全 文 ：武汉植物学研究 ,
野生稻愈伤组织的超低温保存
和冻后再生植株的形成
’
殷晓辉 舒理慧 郑从义 廖兰杰
武汉大学 生命科学学院 武汉 。。
提 要 对不同基因组的野生稻愈伤组织进行了超低温保存的研究 , 主要结果如 下 ①野生
稻愈伤组织经过预培养 预处理 冰冻降温 液氮保存 快速解冻的超低温保存
,
冻后细胞
存活率最高可达 ② 十 葡萄糖为最佳冰冻保护剂 。 降温程序为 。
、 、
二二二二二二 一 , 一 一几二二二二‘ 一 , 液氮 。 ③普通野 生稻 、 宽叶野生稻 、
优粒野生稻获得了冻后再生植株
。
④优粒野生稻解冻后形成旺盛胚性愈伤组织 并通过体细
胞胚胎发生途径 再生出大量植株
。
关键词 野 生稻 , 愈伤组织 , 超低温保存 , 再生植株
稻属 中有 个种 , 其中野生稻约有 种 。 野生稻资源是稻种资源的重要组
成部份 , 它是天然的基因库
,
保存了栽培稻没有或 已消失了的基因 , 并具有特殊的优 良性
状及高抗病虫害的特性 。
当前迅速恶化的环境和不利的气候条件正在侵蚀着水稻的遗传多样性
。 同时野生稻
又具有柱头外露
、
异交结实率较高
、
种子落粒性强的生物学特性 , 加上 人为的砍伐与围垦
使野生稻种面临灭绝的危险
。
因此 , 保护野生稻遗传多样性 已经刻不容缓了
。 如何长期保
存稻属资源成为 目前人们关注的问题 , 科学家们正加紧研究野生稻基因的保存途径 。植物
组织与细胞的培养为植物的种质保存开辟 了新的途径
。 组织培养物能迅速大量繁殖 , 再生
植株可保持原有的遗 传特性
。 为此 目的 , 我们对野生稻愈伤组织的超低温保存进行 了研
究 , 首次获得 了 种野生稻的冻后再生植株
。 我们的实验证明了野生稻幼穗离体培养物的
超低温保存是稻属资源保存的有效途径 。
材料与方法
供试材料
普通 野 生 稻
, 基 因组 长 雄 蕊 野 生 稻 , 基 因 组 , 小粒 野 生 稻 , 其 因组
收搞 日 工”污 旧 昭 ‘ 第
一
作者 女 , 断 岁 程师 硕
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辛 国家 自然科学 基金 国家 一 八 五 ”资助项 目 。
武 汉 植 物 学 研 究 第 卷
药 用野 生稻 基 因组 高秆野 生稻 , 基 因组 宽 叶野 生稻 , 基 因组
优粒野生稻 , 基因组尚未确定 。
幼德培养方法
幼穗培养按舒理慧等‘ ’ 方法
。
诱导培养基 ‘ , 一 八 蔗糖 分化培
养基 十 十 蔗糖 继代培养基 八矛
蔗糖 。
超低温保存方法
预处理 选取继代培养 处于迅速生长的愈伤组织块 一 放 入
安瓶中 , 在冰浴条件下逐滴加入不 同种类 及配 比的冰冻保护剂 各种冰冻保护剂均溶于
培养基中 , 冰冻保护剂与材料体积 比为 , , 然后于冰桶中预处理 一 。
降温冰冻程序 降温冰冻在英 国产的程序降温仪 上进行 , 程序
卫全生趾一
, 。 二竺纸一
, 。 一液氮 。
化冻与洗涤 将在液 氮中保存的材料 , 取出后投 入 水浴 中快速解冻 , 然后用
写蔗糖培养液洗涤 次
,
每次停留不超过
。
冻后细胞存活率的测定 按照 和 盯 的 法 〔之〕 氯化三苯四氮哇还
原法 测试 , 分光光度计在 波长测得的吸收值表示细胞活力 。
细胞存活率
植株再生
解冻后细胞的 ’
未冷冻细胞的 肠
值一
经过超低温保存的愈伤组织块化冻洗涤后
,
接种于继代培养基上进行暗培养 , 再把恢
复生长的材料转 入分化培养基中于 光照 条件下培养 后统计绿苗分化率
。
结果与分析
不同基因组的野生稻愈伤组织与冻后细胞存活率的关系
对 个种野生稻 个编号的愈伤组织进行了超低温保存 , 冻后通过 法测试细
胞存活率 。 种野生稻冻后细胞存活率的变异范围 写一 表 。
冻后细胞存活率的差异不仅存在于不同的野生稻之间 , 而且在 同种野生稻不同编号
之 间也有差异 。 这表明不同的基因型具有不同耐冻的内在因素
。 这一结果与 在栽
培稻上得到的结果相印证 。 他对栽培稻 个品种的愈伤组织进行了超低温保存
, 发现它们
的保存效果各不相同〔 〕。
冰冻保护剂的作用效果
随着保存材料的不同 , 获得最佳保护效果的保护剂种类也不同
。 我们以普通野生稻
的愈伤组织为材料 , 试验 了几种保护剂的作用 表 , 证明冰冻保护剂是提高冻后
细胞存活率的关键 , 而复合保护剂的保护效果比单独使用 二 甲基亚矾 要好 。 其
中 以 肠葡萄糖的组合取得 了最佳保存效果 。 这 一结果与 ,
在甘蔗和水稻细胞的超低温保存中所得的结果相一致 〔‘
· 〕。
降温方式的影响
