全 文 ：武汉植物学研究 , !∀ # ∃ ∀一 %
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高分化潜能小麦胚性悬浮系的建立及保持
葛台明 余毓君
!华中农业大 学农学 系 武 汉 7 ∀ 8 8 % 8#
提 要 报道了小麦具高度植株再生潜能的优质胚性悬浮系的建立与保持方法 。 9 型胚性
愈伤组织在改 良 : ; 液体培养基 中增殖快 !∀ 天即可加倍 # , 分散好 , 两周左右即可建立起优
质悬浮系 < 在改良= > 液体培养基中增殖较慢 !7 一 天加倍# , 较易形成块状结构 < ? ? 液体培
养基不适于 小麦胚性悬浮系的培养 。 长时间悬浮培养后 , 小麦胚性悬浮系再生能力下降 , 在
= / ≅ 固体培养基上培养一段时间后再转回液体培养可使其再生能力得 以保持与恢复 。
关键词 小麦 , 胚性悬浮系
原生质体培养的成功使得利用体细胞杂交等遗传操作技术改 良作物成为可能 〔‘一 , , 。
禾本科植物原生质体培养取得成功的一个最为关键的步骤就是建立增殖快 、分散好 、具有
高度植株再生潜能的优质胚性悬浮系〔卜 , 〕 < 胚性悬浮系用于愈伤组织生理生 化 、离体筛
选 、形态建成机制的研究及人工种子的制作方面均具有十分 明显的优越性 。 然而 , 小麦胚
性悬浮系的建立仍有赖于经验 , 其植株再生能力的保持亦十分困难 〔‘· ∀ · ‘· ‘“ · ‘” 。 本文报道了
具有高度植株再生潜能的小麦胚性悬浮系的建立及保持其再生能力的方法 。
材料与方法
Α 材料
采用湖北省农业科学院粮食作物研究所惠赠的 ∀ Β > 小麦品系为实验材料 。 ∀ Β >
是该所以太谷核不育材料轮 回选育的一个抗赤霉病 的高产品系 。
Α Χ 愈伤组织 的诱导与继代培养
取 8 Α 一 92 Δ 的小麦幼穗 , 切成 8 Α ∀一 8 Α 52 Δ 长的切段 , 接种于 : ; ≅ 培养基上 , 一个
月后转入 = /≅ 培养基上继代培养 , 培养基成分见表 。 继代时挑选色泽鲜艳 、 生长迅速的
胚性愈伤组织进行 。两至三次继代后出现颗粒状愈伤组织 Α 选择颗粒较细的愈伤组织依其
生长速度 加快继代频率 !渐至两周一次 # , 当选出 , 型胚性愈伤组织〔‘之, 时 , 改为三 周继代
一次保存之 , 同时用于胚性悬浮系的建立 。 与 9 型胚性愈伤组织相 比 , 9 型胚性愈伤组织
松散易脆 , 生长迅速 , 有较高的植株再生潜能 。
收稿 日 ∃ 7一 8 %一 8 , 修回 日 ∃ 7 一 Χ 一 >
武 汉 植 物 学 研 究 第 ∀ 卷
Ε + Φ ,4
表 本试验所用培养基
Γ ∋ Δ Η ∋ 5 101∋ ∗ 5 ∋ − Δ 4 Ι1+ ( 5 4 Ι 1∗ 0 6 15 ϑ+ ϑ4 )
成 份
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出现大量结构致密的愈伤组织块及胚状体后再转入 : ; ≅ ∃ 上分化 。
悬 浮系的分化方法分两种 ∃ !# 先在 = /≅ 3 上增殖后转入 : ; ≅ ∀ 分化 。 !Χ #取 ,一 Χ
悬浮培养 物置 于 8 Δ, 三角瓶 中 , 先用 8 Δ Ζ液体分化培 养基 !; ≅ Ρ 3 或= / ≅ Ρ 3 #清洗
一 次 后 , 用 Χ 8 Δ ,相应新鲜培 养基作液体分化培养 , 当胚状体大量出现时将 其转 入 ΘΧ
:5≅ 。 培养基作萌发出苗培养 。
Α 培养条件
愈伤组织的诱导与继代均在 Χ 士 Χ ℃ 、弱 自然散射光下进行 <分化出苗时补以人工照
明 , 光强 8 8 ,[ , 光照时间 >6 Θ Ι < 液体培养在 Χ 士 Χ 亡 、弱散射光下进行 , Χ ∋ ) Θ Δ 1∗ 振荡
