全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(11): 1976−1982 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家科技支撑计划项目(2011BAD35B06-1), 国家现代农业产业技术体系建设专项(CARS-04-02A), 黑龙江省普通高等学校
新世纪优秀人才培养计划(1252-NCET-004)和黑龙江省自然科学基金重大项目(ZD201213)资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 胡国华, E-mail: hugh757@vip.163.com, Tel: 0451-55199475; 陈庆山, E-mail: qshchen@126.com,
Tel: 0451-55191945
第一作者联系方式: E-mail: gary.wang.b.century@gmail.com **同等贡献(Contributed equally to this work)
Received(收稿日期): 2013-03-06; Accepted(接受日期): 2013-06-24; Published online(网络出版日期): 2013-08-12.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20130812.1750.013.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.01976
大豆高丝氨酸激酶 GmHSK基因的克隆与全生育期的表达分析
王家麟 1,** 姜 威 1,** 于 妍 4 刘春燕 2 陈庆山 1,* 胡国华 2,3,*
1东北农业大学农学院, 黑龙江哈尔滨 150030; 2黑龙江省农垦科研育种中心, 黑龙江哈尔滨 150090; 3国家大豆工程技术研究中心,
黑龙江哈尔滨 150050; 4吉林农业大学发展学院, 吉林长春 130600
摘 要: 高丝氨酸激酶(HSK)是天冬氨酸代谢途径中的重要酶, 控制赖氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸和异亮氨酸的生物合
成。本研究从大豆 Williams 82中克隆了大豆 HSK基因 GmHSK, 该基因 ORF长 1083 bp, 编码 360个氨基酸, 其分子
量为 37.64 kD, 等电点为 5.02。GmHSK基因与拟南芥中的 HSK基因具相似编码产物, 均具 GHMP激酶超家族保守
的 ATP 结合结构域。系统进化分析将植物的 HSK 蛋白分为 2类, GmHSK 与苜蓿的同源基因的进化关系最近, 且与
双子叶植物拟南芥、蓖麻等的 HSK 聚为一类。qRT-PCR 分析表明, GmHSK 在大豆全生育期的 8 个组织和器官中均
表达, 但表达水平不同。推测 GmHSK基因不仅是大豆营养生长所必需, 也在物质积累过程中起重要调控作用。研究
结果为转基因育种提高大豆蛋白的含量与品质提供了有益的候选基因。
关键词: 大豆; 高丝氨酸激酶; 表达模式; 全生育期
Cloning and Expression Analysis of Soybean Homoserine Kinase (GmHSK)
Gene at Whole Growth Period
WANG Jia-Lin1,**, JIANG Wei1,**, YU Yan4, LIU Chun-Yan2, CHEN Qing-Shan1,*, and HU Guo-Hua2,3,*
1 College of Agriculture, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China; 2 Land Reclamation Research & Breeding Centre of Heilongjiang,
Harbin 150090, China; 3 The National Research Center of Soybean Engineering and Technology, Harbin 150050, China; 4 Development Academy,
Jilin Agricultural University, Changchun 130600, China
Abstract: Homoserine kinase (HSK), the forth enzyme in the aspartate pathway, plays a key role in the biosynthesis for lysine,
methionine, threonine, and isoleucine in higher plants. A HSK gene, termed GmHSK was cloned from soybean Williams 82 which
contains a 1083 bp single open reading frame (ORF) encoding a 360 amino acid and 37.64 kD protein. The protein shares
homology with homoserine kinase from Arabidopsis thaliana. Sequence alignment indicated that GmHSK contained a conserved
motif of GHMP kinase superfamily. Phylogenetic analyses suggested that the HSK in plants could be classified into two groups.
To have a global view of the dynamic gene expression pattern during the whole growth period, we analyzed the transcript levels in
eight different tissues/organs by qRT-PCR. The results showed that the GmHSK gene was expressed in all vegetative organs and
reproductive organs with various levels and fluctuated during the plant development. This data provided a versatile resource to
understand the regulation of GmHSK gene during the whole growth period in the high protein crop, soybean, and could aid in the
transgenic breeding to improve the content and quality of soybean protein.
Keywords: Soybean; GmHSK; Expression profile; Whole growth stage
氮是作物生长发育必需的大量元素之一, 对作
物最终产量的贡献为40%~50%。高丝氨酸的合成和
积累, 是植物中氮素转换的重要形式[1]。同样, 基本
氨基酸作为重要的含氮化合物, 是植物体内蛋白质
合成的重要原料[2]。天冬氨酸代谢途径是植物氨基
酸合成的重要途径, 这个途径生成的赖氨酸、苏氨
第 11期 王家麟等: 大豆高丝氨酸激酶 GmHSK基因的克隆与全生育期的表达分析 1977