迄今采用的降温冰冻方法主要有 种 快速冰冻法
、
慢速冰冻法及逐级冰冻法 。 慢速
第 期 殷晓辉等 野生稻愈伤组织的超低温保存和冻后再生植株的形成
’是
表 不同野生稻愈伤组织超低温保存的效果
野 生稻 从 月组 产地 编号 冷冻前 值’ 冷冻后 值 细胞存活率
︹叮矛,︺一卜︼盛任几工
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普通野 生稻
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中国广西
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小粒野 生稻
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药用野 生稻
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高秆野 生稻
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巴西
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士 墨西哥
优粒野生 稻
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中国云南
,
冰 冻法 是 采 用 最 广 泛 的 一 种方
法 , 它 通 过 缓 慢 降 温 使 温 度 从
逐渐降到 一 左 右 , 然后
投入液氮 。 改 良慢速冷冻法则是
通过缓慢降温使温 度从 降到
一 定的预冻温度 , 并停 留一段时
间 , 再投 入液氮 。 其 目的都是为了
使细胞内的水有充足的时间不断
流到细胞外结冰 , 从而使 细胞内
的水减少到最 低限度
,
达到 良好
的脱水效应
,
避 免细 胞 内结冰 的
不可逆性伤害
。 我们采用了后一
种方法 , 在预冻温度停 留一段 时
间是保持高存活率的关键 , 它能
使细胞达到 充分 的保 护性 脱水 ,
以便提高存活率 表 。 这一结
表 冰冻保护剂对普通野生稻 编号 愈伤组织
超低温保存的影响
,
冰 冻保护剂
冰冻前
测试值
冰冻后
测试值
一
细 胞
存活率
一
对照
只
甘油
一 肠
蔗糖 。
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〕
葡萄糖 、
”
甘油
蔗搪
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⋯
斗
果与田水 中等在光敏核不育水稻愈伤组织超低温保存中取得的结果相一致 〔‘〕
武 汉 植 物 学 研 究 第 卷
表 降温冰冻方法对普通野生稻细胞存活率的影响
一
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冰冻前 ’
测试值
、‘ 、 一七
冰冻后
测试值
七
,
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一
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一
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飞一
℃
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此外 , 对于 固体培养的愈伤
组织来说 , 选择 年龄的
愈伤组织作为超低温保存的材料
较为适宜 细胞冷冻后 的恢复生
长宜在黑暗中进行 , 因为光 氧化
作用对冻后材料是有害的 。 我们
选取再培养 的愈伤组织作
为超低温保存材料 , 并在 冻后进
行暗培养 , 取得 了较好的保存效
果 。
冻后再生植株的形成
在水稻 细 胞 的超 低 温 保 存
中 , 冰冻伤害造成 了呼吸损伤 , 减缓了葡萄糖的吸收
, 细胞内钾离子损失 〔, 〕, 加速 了脂质的
过氧化反应 〔‘ 。 尽管冰冻造成了伤害 , 但并非致死性的 , 所以在细胞恢复再生长之前有一
个停滞期用乘修复这些损伤
。 细胞的再生长才是最终检验细胞活力的唯一可靠方法 。
将恢复生长的愈伤
组 织 转 入分 化 培 养 基
后 , 有 种 野 生稻 得 到
了 冻 后 再 生 植 株 表
。 其中普通野生稻和
宽叶野生稻的冻后再生
率都低 于对 照 , 而优粒
野 生 稻 的 冻 后 再 生 率
·
却大大超过了对
照 , 这种促进 作用的机
