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PURIFICATION AND PHYSICHEMICAL CHARACTERIZATION OF A LECTIN FROM WISTARIA SINENSIS SWEET

紫藤凝集素的分离纯化及理化性质研究



全 文 :第 卷 第 期
一年 月
武 汉 植 物 学 研 究


紫藤凝集素的分离纯化及理化性质研究 关
陈 凡 陈海芳 傅 俊
中国科学院武汉植物研究所 武汉 。。
提 要 用常规方 法处 理的 离子 交换纤维 素柱 , 通 过线性离 子 强度梯度洗脱 , 从
紫藤种子 的蛋 白粗提液 中得到一 定纯度的紫藤凝集 素 。 纯化的凝 集 素凝 集 兔 红 血 球 的
比 活提 高 倍 , 总 活 力回收 率为 肠 。 紫藤凝集素 的分 子盆 经 鉴定为 , 是 由
两种亚基构 成 的 四 聚体 , 这两 种亚基各有 个 , 分 子量经 一 鉴 定分 别为
和 。 紫藤凝 集素是 一种糖 蛋 臼 , 等 电点约 为 。 它可凝 集人 的各 种 血 型 和数种
动物血 , 但 无专一 性 。 它 的凝 集 活性可被数种糖抑制 , 其 中 一 乙 酸一 一半乳 糖胺最高 。
氨基酸组成分析表 明紫藤凝 集 素 谷氨酸 、 天冬氨酸含量较高 , 而胧 氨酸 、 脯氨酸 、 酪氨
酸含量甚微 。
关键词 紫藤 , 凝 集 素 , 分离纯化 , 性质研 究
自 年 和 川最早从刀豆种子中纯化得到伴刀豆凝集素 “ ” 以后 ,
凝集素在国 内外已有广泛 的研究 。 它是一类非免疫来源 , 并具有糖专一性 , 可促使细胞
凝 集的蛋 白质或糖蛋 白 。 由于它特殊的结构决定了它许 多特异性的功能 , 使它在细胞膜
结 构 、 临床免疫以及肿瘤细胞等多方面 研究中起到广泛作用 , 而各种凝集素的凝集力 ,
与糖结 合能力以及特异性等却各不相同 。
近年来 , 已分离和 鉴定了许 多凝集素 , 而且大多数凝集素来源于植物种子 , 其中又以
豆科植物居多 。我 们在对湖北 地区豆科植物凝集素资源进行调查的过程 中 , 发现紫藤凝集
素是其中具有较高凝集活力的凝集素之 一 。 豆科紫藤属中多花紫藤 如 。 ‘
。 。 种子凝集素已经有了较为详细的研究 〔’一 ’, 并利用不 同 的方法 从多花紫
藤种子中分离纯化了多种植物凝集素 , 它们对不同的血液种类有不 同的血凝 活力 。
‘ ’最早发现紫藤 ‘ , £ 种子中含有凝集素 , 等 〔’ 曾
采用新鲜人红血球检测血凝 活力而纯化获得 一种紫藤凝集素 , 并对其糖专一性和糖结合
位点性质进行了研究 。 我们在进行植物凝集素 资源调 查中采用兔红血球进行血凝 活力检
测 , 从紫藤种子中分离纯化了对兔红血球凝集活力较高的紫藤凝集素 , 并进行了部分理
化 性质 研究 , 以期获得有价 值的紫藤凝集素 。
本文 于 年 月 日收到 , 同年 月 日收到修改稿
国家自然科学基金资助项 目 。
感谢黄汉东

