全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2015, 41(4): 666670 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(2014CB138701), 国家自然科学基金项目(30771287), 广西优良用材林资源培育
重点实验室开发课题基金(12A0202)和教育部博士学科点专项科研资金(200805930008)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 黎晓峰, E-mail: lxf@gxu.edu.cn, Tel: 0771-3235314 **同等贡献(Contributed equally to this work)
第一作者联系方式: 杨曙, E-mail: 74123810@qq.com; 杨列耿, E-mail: 176630911@qq.com
Received(收稿日期): 2014-11-02; Accepted(接受日期): 2015-02-06; Published online(网络出版日期): 2015-03-03.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20150303.1654.008.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2015.00666
铝离子胁迫下大豆根尖柠檬酸的分泌及 SGA1基因的表达
杨列耿 2,** 杨 曙 2,** 张永先 2 唐 健 1 黎晓峰 2,*
1广西优良用材林资源培育重点实验室 / 广西林业科学研究院, 广西南宁 530002; 2广西大学 / 亚热带生物资源保护与利用国家重点
实验室, 广西南宁 530005
摘 要: 为揭示铝离子诱导大豆根尖分泌有机酸的特点及介导有机酸分泌的信号途径, 采用溶液培养试验方法调查
AlCl3对大豆品种(广州本地 2 号)根尖有机酸分泌及 SGA1 基因表达的影响。结果表明, AlCl3胁迫下大豆活体根尖分泌
柠檬酸, 且分泌量随着铝浓度(25、50 µmol L–1AlCl3)和处理时间(2~12 h)的增加而增加; 大豆根尖以模式 II分泌柠檬酸,
处理后的前 4 h, 分泌速率很低, 其后显著提升; 有机酸明显分泌的诱导期长达 6 h; 在 50 µmol L–1 AlCl3的溶液中添加
异三聚体 G蛋白抑制剂百日咳毒素(200 ng mL–1), 柠檬酸分泌减少 38.7%。RT-PCR分析结果显示, AlCl3溶液诱导大豆
根尖 SGA1基因的表达, 其表达水平随着铝处理时间(0.5~12.0 h)的延长有提升的趋势, 而诱导的 SGA1基因表达明显早
于有机酸开始分泌时间(6 h)。这些结果表明, 铝离子诱导大豆根尖分泌柠檬酸及 SGA1基因的表达, 异三聚体 G蛋白可
能作为铝胁迫信号开关器参与有机酸分泌的调控。
关键词: AlCl3; 大豆; 柠檬酸; 异三聚体 G蛋白; SGA1基因
Secretion of Citrate from Root Apices and Expression of SGA1 in Soybean
under AlCl3 Stress
YANG Lie-Geng2,**, YANG Shu2,**, ZHANG Yong-Xian2, TANG Jian1, and LI Xiao-Feng2,*
1 Guangxi Key Laboratory of Superior Timber Trees Resource Cultivation / Guangxi Forestry Research Institute, Nanning 530002, China; 2 Guangxi
University / State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agrobioresources, Nanning 530004, China
Abstract: The effects of Al3+ on the secretion of organic acids from root apices and the expression of SGAI gene were
investigated by hydroponics to elucidate the characteritics of organic acid secretion and Al3+ stress signal transduction pathway
which mediates the secretion of organic acids in soybean Guangzhou bendi 2. The results showed that soybean root apices (in vivo)
secreted citrate under Al3+ stress. The secretion of citrate increased with the increase of Al3+ concentrations (25, 50 µmol L–1 AlCl3)
and the prolongation (2–12 hours) of treatment with Al3+. Citrate was secreted from root apices by pattern II in soybean. The
secretion rate was very low within initial four hours after Al3+ treatment but remarkably elevated thereafter. A gap of time between
the secretion and Al3+ treatment reached to about six hours. On the other hand, when cholera toxin, an inhibitor of heterotrimeric
G-protein, was added to Al3+ solution, the amount of citrate secreted decreased by 38.7%. RT-PCR analysis results indicated that
Al3+ induced SGA1 expression. In general, the expression level was elevated with the prolongation of treatment with Al3+ (0.5 to
12 hours). Moreover, Al3+ induced expression of SGA1 sooner than the secretion of citrate. These results imply that Al3+ induces
the secretion of citrate from root apices and SGA1 expression in the soybean, and heterotrimeric G proteins may act as a switch of
Al3+ stress signal to be involved in the regulation of citrate secretion from root apices under Al3+ stress.