第 ∀ 期 葛台明等 ∃ 高分化潜能小麦胚性悬 浮系 的建立及保持
培养 。
Χ 结果与分析
Χ Α 愈伤组织的诱导 、继代与分化
在 : ; ≅ 上培养 Χ8 天后 , 幼穗切段出愈率为 8 ∴ 。 在 = /≅ 上继代的愈伤组织全部
转变成生长迅速的胚性愈伤组织 , 其开始时呈灰 白色致密状 , 多次继代后变成鲜黄色 , 并
直接出苗 , 这种愈伤组织在 :; ≅ ∃ 上的分化率为 8 ∴ 。
∀ Β >极易产生颗 粒状 胚性愈伤组 织 , 经 一 %个 月 的筛选 , 可选出颗粒 直径在
外5Δ Δ 以内 , 外观呈砂状 , 表 面湿润 , 颜色鲜黄 , 生长十分迅速 !一周的生长量在 7 倍 以
上 # Α 易于分散的 , 型胚性愈伤组织 , 镜检可见大量 由 8 一 Χ8 个球形 细胞组成的细胞团
及原球胚 , 胞质丰富浓厚 , 富含黄色颗粒 , 细胞不透明 。 分化时需经 = / ≅ 3 培养 Χ一 ∀ 周产
生大量致密结构和胚状体后 , 转入 : ;≅ ∃ 培养基中培养 一Χ 周可分化大量绿苗 。 对于其
中少量直径在 ,Δ Δ 左右的致密结构可不经 = /≅ 3 ,直接在 :; ≅ ∃ 上分化出苗 。
Χ Α Χ 恳浮 来的建立与分化能力 的保持
Χ Α Χ Α ∀ 种液体培养基悬浮培养效果 的比较
9 型胚性愈伤组织转入 ; ≅ Ρ 液体培养基后很快分散并迅速增殖 , 两周左右即可建立
稳定的悬浮培养物 , 其颜色鲜艳 , 细胞团有较大的比重 , 细胞团 由 8 一 Χ8 8 个细胞组成 , 细
胞呈球形 , 壁薄质浓 , 液泡不发达 < 细胞的胞质环流 活跃 , 表明细胞代谢旺盛 <生长迅速 , ∀
天即可加倍 <培养液清澈 。
9 型胚性愈伤组织转入 = /≅ Ρ 培养基后虽能增殖 , 但易于形成较为致密的大块 。 小
细胞团较少 , 且有少量长形细胞 , 增殖较慢 !7 一 天加倍 # 。 在 = /≅ 中添加 Δ Δ ∋, Θ Ρ 脯
氨酸有利于培养物的增殖与分散 。
9 型胚性愈伤组织转入 ? ? 培养基中几乎不增殖 , 细胞团和小原球胚体积略有增大 ,
并变得十分致密 。 在最初的一个月内愈伤组织颜色变深 , 并有少量细胞团褐化 , 随后呈白
色 , 分散性始终未见改善 , 增殖速度极缓慢 。
∀ 种培养基 以 ; ≅ Ρ 悬浮培养效果最好 。
Χ Α Χ Α Χ 悬浮系的分化
将悬浮培养物转入 = /≅ 3 固体培养基上可形成大量的原球胚和致密的大块状结构 ,
其分化率较 , 型胚性愈伤组织略低 !表 Χ # 。
悬浮培养物在含 Χ , 7 一≅ 8 Α ,Δ Π Θ Ρ 的 = / ≅ Ρ 3 或 ; ≅ Ρ 3 液体培养基 中 , 一周后可形成
大量胚状体 , 转入 , ΘΧ :; ≅ 。 后两周即可出苗 。 胚状体萌发成苗的比例为 Χ> 一 ∀Χ 写 。 如果
= /≅ Ρ 3 或 5 ≅ Ρ 3 中 Χ , 7 一≅ 浓度降为 8 Α 8 Δ Π Θ Ρ 时虽可形成胚状体结构 , 但 因提前萌发
!未成熟萌发 #而难以成苗 , 使萌发成苗比例下降!表 Χ # 。
试验结果证明 , 固体和液体两种分化方法以固体优于液体 。
Χ Α Χ Α ∀ 胚性悬浮系 的保持
悬浮系的保持需 ∀一 夭继代一次 , 工作量大 。 如果吸取少量培养物接种到 = /≅ 固体
培养基上 , 细胞团很快增殖 , 细胞质浓厚 , 将它再转回液体培养时能很快适应液体环境 , 并
较一直在液体中培养的生长更加旺盛 。 这种方法减 轻了工作量 , 改善 了培养物的培养特
性 , 能在较长时间内保持旺盛的增殖能力和植株再生潜能 。本试验用这种方法保存悬浮系
武 汉 植 物 学 研 究 第 ∀ 卷
表 Χ 悬 浮 系 的 分 化