江明喜同志 协助资源调查 , 陈前萍

陈珍英 、 辛春梅同志协助实验工作 。
竿 期 陈凡等 紫藤凝集素的分离纯化及理化性质研究
材料与方法
。 实验材料
紫藤种子采 自湖 北武汉地区 。 二 乙基氨基 乙 基纤维素 一 系
产品 。 一 果糖 、 鼠李糖 、 一 甘露糖 、 一 乙酞 一 一 葡萄糖胺 、 一 山梨糖 、
十 一木糖 、 一 阿拉伯糖 、 一 甘露糖胺 、 一 甲基 一 一 甘露糖 、 一 岩藻糖 、 一半乳糖 、
标准蛋 白中磷酸化酶 、 牛血清白蛋 白 、 丫一 球蛋 白 、 卵清蛋 白是 “ 产品 。 一 一 葡萄糖 、
一 乙酞氨基半乳糖胺 、 胃蛋 白酶等为国产 。 丙烯酞胺 、 甲撑双丙烯酞胺
为 产品 。 考马斯亮兰 , 。为引 “ 进 口 分装 。 其余 试剂均 为 国产分析 纯或化学
纯 。
。 实验方法
紫藤凝集素的分离纯化 采集紫藤种子 , 用 生理盐水于 ℃ , 浸泡
小时 。置于高速组织捣碎机 中 , 一 转 分 捣碎 次 , ℃ , 静置 小时 。
℃ , 转 分 离心 分钟 , 取上清液 , 即为粗提液 。 缓慢搅拌加入固休硫酸按进行 一
盐析 , 静置 小时 。 ℃ , 转 分 离心 分钟 , 取上清液 。 缓慢搅拌加 入固体
硫酸按进行 一 盐析 , 静置 小时 。 ℃ , 转 分离心 分 钟 , 取 蛋 白 沉
淀 , 透析后溶于 磷酸缓冲液 中。
离子交换纤 维素柱层析 在层析柱 “ 中装入按 常规方法
处理或再生 的 纤维素 。 将蛋 白溶液通过 一 柱 , 并产生吸附 。 用
溶液洗去杂蛋 白 。 然后以 为起始浓度 ,
和 。 “ 的混合浓度 为终浓度 , 对 一 柱进行线性离子强度梯度洗
脱 , 通过 一 一 核酸蛋 白检测仪 。 检测 , 分管收集洗脱 峰 。 将具有高 凝集 活力
的凝集素溶液合并 , 透析后真空冷冻干燥 , 一 ℃保存 。
血凝活力测定 按照孙册等 〔吕 〕的方法 , 采用醛化兔红血球对凝集素提取液进
行血凝活力测定 。 对新鲜兔红血球醛化采用 戊二醛法 〔” 。
紫外吸收法测定蛋白质含量 〔‘” 。 以牛血清白蛋 白 为 对照制标准曲线 。 采用
型紫外分光光度计检测蛋 白液浓度 。
采用不连续聚丙烯酞胺凝胶 电泳 法测定蛋 白质分子量〔川 。
蛋 白质亚基组成及分子量的测定 采用不连续的十二烷基 磺酸钠 一 聚 丙烯酞
胺凝胶 电泳 一 法 〔” ’测定紫藤凝集素分子量及亚基组成 。 标 准蛋 白有磷酸化
酶 , 牛血 清白蛋白 , 下一 球蛋 白 链 , 二
, 卵清蛋 白 , 胃蛋 白酶 , 了一 球蛋 白 链 ,

盘状连续等电聚焦电泳法测定蛋 白质等电点〔’, ’。 采用 型酸度计 测定对照
胶体浸泡液 , 制定标 准曲线 。
定性实验 采用高碘酸 一 试剂染色法 〔川 。
半抗原抑制实验 按照孙册等〔’‘ ’的方法 。
氨基酸组成分析 将蛋白溶液用 , 水解 小时 , 按照 衍
生法‘’‘ ’, 经 日立 一 氨基酸自动分析仪得到其组成 。
武 汉 植 物 学 研 究 第 卷
结果
。 紫藤凝 集素的 分离纯 化
紫藤种子蛋 白的粗提液经硫酸按分级沉淀 , 获得 紫藤凝 集素纯化粗品 表 。 在
表 紫慈凝集案的纯化
砰 ” ” ,
纯化步骤
,

急蛋 白

凝集素活力
一 申




活力
,
比 活力


收得率

乡百
纯化倍数

粗提液
一 盐析沉淀

一 。 盐析沉淀
一 , 。
肠一 盐析上清
一 一
一 柱洗脱 ,夜

〕二 ,
。 又
只 , ,



凝集活性以纤鲜兔红血珑弓。夕石凝集的微克数表示
, ,
乡‘ , 。 ,
凝集鱼位 。
的条 件下 , 紫藤凝集 素对兔红血球的凝集活性 主要存在于 一 盐析沉淀
中 。 线性离子强度梯度洗脱已吸附有凝集素的 一 柱 , 检测 图 并收集到纯化