酸、甲硫氨酸和异亮氨酸都是人类和动物必需的氨
基酸。植物中的天冬氨酸代谢途径可以分为2个分支,
一条分支是赖氨酸的生物合成, 另一条分支又可分
为2个亚类, 一是苏氨酸和异亮氨酸的生物合成, 二
是甲硫氨酸的生物合成[3-4]。高丝氨酸激酶(HSK)是
天冬氨酸代谢途径中的第4个酶, 催化 L-高丝氨酸磷
酸化生成 O-磷酰-L-高丝氨酸(OPH)。进而通过苏氨
酸合成酶(TS)和胱硫醚-γ-合成酶(CGS), 分别生成
苏氨酸 , 异亮氨酸和甲硫氨酸 [5]。而在微生物中 ,
OPH 只用于苏氨酸和异亮氨酸的合成, 并不参与合
成甲硫氨酸[6-7]。
HSK属于 GHMP激酶超家族。这个家族的成员
参与细菌与真核生物中许多关键生物代谢途径 [8],
并且均具非常保守的ATP结合结构域 Pro-Xaa3-Gly-
Ser-Ser-Ala-Ala。由于 HSK在植物中的表达量很低,
妨碍了对其功能的深入研究, 但这并不影响学者们
对其潜在的调控甲硫氨酸和苏氨酸合成的猜想[9]。
在一些植物中, HSK基因已经被克隆和分析。除在豌
豆中发现2个 HSK 同源体外[10], 其他植物中均只含
一个 HSK。大麦幼苗中的 HSK于1976年最早被详细
研究报道[11]。从小麦芽中分离纯化, 获得内源 HSK,
对其三级结构的研究发现 , 它是2个亚基形成的二
聚体[12]。HSK在植物中的调控作用是多样的。在多
数双子叶植物中, HSK 可被 Thr、Met、Val、Ile 和
SAM 变构抑制, 而在单子叶植物中却不受抑制。如
小麦的 HSK 基因, 不受外源氨基酸的调控[12]; 拟南
芥的 HSK蛋白对这些氨基酸也不敏感[13]。相反, 豌
豆和小萝卜中 HSK 基因的表达, 却受这些氨基酸的
抑制 [10,14]; 在大豆中 , 过量的甲硫氨酸 , 能够抑制
HSK蛋白的活性[15]。
HSK 蛋白被定位于豌豆的叶绿体, 包含可溶部
分和类囊体膜结合元件[16-17]。对拟南芥 HSK的亚细
胞定位预测结果也证明, 它含叶绿体定位序列, 可
编码一段成熟的叶绿体定位导肽[13]。
本研究从大豆中克隆了编码高丝氨酸激酶的
GmHSK 基因, 进而应用 qRT-PCR 方法分析了它在
大豆全生育期和不同组织中的表达模式。这不仅对
GmHSK 基因在大豆生长过程中的作用有了较深入
的了解, 更为大豆品质育种提供了理论依据。
1 材料与方法
1.1 植物材料
大田种植大豆 Williams 82。根据大豆生育期的
划分[18], 经 28℃光照 8 h和 25℃黑暗 16 h 培养后,
分别取子叶、根、茎、叶、花、荚(0.5~1.0 cm)、荚
皮和籽粒, 立即以液氮冷冻, –80℃保存备用。设置 3
次重复。
1.2 基因克隆
根据拟南芥HSK (GenBank登录号为AAD33097)
蛋白序列, 应用本地化的 Blast软件, 在大豆 EST数
据库中 , 筛选出匹配较好的 EST 序列 , 利用
DNAMAN (Lynnon Biosoft, Canada)软件进行 EST序
列拼接, 得到 GmHSK的序列。根据预测基因的 CDS
序列, 用 Primer Premier 5.0 (PREMIER Biosoft, USA)
设计引物(表 1)。以叶片总 RNA 制备的 cDNA 作为
模板 , 进行 RT-PCR 扩增 , 回收目的基因产物与
pGEM-T Easy载体连接, 转化大肠杆菌DH5α, 挑取阳
性克隆, 送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

