和 pGADT7质粒分别转入Y1H Gold [pBait1-
AbAi]菌株后, 按 1:1(左)和 1:10(右)稀释后在 SD/–Leu/AbA0(A)
和 SD/–Leu/AbA550(B)平板上生长; C, D: pGADT7-Bj26和
pGADT7质粒分别转入 Y1H Gold [pBait1-m-AbAi]菌株后, 按
1:1(左)和 1:10(右)稀释后在 SD/–Leu/AbA0(C)和
SD/–Leu/AbA550(D)平板上生长。
The prey construct pGADT7-Bj26 and negative construct pGADT7
were transformed into Y1H Gold [pBait1-AbAi] (A and B) or Y1H
Gold [pBait1-m-AbAi] (C and D) strains respectively. And positive
transformants were determined by spotting serial dilutions (1:1 left,
1:10 right) of yeast onto SD/–Leu/AbA0 (A and C) and
SD/–Leu/AbA550 (B and D).

2.2 Bj26基因生物信息学分析
将酵母单杂交获得的 pGADT7-Bj26克隆测序
后 , 用 GENSCAN 软件对测序结果进行分析 , 发
现具有一个 735 bp 的完整阅读框 , 编码 244 个氨
基酸 , 且该阅读框在 pGADT7 载体上正确翻译 ,
其 cDNA 序列及对应的氨基酸序列见图 2, 经
NCBI 中 Blast 软件分析表明该序列为新克隆的芥
菜 cDNA 序列。
利用 NCBI 中 Protein Domain 软件分析表明
Bj26 含有 2 个典型的 C2H2 结构域(图 3-A), 并有 2
个高度保守的 QALGGH氨基酸序列, 即图 2下画线
所示序列。Vector NTI (Ver. 11.5)软件分析表明 Bj26
蛋白等电点 pI为 9.2, 分子量为 26.6 kD。用 Bj26的
CDS序列在 NCBI数据库进行 Blast分析, 发现 Bj26
与拟南芥与水稻基因序列存在较高的相似性。进一
步在拟南芥基因组数据库及水稻基因组数据库进行
Blast分析, 然后利用软件 ClustalX 1.81将拟南芥及
水稻中与 Bj26 CDS 序列具有较高同源性且含有
C2H2 锌指结构域的基因进行序列相似性比较, 并
通过 MEGA 6进行进化树分析。进化树分析运用最
大简约法, 采用 Bootstrap 法产生随机自检验 1000
次以验证进化树的可靠性。结果(图 3-B)显示 Bj26
与拟南芥和水稻 C2H2 锌指蛋白基因均具有一定的
亲缘关系, 与拟南芥的亲缘关系近于水稻, 且属于
同一亚类。
2.3 Bj26蛋白的亚细胞定位
以 pGADT7-Bj26 质粒为模板 , 利用引物对
Bj26F/R (见实验方法)克隆 Bj26 CDNA 序列, 并构
建真核表达载体 pC1205-GFP-Bj26 (见实验方法)。

图 2 Bj26核苷酸序列及对应的氨基酸序列
Fig. 2 Nucleotide sequence of Bj26 and its amino acid
sequence
下画线指示 QALGGH氨基酸保守序列。
Lines indicate QALGGH amino acid sequences.
1178 作 物 学 报 第 40卷



图 3 Bj26的 C2H2型蛋白结构域预测(NCBI)及进化树分析(MEGA 6)
Fig. 3 Predicted C2H2-type domains (NCBI) and phylogenetic analysis of Bj26
A: NCBI数据库预测 Bj26的 C2H2型蛋白结构域; B: Bj26与拟南芥以及水稻 C2H2型锌指蛋白 CDS序列的进化树分析(MEGA 6),
进化树分支上的数字表示 Bootstrap验证中该分支可信度百分比。
A: predicted C2H2-type domains of Bj26 (from NCBI); B: phylogenetic analysis of Bj26 and other C2H2-type proteins
CDS sequence in Arabidopsis thaliana (At) and Oryza sativa (Os) (MEGA 6). The numeric values in each node represent percentage
of homology amongst C2H2-type genes verified with bootstrap.