Ε + Φ,4 Χ 3 4 Π 4 ∗ 4 ) + 01∋ ∗ ∋ − 5 ( 5 Η 4 ∗ 5 1∋ ∗ 4 ( ,0 ( ) 4
分 化 处 理
Ε ) 4 + 0 Δ 4 ∗ 0
转入萌发培养基的愈伤组织块 数
= ( Δ Φ 4 ) ∋ − 4 + 川 ) ) + ∗ 5 −4 ) 4 Ι
0 ∋ Η ,+ ∗ ) ) 4 Π 4 ∗ 4 ) + 0 1∋ ∗ Δ 4 Ι 1+
出苗的愈伤组织块数
= ( )∗ Φ 4 ) ∋ − ) 4 Π 4 ∗ 4 ) + 0 4 Ι 4 + ,,1
分化率
3 4 Π 4 ∗ 4 ) + ) 1∋ ∗ ) + 0 4 !∴ #
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∀ Β > 的胚性悬浮系已成功地再生了原生质体植株 , 在常规高压蒸汽灭菌的培养基
上仍得到了 Β一 8 ∴的植板率 !另文发表 # 。
∀ 讨论
优质胚性悬浮系的建立是禾本科植物原生质体培养取得成功的关键步骤 。 从 ∀ Β >
悬浮系获得较高的植板率和大量原生质体再生植株 , 说明此悬浮系确是优质的胚性悬浮
系 , 它具有极高的植株再生潜能 。
优质悬浮系的建立 , 基因型和外植体是重要的因素 〔‘, Χ · ‘’ ·’‘, , ∀ Β > 是优 良的基 因型 。
本试验采用幼穗获得了良好的结果 , 而用幼胚和花药均未成功 。此外 , 本试验发现 , 依据愈
伤组织的生长状态提高继代频率也非常重要 , 能促使愈伤组织加速 向 , 型胚性愈伤 组织
转变 , 防止植株再生能力的降低或丧失 , 这是建立具高度植株再生潜能的优质胚性悬浮系
的重要措施 。
本试验在建立悬浮系时 , 没有遇 到其它作者所描述的需长时间不断淘汰培养物 中出
现的大量长形细胞的问题 。 这主要是在建立悬浮系前对愈伤组织进行仔细的鉴定与筛选
的结果 。 试验表明 ∃ 小麦 , 型胚性愈伤组织是建立胚性悬浮系理想的起始愈伤组织 。
在悬 浮培养 时 Α 以 ; ≅ Ρ 最好 , ? ? 最差 , 这可能是 由它们的总氮水平及氮源组成决定
的 。 在 ; ≅ Ρ 中 , 总氮在 >Β Δ Δ ∋, Θ Ρ 左右 , 其还原态氮 !包括按态氨和有机氮 #在 Χ Δ Δ ∋, Θ Ρ
左右 < = /≅ Ρ 中总氮为 7∀ Δ Δ ∋, Θ Ρ Α 还原态氮为 Δ Δ ∋, Θ Ρ < 而 ? ? 中总氮仅 Β Δ Δ ∋, Θ Ρ Α
故以 ; ≅ Ρ 最好 , ? ? 最差 。 在 = / ≅ Ρ 中补加脯氨酸能改善其培养特性证明了这一点 。
将悬浮培养 的细胞团转到 = / ≅ 固体培养基上培养一段 时间后 , 细胞质变得异常丰
富 。 一般认为 , 细胞 内含物丰富是胚性细胞的特征之一 〔∀ 〕。 将这种由悬浮培养衍生而来的
次生 9 型胚性愈伤组织再次转入 ; ≅ Ρ 中悬浮培养能很好地再次适应液体环境 , 并对悬浮
系有一种 “复壮 ”作用 ,有利于后来的原生质体分离与培养 。
参 考 文 献
, 孙勇如 , 安锡培主编 Α 植物原生质体培养 Α 北京 ∃ 科学出版社 , 8
Χ 夏镇澳 Α 植物原生质体研究新进展 Α 植物生理学 通讯 , Β 门!Χ # ∃ 一 >
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7 王大元 Α 禾本科植物组织培养和体细胞胚胎发生 Α 细咆生物学杂志 , Β 7 Α >! # ∃ Χ一加
孙宝林等 Α 提 高小麦原生质体再生植株频率的研 究 Α 生物工程学报 , !# Α >! Χ # ∃ > 一
第 ∀ 期 葛台明等 ∃ 高分化潜能 小麦胚性悬浮系的建立及保持 %
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