表 1 基因克隆和 qRT-PCR引物表
Table 1 Primers used in gene cloning and qRT-PCR
引物名称
Name of primer
序列
Sequence (5′−3′)
用途
Application
GmHSK-F ATGGCGACGTCGACGTGC 基因克隆 Gene cloning
GmHSK-R TCAATTTGGAATGCGTCTAGCACCA
Q-GmHSK-F TTCTGGCATCACTGAAATCG qRT-PCR表达分析 Expression analysis of qRT-PCR
Q-GmHSK-R GAAACTTCAACGGCATCAAC
Q-GmActin-F AGCGGGAAATTGTAAGGG qRT-PCR内参基因 Reference gene for qRT-PCR
Q-GmActin-R CGCCAATAGTGATGACCTG

1.3 总 RNA提取和 cDNA合成
将各样品在液氮中研磨后 , 利用 TRIzol 试剂
(Life Technologies, USA)提取总 RNA, 经 DNase I处
理去除DNA污染, 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA
的完整性 , BioMate 5 分光光度计 (Thermo Fisher
Scientific, USA)测定总 RNA的质量和浓度。取 5 μg
总 RNA 进行反转录, 应用 Invitrogen 反转录试剂盒
合成第一链 cDNA, –20℃保存备用。
1978 作 物 学 报 第 39卷