理 尚有待于进一步的研
究 。将它们的试管苗 图
版 一 移栽后得到
了结 实 植 株 图版
一 。
表 野生稻超低温保存后再生植株的比较
野生稻
,
基因组
飞七
转移愈伤
组织块数
〕
白苗率
荡
绿苗数
丛
绿苗率
、
普通野生稻
“ 花 。 ,
药用野生稻
坟刀 。 一 、
高秆野生稻
宽叶野生稻
,
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虎粒野生稻
咬 , · ”之勺 ,‘
’
,议
讨论
超低温保存技术是近几十年 来广泛采用的长期保存植物种质资源的方法
。
年栽
培稻的愈伤组织就 已在液氮中保存成功 〔’ , 我 们对野生稻超低温保存的研究同样证实 了
它也能有效地保存野生稻 资源
。
野生稻 的幼穗直接接种于分化培养基时 不通过愈伤组
织 , 能分化 出植株 , 但 多为单生苗 , 生长缓慢 , 没有根分化
。 如果将刚分化出的小绿芽进行
超低温保存 , 冻后一周内小绿芽白化死亡 。 而选用幼穗接种诱导培养基上产生的愈伤组织
却能 大量扩增 , 再分化出大量绿苗
。 因此 , 选用幼穗组织培养物是超低温保存 比较适宜的
第 期 殷晓辉等 野 生稻愈伤组织的超低温保存和 冻后再生植株的形成
材料
。
水稻 的组织培养在栽培稻方面 已取得了相当多的进展 , 然而在野生稻的组织培养方
面却研究得很少
。 随着对野生稻有利资源应用及保存的需要 , 野生稻的组织培养成为 日益
重要的课题 。
外植体的选择对于愈伤组织的诱导至关重要 。 已经从野生稻的叶
、
种子和微繁殖体
的基节诱导出愈伤组织 , 并分别建立起悬浮培养和原生质体培养体 系 ,
获得了再生植株 〔’“
·
” 〕。 舒理慧等在栽培稻中的研究表明 幼穗的发育时期对幼穗培养具
有明显影响 , 反应最好的时期均在第二次枝梗及颖花原基分化期到花粉母细胞形成期 〔, 〕。
我们也对野生稻的幼穗发育时期进行了研究 , 得到的结果 也是雌雄蕊形成期具有最高诱
导率 , 产生旺盛的愈伤组织 图版 。 它是进行超低温保存的最佳材料 。
另外优粒野生稻幼穗愈伤组织冻后开始出现为粘稠状胶状物 。 在黑暗条件下延长继
代培养时间 天继代一次 , 个 月后其表面不断长出白色紧密的小颗粒 , 即胚性愈伤组
织 , 继续扩展繁殖形成 了大量的胚状体 图版
。
通过胚状体的分化形成了 株再生
植株 。 优粒野生稻的组织培养再生植株一直是个难题 , 很少见于报道 。 我们采用超低温保
存法 , 获得 了大量再生绿色植株 , 这不能不说是一个新的探索 。 在水稻原生质体及长春花
细胞的超低温保存 中也观察到 了这种现象 〔’ ” ’〕 , 随着培养时间的延长 , 培养基水份大量
丧失 , 造成水份胁迫
, 促进愈伤组织 内源 含量上升 , 而 对水稻胚性愈伤组织形
成具有 明显的作用 〔’‘〕。
等在做薰衣草悬浮细胞冰冻保存实验时 , 也发现冻后细胞分化率高于冻
前 〔‘
。 而唐定台等在做水稻原生质体产生细胞团的冰冻保存实验时 , 也在冻后观察到 了
胚状体的发生 〔”〕。 我们在庆粒野生稻上的实验表明 冰冻后促进 了胚状体的发生 。 所以 ,
冰冻能够诱导胚状体的发生 , 促进植物细胞的分化 , 这在细胞工程
、
遗传工程研究和实际
应用中将具有很大的意 义
。 至于高频率发生的胚性细胞系的筛选 , 及冻后再生植株的特性
尚需进一步深入的研究
致谢 实验过程中 , 得到 了屈三甫同志大力帮助 部份野生稻的材料由广西 农科院品种资源研究所
及武汉大学生命科学学院遗传学研究所汪向明教授
、 王 明全副教授提供 。
参 考 文 献
舒理慧‘张廷壁
,
周明 杰 水稻不同倍性的幼穗在离体培养中的反应 科学通报 一
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田永中 舒理慧
,
郑从 义 光敏感核 不育水稻愈伤组织的超低温保存和冻后 再生植株的形成 武汉大学学报 自然
武 汉 植 物 学 研 究 第 卷
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唐定台 , 杨志琦 , 山 田康之 水稻原生质体产生细胞团的冰冻保存和冻后再生植株形成 植物学报 , , 一
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梅传生 张金渝 汤 日圣等 琼脂浓度对水稻愈伤组织植株再生率和 内源激素含量的影响 中国水稻科学 ,
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