全 文 ：武汉植物学研究 2000, 18 (2) : 127～ 130
J ourna l of W uhan B otan ica l Resea rch
云南溪菜多糖的分离纯化及其性质研究
邵　华　胡鸿钧Ξ
(中国科学院武汉植物研究所　武汉　430074)
提　要　从云南溪菜中提取的水溶性胞外粗多糖 (EPS) , 用 Sevag 法脱蛋白后, 经D EA E2纤
维素柱层析和葡聚糖凝胶 G2200 柱层析可得到纯品。溪菜多糖复合物经碘试验证明含有少
量淀粉,BaC l2 试验检测出含有 SO 2-4 , 琼脂糖凝胶电泳显示含有糖类及蛋白质, 且其组成不均
一。用L ow ry 法测得蛋白质含量为 13154% , 苯酚2硫酸法测得糖含量为 78%。经薄层层析和
纸层析鉴定, 溪菜多糖复合物的酸水解物中含有大量D 2甘露糖 (D 2M anno se) , 少量D 2核糖
(D 2R ibo se)及L 2鼠李糖 (L 2R ham no se) , 其含量比为 4∶1. 5∶1。
关键词　云南溪菜, 多糖
ISOLAT ION, PUR IF ICAT ION AND CHARACTER IZAT ION
OF POLY SACCHAR ID ES FROM PRAS IOLA YUN N AN ICA
Shao H ua　H u Hongjun
(W uhan Institu te of B otany , T he Ch inese A cad emy of S ciences　W uhan　430074)
Abstract　T he po lysaccharides ex tracted from p rasiola y unnan ica. by ho t w ater are EPS
(ex tracellu lar po lym eric substances). T hey are dep ro tein ized by Sevag m ethod fo r several
t im es and purified by D EA E2cellu lo se and Sephadex G2200 ch rom atography co lum n in tu rn.
T he crude po lysaccharides w ere p roved to have a lit t le starch and som e SO 2-4 by iodine
indicato r and BaC l2 so lu tion respectively. A garo se gel electropho resis show s the ex istence of
sugar and p ro tein w h ich are inhomoaenous. It has 13154% of p ro tein essayed by L ow ry
m ethod, and 78% of sugar by benzene2H 2SO 4 m ethod. A nd the rest are ash and w ater.
T he componen ts of the crude po lysaccharides w ere iden tified by paper ch rom atography
and TL C w h ich w ere D 2M anno se, D 2R ibo se and L 2R ham no se w ith the rat io of 4∶115∶1.
D 2R ibo se in the algal po lysaccharides studies is qu ite rare.
Key words　P rasiola y unnan ica, Po lysaccharides
目前国内外关于多糖的研究报道虽然较多, 但是在已知的约 3 万余种藻类中, 迄今只
对其中约 150 种的多糖进行了一定程度的研究。在藻多糖的研究中大型藻类引起人们的
广泛重视, 并从多方面进行了大量研究〔1, 2〕, 其中褐藻、红藻在国内的研究已较为深入, 微