1.4 实时定量 PCR
通过绘制标准曲线和溶解曲线 , 确定 GmHSK
和 GmActin 基因(内参基因)引物的扩增效率和特异
性。采用 QuantiFast SYBR Green PCR 试剂盒
(QIAGEN, USA)提供的三步法 PCR 反应 , 在
Rotor-Gene Q Real-time PCR仪上(QIAGEN, USA)进
行实验。15 μL 的 qRT-PCR 体系含 2×QuantiFast
SYBR Green PCR Master Mix 7.5 μL, 10 μmol L–1上
下游引物各 1.5 μL, cDNA模板 1 μL, RNase-free H2O
3.5 μL。PCR扩增标准程序为 95℃预变性 5 min; 95℃
变性 10 s, 56℃复性 20 s, 72℃延伸 20 s, 40个循环。
每个样品 3次重复。以 GmActin11基因(GenBank登
录号为 BW652479)作为内参基因, 参照 2−ΔΔCT算法
计算各基因表达量 [19]。通过 Rotor-Gene Q Series
(QIAGEN, USA)软件和 Microsoft Excel分析处理实
验结果。
1.5 生物信息学分析
利用 http://www.phytozome.com/对基因进行结构
与定位分析。利用 DNASTAR Lasergene 8.0 MegAlign
(DNASTAR, USA)对基因及其同源序列进行联配分
析。通过 MEGA4 软件 [20]构建系统进化树 , 采用
Neighbor-Joining (NJ)算法, Bootstrap设定为 1000。利
用 NCBI 的 Protein Conservation Domain 程序, 分析
GmHSK 蛋白的保守结构域。利用 SOPMA (http://
npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/
npsa_sopma.html)分析蛋白质的二级结构。利用 Phyre
(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre/)的预测蛋白质三级
结构。利用 PSORT (http://psort.hgc.jp/form.html)预测蛋
白的亚细胞定位。
2 结果与分析
2.1 基因克隆及序列分析
根据拟南芥HSK蛋白序列, 应用本地化的Blast
软件, 在大豆 EST 数据库中, 筛选出 4 条匹配较好
且能覆盖拟南芥 HSK 基因全长的 EST 序列
(CF808568、BE329811、BF069552和 BM178051)。
利用 DNAMAN拼接获得一条 1190 bp连续的 cDNA
片段, 其中包含一个完整的开放阅读框。测序结果
显示, GmHSK基因(GenBank登录号为 FJ594404)全
长 1083 bp, 编码 360个氨基酸, 分子量为 37.64 kD,
等电点为 5.02。利用 http://www.phytozome.com/网站
提供的 Blast 程序比对发现, 该基因没有内含子, 并
且在大豆基因组中只有一个同源体, 定位于第 14染
色体。
2.2 生物信息学分析
SOPMA预测的 GmHSK蛋白质二级结构显示,
36.39%为 α螺旋结构, 16.94%为 β折叠结构, 6.67%
为 β转角结构, 40.00%为不规则卷曲结构。三级结
构预测结果显示, GmHSK 蛋白质含有 215 个氢键,
15 个 α螺旋结构, 13个 β 折叠结构和 29个转角结
构。多序列联配结果表明(图 1), 植物中的高丝氨酸
激酶比较保守, 均具有 GHMP 激酶超家族保守的
ATP结合结构域(GmHSK, P137-A147)。另外, H184
和 R-283也是重要的高丝氨酸结合位点[21]。系统进
化关系分析的聚类结果表明, 植物的高丝氨酸激酶
被分为单子叶植物(玉米、高粱、水稻、二穗短柄
草、青稞)和双子叶植物(大豆、蒺藜苜蓿、拟南芥、
葡萄、毛果杨、蓖麻)两类(图 2)。PSORT在线预测
结果表明 , GmHSK 蛋白定位于叶绿体 (确信度
0.95)。
2.3 全生育期的表达分析
图 3所示, GmHSK在大豆营养生长初期各器官
的表达量是增加的, 中期达到最大, 之后逐渐减少。
在营养生长开始的 VE~V1 期, GmHSK 在子叶中的
表达呈上升趋势, 在 V1 期达到最高(图 3-A~C)。在
大豆根中, 除 V5期外(图 3-F), GmHSK在各时期均
保持较高的表达水平。这表明 GmHSK 在根中的持
续大量表达, 对大豆营养生长具有重要的作用。而
在大豆茎和叶中 , GmHSK 基因的表达没有明显的
变化。
与营养生长期类似, GmHSK基因的表达水平在
生殖生长初期逐渐增加, 中期达到最大值。大豆茎
和叶中的表达高峰 , 分别出现于 R7 (图 4-G)和
R4 (图 4-D)期。而在花中的表达水平很低 , 但从
R1~R4期, 表达水平缓慢升高(图 4-A~D)。从 R4期
开始, 基因在豆荚中的表达水平开始逐渐升高, 直
至 R7期达到最高(图 4-D~G)。而籽粒中的表达水平,
在 R5期达到峰值后, 逐渐下降(图 4-E~H)。
3 讨论
HSK 基因最早在大肠杆菌中被克隆分离, 随后
对其功能进行了较为详细的研究。大肠杆菌的 HSK
只参与 Thr和 Ile的生物合成, 而在植物中, HSK同
时参与 Met的合成反应。因此, 植物的 HSK在进化
过程中, 扩大了催化底物和最终产物的范围, 可能
参与了多种氨基酸的生物合成[13]。大豆作为提供食
用油和蛋白质的重要经济作物[22], 其 HSK基因的功
能和表达模式却未见报道。
第 11期 王家麟等: 大豆高丝氨酸激酶 GmHSK基因的克隆与全生育期的表达分析 1979