Keywords: AlCl3; Soybean; Citrate; Heterotrimeric G-protein; SGA1 gene
酸性土壤占世界可耕地的 40%, 而过多的铝离子是
酸性土壤中限制植物生长的主要因子。铝(Al3+)抑制根系
生长, 阻碍根系对养分和水分的吸收, 进而导致地上部生
长不良, 产量下降[1]。耐铝植物可通过外排机制或内部耐
性机制抵御铝的伤害[2]。铝诱导根系分泌有机酸被认为是
植物抵御铝毒害的重要外排机制[2-3]。在不同种类植物中
第 4期 杨列耿等: 铝离子胁迫下大豆根尖柠檬酸的分泌及 SGA1基因的表达 667
可能存在不同的机制调控铝诱导根系分泌有机酸 , 细胞
信号的跨膜传导可能作为重要的因子参与有机酸分泌的
调控[4]。另一方面, 异三聚体 G蛋白是位于原生质膜上的
信号开关, 广泛参与生物细胞跨膜信号传导[5-6]。异三聚
体 G 蛋白高度保守, 多数物种的 G 蛋白 α 亚基由单基因
(GPA1)编码[7]。异三聚体 G蛋白在信号转导过程中发挥主
导作用[8]。然而, 到目前为止鲜有异三聚体 G蛋白介导的
细胞信号在调控有机酸分泌方面作用的报道。
大豆是我国重要的油料作物 , 东北是我国大豆的传
统产区。然而, 近年来由于大豆进口量的剧增, 东北地区
大豆生产面积大幅度减少 , 我国食用油安全面临前所未
有的严峻挑战。在南方酸性土壤地区扩大大豆生产成为保
障我国食用油安全的重要措施。然而, 鲜有报道在华南酸
性土壤地区种植的大豆品种对铝毒害的抗性机制的研究。
国际上虽有报道涉及大豆根系分泌有机酸的研究[9], 但是,
铝诱导大豆根尖分泌有机酸特性的研究并不充分 , 更无
异三聚体 G 蛋白介导的细胞信号调控大豆根尖分泌有机
酸的相关报道。本研究拟通过铝胁迫下大豆根尖有机酸的
分泌及异三聚体 G蛋白 α亚基基因(SGA1, 大豆 GPA1)的
表达, 分析异三聚体G蛋白对有机酸分泌的调控作用, 旨
在为揭示铝诱导大豆根尖分泌有机酸的特点及调控有机
酸分泌的信号途径提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试大豆(Glycine max)为广州本地 2号, 种子浸种后
均匀撒在湿润珍珠岩上, 28℃下遮光催芽 48 h。萌发种子
置塑料网筛 , 胚根向下插入塑料筛网筛眼中 , 筛网置含
0.5 mmol L–1 CaCl2 (pH 4.5)溶液的塑料盆上, 液面接触筛
网底部。植株培养于控温的人工光照培养室中, 光照强度
87.5~100.0 μmol m–2 s–1, 光照 (14 h)/黑暗 (10 h), 温度
25℃。每小时通气 15 min, 每天更换 CaCl2溶液。
1.2 根尖分泌有机酸的收集与测定
有机酸收集装置由聚甲基丙烯酸甲酯板组成, 分A、
B、C 3个部分(图1)分别为根尖室、隔离室和支持室。大
豆幼苗经室间隔板的缺口平置于底板上, 根尖(5 mm)置
根尖室。大豆幼苗置收集装置后, 在隔离室中加入2%琼脂
40℃溶液以防止根尖室中的溶液渗漏。琼脂冷却凝固(厚
约8 mm)后立即加入处理溶液于根尖室并使处理溶液淹
没根尖。支持室中加入氯化钙溶液和红墨水以保持老根区
湿润并指示隔离室的隔离效果。
图 1 根尖分泌物收集微型装置示意图
Fig. 1 Schematic of mini-chamber for the collection of root-tip
exudates
分别将 3日龄的大豆根尖置根尖室, 并在室内分别加
入 1、0、25和 50 µmol L–1 AlCl3溶液(含 0.5 mmol L–1 CaCl2,
pH 4.5, 下同)。处理 12 h后, 收集处理溶液, 分析其中的
有机酸含量。另以 0、50 µmol L–1 AlCl3处理大豆根尖, 处
理后每 2 h收集处理液, 并重新加入 1 mL新的处理液, 连
续收集 12 h。
最近本实验室的研究发现, 100、200和 400 ng L–1的百
日咳毒素(PTX)抑制黑麦根系分泌有机酸[10]。为调查异三聚
体 G 蛋白抑制剂对有机酸分泌的影响 , 分别以含 0
(AlCl3)、200 ng mL–1(AlCl3+PTX)百日咳毒素的 50 µmol
L–1 AlCl3 溶液处理根尖, 并以氯化钙处理的为对照(不加
AlCl3)。处理 10 h后收集处理溶液并参照 Li等[11]方法测
定处理溶液中根尖分泌的有机酸。
1.3 RNA提取
3日龄的大豆幼苗经 50 µmol L–1AlCl3溶液处理 0、