, 了




图 一 一 核吐受 白检测仪检测班 白洗脱液
诬 £ 诬
诬, 茸 一 一 五
。 一
。 ,
第 期 陈凡等 萦藤凝集素的分离纯化及理化性质研究
的萦藤凝集素 。 纯化 的凝集素对兔红血球的凝集比活较粗提液提高 倍 , 活力回收率为
。 经不连 续聚 丙烯 酞胺 凝胶 电泳
检测 , 显示为 一条蛋 白 染色带
图 。
。 紫藤凝 集素的理 化性质研 究
分子量测定及亚基组成与大小
通过不 连 续 聚 丙 烯 酞 胺 凝 胶 电 泳
检测纯化 的紫藤凝集素 。 根据标 准
蛋 白的电 泳 迁移 率计算 , 其 分子 量 约为
。 纯化 的紫藤凝集素经 和琉基 乙
醇处理后通过 不连 续的十二烷基 磺酸钠 一 聚
丙烯酞胺凝胶电泳 一 , 呈现 条蛋


染色带 , 由此认为 此凝集 素含有 两种亚
基 。 根据标准蛋 白的电泳迁移率计算 , 其亚
基表观分子量分另约为 和 。 由
测得的分子量和 一 测得 的 亚
基分子量推断这种紫藤凝集素分子是由 种
亚基构成 的四 聚体 , 这 种亚基各有 个 。
定性实验
日同日同︼人
。 经盐析纯化后的蛋 白溶液
经 人 一 柱洗脱液
呈 亡
扭 一 ‘ 一
五 也 五
电泳圈诺
” ”
,
·

对纯化的紫藤凝集素进行盘状不连续聚丙烯酞胺凝胶 电泳后 , 进行高碘酸 一 试
剂 染色和考 马斯亮 兰 。 染色 , 表明在蛋 白染色带 的相应位置有一条糖的染色带 , 呈现
玫瑰红色 , 由此断定这种紫藤凝集素为糖蛋 白 。
。 。 等 电点 的测定
经盘状连 续等电聚焦电泳和 计的测定 , 在标 准曲线上找出蛋 白固 定带 的相应位
置 , 推断 出这种紫藤凝集素的等电点为 士
血凝专一性实验
采集人的 、 、 、 种血型新鲜红血球以及家兔 、 鱼 、 小鼠 、 鸡 和黄鳝新鲜
红血球 , 用生理盐水洗净 , 并用 。 配成 红细胞溶 液 , 然后分别
与倍比稀释 的紫藤凝集素纯化液 进行血凝实验 。结果 表 表明这种
安 血凝专一 性
析鲜血源
,
,
人 血 型
鸡 小鼠 鱼 黄鳝
凝集素活力
‘ 无 无 无
,

今 一
武 汉 植 物 学 研 究 第 卷
紫藤凝集素对人 的各种血型均有凝集作用 , 但无专一性 , 对家兔和鱼的红细胞有凝集作
用 , 而对小鼠 、 鸡 和黄鳝的红细胞均无凝集活力 。
。 半抗原抑制实验
将 一 一葡萄糖 、 一 果糖 、 一 岩藻糖 、 一 半乳搪 、 鼠李糖 、 一 甘露糖 、 一山梨
糖 、 一木糖 、 一 阿拉伯糖 、 一 甘露糖胺 、 一 甲基 一 一 甘露糖 、 一 乙酞 一 一 葡萄糖
胺 、 一 乙酸氨基半乳糖胺分别用 配成 糖溶液 , 然后倍比
稀释与紫藤凝集素纯化液 进行反应 分钟 , 随之加 入 兔红细胞 。
同时将紫藤 凝集素纯化液 倍比稀释后与以上 。。 。 】糖溶液反应 分
钟 , 并加入 兔红细胞 。 由此得到糖抑制血凝作用的大小 表 。 结果表 明 一 乙
酞氨基半乳糖胺对纯化的紫藤凝集素具有最高 的抑制作用 , 。 糖溶液可 以抑制
’ 紫藤凝集素 。
表 抽对凝集素活力的抑制作用
一 ,