图 1 GmHSK与其他物种 HSK蛋白的多序列联配分析
Fig. 1 Multiple sequence alignment of HSK proteins
Gm: 大豆; Mt: 蒺藜苜蓿; At: 拟南芥; Vv: 葡萄; Pt: 毛果杨; Rc: 蓖麻; Zm: 玉米; Sb: 高粱; Os: 水稻; Bd: 二穗短柄草; Hv: 青稞。
GmHSK: Glycine max (ACU26535); MtHSK: Medicago truncatula (AET01078); AtHSK: Arabidopsis thaliana (AAD33097); VvHSK: Vitis
vinifera (XP_002277887); PtHSK: Populus trichocarpa (EEE76015); RcHSK: Ricinus communis (EEF44862); ZmHSK: Zea mays
(AFW74162); SbHSK: Sorghum bicolor (EES06074); OsHSK: Oryza sativa (BAD23009); BdHSK: Brachypodium distachyon
(XP_003570732); HvHSK: Hordeum vulgare subsp. vulgare (BAJ85098).

为研究 GmHSK 基因在大豆氨基酸合成中的作
用 , 通过同源克隆的方法 , 在大豆中首次克隆了
GmHSK 基因 , 并且在大豆基因组中只发现了1个
HSK 基因。而在大多数维管植物中, 许多氨基酸生
物合成酶是以基因家族的形式出现的 , 常含2个或
多个成员。另外, 在拟南芥的 HSK 突变体 dmr1中,
Thr、Met和 Ile的生物合成并没有减少, 并且在植物
体内积累了大量的高丝氨酸[23]。这说明植物中单拷
1980 作 物 学 报 第 39卷



图 2 GmHSK蛋白与其他物种 HSK蛋白的系统进化树分析
Fig. 2 Phylogenetic analysis of HSK proteins from diverse
plant species
贝的 HSK 基因, 在天冬氨酸代谢途径中具有关键作
用, 也可能同时存在着同源性较低, 但具类似功能
的基因调控着相似的氨基酸合成途径。
通过多序列联配分析, 发现 GmHSK 蛋白与拟
南芥HSK蛋白具较高同源性, 并同属于GHMP激酶
家族。推测 GmHSK可能同 AtHSK具相似功能。系
统进化分析, 可将植物的 HSK蛋白分为单子叶植物
和双子叶植物两类。结合序列联配的信息, 某些特
定的氨基酸也许可以作为单子叶植物和双子叶植物
进化的分类依据。


图 3 GmHSK基因在大豆营养生长期不同组织器官中的表达
Fig. 3 Relative expression levels of GmHSK gene in different tissues and organs during the vegetative stage
A: VE期; B: VC期; C: V1期; D: V2期; E: V3期; F: V5期; G: V6期; C: 子叶; R: 根; St: 茎; L: 叶。误差线表示 3次重复的标准差。
A: VE; B: VC; C: V1; D: V2; E: V3; F: V5; G: V6; C: cotyledon; R: root; St: stem; L: leaf. Error bars represent the standard deviations of
data.