0.5、1、2、4、6、8和 12 h后按 RNApre Pure植物总 RNA
提取试剂盒说明书提取根尖(1 cm) RNA, RNA 提取物保
存于–80℃, 用核酸/蛋白分析仪(DU Series 700, Beckman
公司)测定其 260 nm和 280 nm下 OD值。以 1.2%琼脂糖
凝胶电泳(Powerpac Universal, Bio-Rad)检测所提 RNA完
整性, 电泳 15 min, 电压 250 V。
1.4 半定量 RT-PCR
参考 M-MLV反转录酶说明书合成 cDNA第 1条链。
反应体系(20 µL)中含 2 µg RNA模板、5 µL Oligo-dT (100
mg L–1), 70℃水浴 5 min, 冰浴 5 min 后加入反应液(由
4 µL 5×buffer、2 µL dNTPs、1 µL RNasin、1 µL M-MLV
反转录酶组成), 加水到总体系 20 µL, 37℃水浴 1 h, 95℃
水浴 5 min终止反应, –20℃保存。
大豆 G蛋白 α亚基基因 SGA1 (L27418.1)和微管蛋白
基因 β-Tublulin (内参基因, CA936138)由上海生工生物工
程技术服务有限公司合成, 分别为 SGA1-f: 5-ATTGAGC
GTCCCACCTAC-3; SGA1-r: 5-GCAACAGCAGCGTTTA
CAT-3; βT-f: 5-CGAGGTTGCTTTCTAGTTT-3; βT-r: 5-A
GCATCCTCCCACATAGTC-3。
SGA1和 βT基因扩增体系(20 µL)中含 0.5 µL cDNA
模板、2 µL 10×buffer、0.4 µL dNTPs、1.0 U Taq DNA聚
合酶、引物(SGA1-f、SGA1-r 或 βT-f、βT-r; 10 µmol L–1)
各 1 µL, 灭菌水补足 20 µL。PCR程序为 95 4 min℃ , 95 ℃
40 s, 59 40 s℃ , 72 1 min℃ , 14~36个循环, 72 10 min℃ ,
10 10 min℃ 。
PCR扩增产物用 2%琼脂糖电泳检测, 电泳条件为 80
V, 1 h。电泳结束后用 10 mg L–1溴化乙锭染液染色 5 min,
用凝胶成像系统(AITM-26, Alpha innotech corporation)观
察并照相, 用 Gel-Pro Analyzer 4.0 扫描分析光密度。以
SGA1 扩增产物的光密度/βt 基因扩增产物的光密度表示
SGA1基因的相对表达水平。
1.5 数据处理及统计方法
采用 SPSS16.0 统计分析数据, 新复极差法进行差异
性分析。
668 作 物 学 报 第 41卷
2 结果与分析
2.1 铝离子诱导大豆根尖分泌柠檬酸
大豆根尖经 25和 50 µmol L–1 AlCl3处理 12 h后, 柠
檬酸的分泌量达到 0.51±0.12 nmol Root apex–1、1.59±0.16
nmol Root apex–1, 分别为对照的 3.9倍和 12.0倍, 经检验
铝对大豆根尖分泌苹果酸的影响不显著。25 µmol L–1和
50 µmol L–1 AlCl3处理后苹果酸分泌量分别为 0.15 nmol
Root apex–1 和 0.17 nmol Root apex–1, 与对照处理(0.16
nmol Root apex–1)的差异不显著(图 2)。
50 µmol L–1 AlCl3处理 2、4、6、8、10和 12 h后, 柠
檬酸累积分泌量随着处理时间的延长而增加(图 3)。铝处
理后的 2、4 h, 柠檬酸分泌量与对照相当。处理 4 h后柠
檬酸分泌速率极显著提高。处理 6、8、10和 12 h后柠檬
酸分泌量分别为对照的 9.7、9.2、16.7和 15.5倍。
图 2 不同浓度的铝离子对根尖有机酸分泌的影响
Fig. 2 Effect of Al3+ on the secretion of organic acids from
root tips
柱状图上的不同小写字母表示差异显著(P<0.05), 不同的大写字
母表述差异极显著(P<0.01)。
Columns with different small letters are significantly different at
P<0.05, while those with capital letters are significantly different at
P<0.01.