将构建好的真核表达载体 pC1205-GFP-Bj26 及其空
载体 pC1205-GFP 在本氏烟叶片中瞬时表达, 空载
体用作 GFP-Bj26亚细胞定位的对照。瞬时表达 2 d
后, 撕取本氏烟叶片下表皮用 OLYMPUS IX71荧光
显微镜检测其亚细胞定位, 结果见图 4。图中红色箭
头指示 GFP 的发光部位。图 4-A 显示空载体 GFP
的亚细胞定位 , 其表达于整个本氏烟叶片表皮细
胞。图 4-B显示 GFP-Bj26仅定位于细胞核里, 进一
步说明 Bj26蛋白是细胞核定位转录因子, 与酵母单
杂结果及生物信息学分析结果一致。

图 4 Bj26在烟草表皮细胞中的亚细胞定位
Fig. 4 Subcellular location of Bj26 in epidermal cells of
Nicotiana benthamiana
A: pC1205-GFP的亚细胞定位(对照);
B: pC1205-GFP-Bj26亚细胞定位。
A: subcellular location of pC1205-GFP;
B: subcellular location of pC1205-GFP-Bj26.
2.4 本氏烟瞬时表达分析 Bj26 对 BjC-P 的激活
作用
为进一步分析 Bj26如何介导 BjC-P 对真菌诱
导的响应过程, 我们采用本氏烟瞬时表达系统, 通
过 GUS 染色和荧光定量分析了 Bj26对 BjC-P 启动
子的激活作用。由于 P16质粒中的 BjC-P 序列为
BjC-P响应真菌诱导的关键区段, 而 P53为 P16的突
变序列 , 且是真菌诱导核心元件中的保守碱基
TGAC 缺失 , 因此通过这2个质粒 , 能够进一步明
确 Bj26是否通过和真菌诱导核心元件结合进而激
活该启动子活性。
图 5-B结果显示, P16和 P53单独注射后均没有
检测到 GUS活性, 但与 PBj26共注射后 P16的 GUS
活性明显增强, P53有微弱增强。图 5-C也显示了类
似的结果。说明 Bj26能够通过和 BjC-P中的真菌诱
导核心元件序列结合进而激活该启动子活性, 但结
合特异性不是很严谨。
2.5 真菌激发子诱导 Bj26 RNA表达分析
酵母单杂交及瞬时表达实验证明 Bj26 能够和
BjC-P 的真菌诱导核心元件结合并激活该启动子活
性, 暗示 Bj26可能介导 BjC-P真菌诱导响应并参与
对植物抗真菌病原菌调控过程, 且受真菌激发子的
诱导表达。用 200 µg mL–1的真菌激发子处理芥菜幼
第 7期 贾双伟等: 芥菜锌指蛋白转录因子基因 Bj26的克隆与鉴定 1179



图 5 Bj26与 BjC-P真菌诱导核心序列特异性结合从而激活 BjC-P的活性
Fig. 5 Bj26 activates BjC-P by specific binding to the core fugal-responsive element
A: BjC-P全长质粒 P1, 真菌诱导关键区段质粒 P16, P16对应真菌诱导核心元件(GTAGTGACTCAT, −668 ~ −657)中保守序列缺失质粒
P53以及 Bj26质粒的构建简图[22]; B: 各质粒在完全展开的约 6周龄的本氏烟叶片单独及共注射后的 GUS染色图; C: P16和 P53分别
与 pBj26共注射后的 GUS荧光定量分析图。不同质粒间的 GUS活性通过 LUC活性来校正误差, 每一个检测质粒注射本氏烟叶片时
同时注射 pBI121-LUCint质粒。柱形图显示 P16和 P53分别与 PBj26共注射后的 GUS活性与相应 P16, P53单独注射后 GUS活性之
间的比值。结果为 3次实验的平均值。
A: schematic diagram of P1, P16, P53, and PBj26 [22]; B: GUS histochemical staining in young and expanded symmetrical leaves of
6-week-old Nicotiana benthamiana leave after infiltration or co-infiltration of each plasmid; C: quantization of GUS activity in transiently
transformed Nicotiana benthamiana leaf. GUS activity was normalized with the LUC activity. Nicotiana benthamiana leaf was co-infiltrated
with each of the tested plasmids along with the construct pBI121-LUCint. Columns show the ratio of GUS activity of P16 and P53
co-infiltrated with PBj26 to that of P16 and P53 alone, respectively. Values are the mean ± SD (n=3).