PSORT 预测的亚细胞定位结果表明, GmHSK
蛋白定位于叶绿体, 与 HSK在豌豆叶片中的定位结
果相同[16-17]。在豌豆韧皮部组织浸出液中, 高丝氨酸
是豌豆植株向籽粒转运物质中的主要成分之一[24]。然
而, 在大豆的多数生育期中, GmHSK 基因在根中的
相对表达水平高于其他组织和器官。这表明, 在大
豆根中, GmHSK可能大量存在于其他细胞器中, 并
调控高丝氨酸的积累和转运。
根据大豆 15个生育期中, 68个样品的 qRT-PCR
分析结果, 证明 GmHSK 基因在大豆植株的子叶、
根、茎、叶、花、荚、荚皮和籽粒中均表达, 但其 mRNA
的转录水平在各个时期并不相同, 推测 GmHSK 基因
可能与不同生育期的物质合成相关。从 GmHSK 基因
在大豆根、茎、叶中的表达趋势(图 3和图 4)可以看出,
在营养生长开始的VE~V1期和生殖生长开始的R1期,
该基因的表达呈低谷, 而在营养生长中期和生殖生
长末期达到表达高峰。说明 GmHSK基因与大豆的
营养生长和后期的物质积累密切相关。开花与结荚
是大豆进入生殖生长的标志 , 也是物质积累的开
始 , 随着时间的增长 , 物质积累也随之增加。
GmHSK 基因在花与荚中的表达, 随着生殖生长时
间的延长而增加 , 并且在荚中的表达量是花中的
2~3 倍。说明在大豆完成授粉, 开始籽粒发育的过
程中, GmHSK 基因大量表达, 可能参与调控物质的
合成与积累。R5期为植株的鼓粒期, 籽粒迅速膨大,
所需的营养物质最多, 新陈代谢旺盛, 此时 GmHSK
基因在籽粒中的表达量达到最大。R6 期为主茎上
第 4节的荚中包含充满整个腔的绿色籽粒, 叶片将
迅速泛黄, 位于最下面的 3~6 片复叶脱落, 籽粒即
将成熟。此时 GmHSK基因在荚皮中的表达量最大,
植株营养器官中的有机物, 以可溶的低分子化合物
状态 (如糖类、氨基酸等 )运往籽粒 , 并逐渐
第 11期 王家麟等: 大豆高丝氨酸激酶 GmHSK基因的克隆与全生育期的表达分析 1981



图 4 GmHSK基因在大豆生殖生长期不同组织器官中的表达
Fig. 4 Relative expression levels of GmHSK gene in different tissues and organs during the reproductive stage

A: R1期; B: R2期; C: R3期; D: R4期; E: R5期; F: R6期; G: R7期; H: R8期。R: 根; St: 茎; L: 叶; F: 花; P: 荚; Pw: 荚皮; Sd: 籽粒。
误差线表示 3次重复的标准差。
A: R1; B: R2; C: R3; D: R4; E: R5; F: R6; G: R7; H: R8. R: root; St: stem; L: leaf; F: flower; P: pod; Pw: pod wall; Sd: seed. Error bars
represent the standard deviations of data.

转化为高分子化合物(如淀粉、蛋白质和脂类等)积累
起来。R7和 R8期, 物质积累基本完成, 该基因表达
量也急剧下降。这些结果表明, GmHSK基因不仅是
大豆旺盛的营养生长所必需的, 也在物质积累过程
中起着重要的调控作用。
有研究表明, 病原物可以特异识别宿主的高丝
氨酸, 并降低宿主中高丝氨酸的含量, 同时诱导致
病基因的表达[25]。此外, 拟南芥 dmr1突变体中含有
高浓度的高丝氨酸, 并可抵抗霜霉病的侵染[23]。这
些研究结果, 为评估转 HSK 基因作物的抗病性提供
了理论依据。因此, GmHSK 基因的克隆和分析, 为
大豆品质育种和抗病育种提供了有益的候选基因。
4 结论
克隆了大豆GmHSK基因, 该基因ORF长1083 bp,
编码360个氨基酸 , 分子量为37.64 kD, 等电点为
5.02。GmHSK基因与拟南芥的 HSK基因具相似编码
产物, 均具 GHMP激酶超家族保守的 ATP结合结构
域。植物中的 HSK蛋白被分为两类, GmHSK与苜蓿
中的 HSK蛋白同源性最高, 并与拟南芥、蓖麻等双
子叶植物的 HSK 蛋白同处一个进化枝。GmHSK 基
因在大豆全生育期的8个组织和器官中均表达 , 但
1982 作 物 学 报 第 39卷


在各个时期的表达水平不同。推测 GmHSK 基因可
能与不同生育期的物质合成相关, 调控营养生长阶
段和后期的物质积累。
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