图 3 铝诱导柠檬酸分泌的经时变化
Fig. 3 Time course of Al3+ induced secretion of citrate
2.2 异三聚体 G 蛋白活性抑制剂抑制大豆根尖在铝胁迫
下分泌柠檬酸
百日咳毒素(PTX)为异三聚体 G 蛋白活性抑制剂, 修
饰异三聚体 G蛋白 α亚基使异三聚体 G蛋白无法被活化。
在铝胁迫下 200 ng L–1 PTX处理的大豆根尖柠檬酸分泌
量为 0.90 ± 0.12 nmol root apex–1, 仅为对照处理的 61.3%
(图 4)。
Al3+处理的根尖经铬天青R染色后被染成明显的紫色
(图 5), 表明根尖细胞受到明显的伤害。在AlCl3溶液中添
加PTX后, 根尖染色程度明显加强。
图 4 百日咳毒素(PTX)对铝离子诱导柠檬酸分泌的影响
Fig. 4 Effect of PTX on Al3+ induced secretion of citrate
图 5 铬天青染色的根尖
Fig. 5 Root apices stained with eriochrome cyanine R
2.3 铝离子诱导大豆根尖异三聚体 G 蛋白 SGA1 基因的
表达
以 AlCl3 处理 4 h 后提取大豆根尖 RNA 反转录的
cDNA 为模板, 分别对 SGA1 和 βT 进行 PCR 扩增, 扩增
产物分别为 572 bp和 344 bp (图 6), 结果与预期片段大小
一致。SGA1和 βT的 PCR扩增经 14、16、18、20、22、
24、26、28、30、32、34 和 36 循环后, 扩增产物随循环
数的增加而增加(图 7 和图 8)。βT 在 16 个循环时进入指
数增长期, 26 个循环时进入平台期(图 8)。SGA1 在 22 个
循环时进入指数增长期, 32个循环时进入平台期。为保证
SGA1与 βT均处于扩增指数增长期, AlCl3处理后 SGA1的
半定量 RT-PCR体系采用同批异管扩增, SGA1扩增 26个
循环而 βT扩增 20个循环(图 8)。50 µmol L–1 AlCl3处理 0、
0.5、1、2、4、6、8和 12 h提取得根尖总 RNA的半定量
RT-PCR的扩增产量随着处理时间的延长呈上升趋势(图 9
第 4期 杨列耿等: 铝离子胁迫下大豆根尖柠檬酸的分泌及 SGA1基因的表达 669
图 6 RT-PCR扩增产物电泳图
Fig. 6 Electrophoregram of RT-PCR products
1: SGA1; 2: βT; M: marker.