苗, 保鲜袋保湿 12 h, 然后分 12、24、48和 72 h取
叶样, 0 h为芥菜叶片没有处理的对照。选用芥菜持
家基因 Actin 作为内参 (序列见实验方法 ), 利用
qRT-PCR 检测 Bj26 基因在激发子处理后的 RNA 表
达情况(图 6)。结果表明, Bj26基因在真菌激发子诱
导后RNA表达量明显增强, 且在诱导后 24 h表达量
达到最高, 之后又呈现下降趋势。

图 6 qRT-PCR分析 Bj26在真菌激发子诱导不同时间后的RNA
表达
Fig. 6 qRT-PCR analysis of Bj26 expression induced by fungal
elicitor at different time
以芥菜 Actin基因为内参, 结果为 3次实验的平均值。
The Brassica juncea Actin gene was used as an internal control
(n=3).
3 讨论
植物在自然界中不仅遭受各种非生物胁迫, 而
且也面临病原菌等生物胁迫。已有研究显示 C2H2
锌指转录因子也参与植物抗病防御反应调节, 如辣
椒 CAZFP1基因, 编码一个 C2H2型锌指蛋白, 在野
油菜黄单胞菌 (Xanthomonas campestris)和炭疽菌
(Colletotrichum coccodes)侵染后 mRNA表达水平增
加[23]。马铃薯 C2H2型锌指蛋白基因 StZFP1被马铃
薯晚疫病(Phytophthora infestans)侵染以及盐、干旱、
外源 ABA 处理后 RNA 表达增强[15]。烟草 ZFT1 基
因能够被烟草花叶病毒诱导表达, 且能引起过敏性
坏死(hypersensitive response, HR)反应 [24]。拟南芥
STZ 基因被黄瓜花叶病毒侵染也能诱导产生过敏反
应[25]。但是 C2H2 锌指转录因子在植物抗病防御反
应过程中的作用机制尚需进一步研究。
Sakamoto等 [26]研究发现植物C2H2型锌指蛋白
特有的QALGGH结构单元以及2个锌指间隔的长度
和序列对于锌指蛋白与靶DNA的结合是重要的。最
1180 作 物 学 报 第 40卷


初研究C2H2锌指蛋白与DNA的识别是矮牵牛中的
ZPT2-2基因, 其含2个C2H2锌指结构, 能够识别含2
个AGT特定碱基序列[27]。凝胶阻滞分析显示4个拟南
芥胁迫响应的C2H2型锌指蛋白基因AZF1、AZF2、
AZF3和ZAT10/STZ结合到26 bp结构单元中A(G/C)T
重复碱基[26,28]。A(G/C)T重复碱基的旁侧序列对于结
合也有重要的影响[26]。本研究从芥菜cDNA中克隆到
的C2H2型锌指蛋白Bj26, 生物信息学表明其含有2
个典型的C2H2型锌指结构域, 每个结构域中含有保
守的QALGGH序列 , 2个QALGGH序列间隔50个氨
基酸。通过与拟南芥及水稻C2H2型锌指蛋白CDS序
列比对及进化树分析表明Bj26与拟南芥和水稻
C2H2锌指蛋白均显示出一定的亲缘关系, 但与拟南
芥的亲缘关系近于水稻, 且属于同一亚类。而具有
亲缘关系的拟南芥及水稻C2H2型蛋白基因注释显
示它们介导各种胁迫反应 , 如对真菌激发子Chitin
的响应, 对盐、氧化胁迫响应等, 暗示Bj26也极有可
能参与到这些胁迫反应。qRT-PCR结果显示Bj26受到
真菌激发子的诱导表达, 此结果更进一步证实上述
推论。
本研究通过酵母单杂证明Bj26和真菌诱导核心
元件互作, 一旦将真菌诱导核心元件突变就丧失互
作性, 说明Bj26和真菌诱导核心元件互作的特异性。
但本氏烟瞬时表达实验表明Bj26不仅强烈激活含有
真菌诱导核心元件的野生型启动子P16活性 , 同时
也对真菌诱导核心元件保守序列缺失的启动子P53
有弱的激活作用, 暗示Bj26蛋白真菌核心元件特异
互作不够严谨。由于Bj26含有2个锌指结构域, 据前
人研究报道推测Bj26蛋白至少可以和2个AGT位点
结合, 而P16序列中同时含有4个AGT, 1个在真菌诱
导核心元件(GTAGTGACTCAT)内部(下画线所示碱
基), 2个在核心元件的同一旁侧序列, 中间间隔1个
碱基 , 另1个离真菌诱导核心元件间隔16个碱基。
P53中真菌诱导核心元件(GTAGTGACTCAT)保守序
列(TGAC)的缺失 , 使得P53中仍然含有2个AGT。
Bj26蛋白之所以对P53有弱的激活作用 , 可能与其
含有的2个AGT有微弱的结合作用有关。
4 结论
从芥菜中克隆了一个 C2H2 型锌指蛋白 Bj26,
并明确Bj26通过和BjC-P的真菌诱导关键序列互作,
激活BjC-P, 进而介导BjC-P对真菌诱导的响应并参
与调控植物抗真菌病原过程。
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