抑制作用

吕 一 无 无 一 礴 一 无

抑制作用 无 无 义
抑制作用以血凝被抑制孔的最大凝集素浓度表示
, , , 凡 谧 月
卜 户 。 只 兜
一 一 葡萄搪 一 一 , 一 果搪 一 , 。 一 岩藻糖 一 , 。 ‘ 一半乳糟
一 鼠李搪 一 甘露糖 一 , 了 一 山梨糖 一 , ,
一木糖 一 。 一 阿拉伯糖 一 谊 一 甘露糖胺
一 , 。 一。 一 甲基 一 一 甘露搪 一 一 一 。 。 , 一 乙酞一 一 葡萄塘胺
一 护 一 , , 一 乙酞氨基半乳搪胺 一 , ‘
氨基酸组成分析
紫藤凝集素纯化液 。 经酸水解后 , 由 日立 一 氨基酸 自 动分析仪
分析得到结果 。 表 结果表明这种凝集素中谷氨酸 、 天冬氨酸的 含量较高 , 丝氨
酸 、 甘氨酸和赖氨酸含 鼠次之 , 而胧氨酸 、 脯氨酸 、 酪氨酸含量甚微 。
衰 氮鑫吐组成
氨基酸种类 含里 氨基酸种类 含 氨基酸种类 含量

天冬氨酸 。 异亮氮酸 胧氮酸 微量
苏氛酸 亮氨酸 蛋氨酸
丝氛酸 苯丙氨酸 撷氛酸
谷氨酸 赖氮酸 脯氨酸 微盆
甘氮酸 组氨酸 酪氨酸 微量
丙氮酸 精氨酸 钧 色氨酸

第 期 陈凡等 紫燕凝集素的分离纯化及理化性质研究
讨论
我们在紫藤凝集素的纯化过程中 , 选 取了 一 的硫酸按盐析组分 , 这是因为
这 一组分对兔红血球的血凝 活力最高 。 经过 一 柱层析纯化后得到的紫 藤凝集素是
一种分子量约为 , 并具有 个亚基 的糖蛋 白 。 等〔” 纯化紫藤凝集素时 , 选
取 了对新鲜人红 血球血凝活力较高的 一 盐析组分 , 他们利用 亲和层 析 柱获得分
子量为 , 仅有 个相 同亚基构成的紫藤凝集素 。 在 同一植物种子 中纯化得到结构
和 性质不同的凝集素 , 这在紫藤属多花紫藤中同样存在 , 雌 等〔, ’纯化 了多花紫
藤种子 中对新鲜猪红血球有较高血凝活力的 一 盐析组分 , 而 “ “等〔‘ ’‘ ’则纯
化了对人红血球有较高血凝 活力的 一 盐析组分 , 他们分另获得数种结构和性质不
同的多花紫藤凝集素 。
我们 曾经使用 一 和 一 一 对紫藤凝集素纯化粗品进行
柱层析 , 所收集的洗脱峰都只有一个 。 对纯化粗品进行的 鉴定呈现 条 蛋 白染色
带 , 对 一 和 一 一 柱洗脱液进行的 鉴定均 呈现
条蛋 白染色带 , 第一条分子量较小的蛋白带消失 。 后经 测定紫藤凝集素分子 量 认
为 , 这是由于这种搪蛋 白分子量大于一般凝集素 , 仅除去了分予量较小的杂蛋 白 , 却无
法 与分子量大的蛋 白分开 。 一 柱层析虽然也只能洗脱出单一洗脱峰 , 但经
鉴定为单 一蛋 白染色带 , 从而达到纯化 的目的 。
对紫藤种子进行的凝集素鉴定认为它对兔红血球凝集效价很高 , 而且粗提液 中的确
凝集活力高于一般植物凝集素 。 经 一 柱纯化 的紫藤凝集素纯化倍数达 倍 , 这对
于本身活力甚高 的凝集素而言这种方法是可行 的 , 但活力收得率仅 , 这说明还有
的凝集活力损失在 一 柱纯化 中 , 据我们推断可能有不适合这一纯化方法 的同
工凝集素存在 。
紫藤凝集素的血凝作用对人血型无专一性 。 在紫藤凝集素 糖抑制实验 中 , 一 乙酞
氨基半乳糖胺对其凝集活力有着强烈的抑制作用 , 而其它糖作用甚小 。 这使这种紫藤凝
集素在临床免疫及细胞遗传研究中有一定的应用前景 。
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武 汉 植 物 学 研 究 第 券
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