图 7 同循环数下 βT(A)和 SGA1(B) PCR扩增产物电泳图
Fig. 7 Electrophoregram of PCR products of βT and SGA1 at
different cycles
图 8 同循环数下 βT和 SGA1 PCR产物的光密度
Fig. 8 Integrated optical density (IOD) of PCR products of βT
and SGA1 at different cycles
和图 10)。处理后 0.5、1.0和 2.0 h内, SGA1的表达量总
体呈上升趋势。处理 4 h后, SGA1的表达水平显著提高。
处理 8 h后, SGA1表达量趋于稳定。说明铝离子诱导大豆
根尖 G蛋白基因的表达。
3 讨论
铝毒害的原初反应位于根尖[12]。采用离体培养技术对
小麦、玉米、柱花草、荞麦等植物研究表明, 铝胁迫下根
尖能够分泌较多的有机酸[4,11,13]。为了更准确地了解铝胁迫
下植物正常的生理状态, 我们设计、制作了根尖培养和分
泌物收集装置。该装置能维持根尖正常的生理状态, 满足
根处于活体状态下方便收集有机酸的要求。采用该装置收
集到根尖分泌物中的有机酸并发现铝诱导大豆根尖分泌柠
檬酸(图1)。该研究结果与Yang等[9]、Dong等[14]的研究结果
相似 , 他们均发现铝诱导大豆根系分泌柠檬酸的现象。
图 9 AlCl3处理后根尖 SGA1 PCR扩增产物的经时变化
Fig. 9 Time course of SGA1 PCR products of root apices treated with AlCl3
图 10 不同处理时间铝处理对根尖 SGA1基因表达的影响
Fig. 10 Effect of Al3+ treatment time on the expression of
SGA1 in root tips
据报道, 铝可诱导柱花草、荞麦、黑麦等植物根系分
泌有机酸[11,13,15]。由于根系分泌的柠檬酸、苹果酸等低分
子量有机酸与铝离子结合形成毒性较低的有机酸-铝复合
物, 因此, 根系分泌有机酸被认为是植物抵御铝毒害的重
要机制[2-4]。本研究结果显示, 铝胁迫下大豆根尖表皮细
胞受 ER 染色程度因 AlCl3处理溶液中加入 PTX 而加重,
而 PTX 显著抑制 AlCl3诱导根尖分泌柠檬酸(图 3), 说明
根尖分泌柠檬酸是大豆抵御铝毒害的重要机制。
根据铝胁迫下根分泌有机酸的响应快慢程度 , 植物
有两种有机酸分泌的模式[4,15]。模式I中植物有机酸的分
泌仅需要很短时间的铝胁迫诱导。而对于模式II, 有机酸
的分泌需要较长时间的铝胁迫诱导。在本研究中, AlCl3
处理后2、4 h, 大豆根尖分泌的柠檬酸与对照处理间的差
670 作 物 学 报 第 41卷
异不显著(图2)。当AlCl3处理时间延长至6 h后, 柠檬酸分
泌显著加快、分泌量极显著高于对照, 说明大豆属于模式
II植物。
调控模式 I、模式 II植物根系分泌有机酸的机制可能
不同。模式 II 植物有明显的诱导期暗示相关的分泌可能
涉及基因、细胞信号转导等复杂的调控过程[4]。PTX能催
化 GDP 结合异三聚体 G 蛋白的 ADP 核糖基化使 G 蛋白
及其受体解偶联而专一性地抑制 GTPase活性。因此, PTX
是异三聚体 G 蛋白信号研究的重要工具。PTX 抑制蓝光
下黄化豌豆幼苗原生质膜异三聚体G蛋白 ADP核糖基化,
说明 GTP 结合蛋白参与光刺激的信号途径。PTX 抑制保
卫细胞 K+流和异三聚体 G 蛋白活性, 也说明异三聚体 G
蛋白参与细胞 K+流的调控[16]。本研究发现 PTX显著抑制
大豆根尖在铝离子胁迫下根尖分泌柠檬酸(图 4), 初步说
明异三聚体 G 蛋白参与有机酸分泌的调控。铝离子处理
后大豆根尖 SGA1 基因表达水平显著提升(图 9 和图 10),
随之根尖在铝离子胁迫下柠檬酸分泌量明显增加。并且,
SGA1基因表达显著提升所需的铝处理时间(4 h)较有机酸
分泌诱导期短(6 h)(图 3和图 10), 这些结果进一步说明异
三聚体 G 蛋白及其基因参与铝离子胁迫下柠檬酸分泌的
调控。
据报道, MATE是铝激活的柠檬酸分泌蛋白基因, 而铝
激活的有机酸分泌蛋白基因受转录因子 STOP1调控[17-18]。
细胞信号可能通过 STOP1 的磷酸化激活有机酸分泌蛋白
从而导致根系在铝胁迫下分泌有机酸[18]。异三聚体 G 蛋
白是位于原生质膜上的信号开关器 , 使胞外信号跨膜传
导进入细胞内[5-6]。本研究发现异三聚体 G蛋白介导的细
胞信号可能参与铝胁迫下大豆根尖分泌柠檬酸的调控。最
近本实验室的 Li 等[10]也发现, 异三聚体 G 蛋白可能介导
铝离子胁迫信号的传导 , 调控黑麦和拟南芥根在铝胁迫
下分泌苹果酸。基于这些发现, 我们推测异三聚体 G蛋白
可能作为信号开关器 , 将铝胁迫信号传导进入胞内并被
胞内下游效应器接受。异三聚体 G 蛋白介导的细胞信号
进一步激活大豆转录因子 STOP1, 上调 SGA1基因和柠檬
酸通道蛋白 MATE表达水平, 并导致柠檬酸的分泌。
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