藻中的蓝藻多糖亦有报道〔3〕。绿藻中的多糖虽也有研究, 但关于溪菜多糖方面的工作尚未Ξ 收稿日: 1999203211, 修回日: 1999204212。第一作者: 女, 1969 年 11 月出生, 博士生, 现从事植物生态学研究。通讯联系人
见报道。
云南溪菜 (P rasiola y unnan ica Jao ) 为绿藻门丝藻目溪菜属水生或亚气生藻类, 以水
生种类居多, 其中淡水生种类多分布在山涧、溪流中, 其它少数种类则分布在海岸附近, 喜
生有机质丰富之地; 气生种类生长于潮湿的土壤、岩石、树皮之上。我国的四川、湖北、西
藏、云南、台湾等省及日本均有分布, 有些地方称之为“水陆菜”。早在八百多年前, 我国就
有食用溪菜的记载, 并被人们视为佳肴。除食用外, 溪菜还有药用功能, 我国的贵州省清溪
县民间以其为枪伤要药, 云南省民间用作清凉菜食用, 湖北省神农架地区以溪菜泡茶, 可
清热祛毒1)。溪菜干品的营养成分经分析鉴定, 含有 34168% 的蛋白质、0176% 的脂肪, 其
氨基酸组成亦十分丰富, 含有 17 种氨基酸, 人体必需的 8 种氨基酸中含有 7 种〔4〕。我们仅
对其多糖成分进行初步研究。Ξ
1　材料与方法
111　材料
云南溪菜采自云南丽江的金沙江, 60℃烘干后密封置冰箱中冷藏。D EA E2纤维素为
W hatm an 进口分装产品, Sephadex G2100、G2200 均为 Pharm acia 公司产品。薄层硅胶薄
板为江苏福山生化试剂厂产品。单糖样品为 Sigm a 公司产品。其它化学试剂均为分析纯
或化学纯。
112　分离、提取及纯化
溪菜干品切碎后用蒸馏水在 80℃恒温下提取 5 h 后, 用滤布滤去藻渣, 滤液离心
(5 000 röm in, 15 m in) , 收集上清液, 浓缩后加 215 倍体积 95% 乙醇沉淀多糖, 沉淀物用
丙酮清洗、冰冻干燥, 可得多糖粗品。该粗品配成 1% 溶液, 用 Sevag 法脱蛋白〔5〕5 次后, 加
入 215 倍体积乙醇沉淀多糖, 先后用无水乙醇和丙酮洗涤, 冰冻干燥。
脱蛋白的多糖, 用蒸馏水溶解后经过D EA E2纤维素柱 (直径 2 cm , 长 25 cm ,OH - 型)
层析, 流速 25 mL öh, 每管收集 3 mL , 苯酚2硫酸法检测糖含量, 分别用蒸馏水、015 mo löL
N aC l 及 2 mo löL N aC l 溶液洗脱, 依次得 P 1、P 2、P 3 组分, 烘干后称重。取含量较高的P 2 经
葡聚糖凝胶G2100 及G2200 柱层析 (直径 2 cm , 长 52 cm ) , 用蒸馏水洗脱, 流速 12 mL öh,
蓝色D ex tran2000 测外水体积 (V 0)。收集单峰部分, 可得纯品 P 2C〔6〕。
113　 理化性质
1. 3. 1　淀粉含量　粗多糖配成 1% 溶液, 滴加数滴碘试剂后呈现明显蓝色。P 1、P 2、P 3 3 个
组分均不变色。用淀粉溶液标准曲线法于 620 nm 波长下比色查得淀粉含量〔7〕。
1. 3. 2　 SO 2-4 检测　粗多糖溶液滴加数滴 1% BaC l2 溶液以除去游离的 SO 2-4 , 5 m g 粗
多糖用 2 mL 1 mo löL 盐酸于 100℃封管水解 5 h 冷却后滴加BaC l2溶液, 所用玻璃器皿均
以硝酸洗涤〔8〕。
1. 3. 3　蛋白质含量　①电泳检测: 115% 琼脂糖制板 (215 cm ×715 cm ) , 012 cm 厚, 硼酸
盐缓冲液 pH = 10, 015% 溴酚蓝溶液做指示剂, 电泳 15 m in (电压 300V ) , 置乙醇中固定
后分别以 011% 甲苯胺蓝溶液及 0125% 考马斯亮蓝R 2250 溶液染色 30 m in, 然后置醋
821 武 汉 植 物 学 研 究　　　　　　　　　　　　　　　第 18 卷　　
Ξ 1) 钱澄宇: 19841 药用藻类 (未刊稿)。
酸∶乙醇∶水 (011∶5∶5)中脱色。②茚三酮反应: 粗多糖水溶液、P 2 (未过 SephdexG2200
柱)遇茚三酮均呈蓝紫色, P 2C 不变色。③含量测定: 按L ow ry 法〔9〕进行, 以牛血清白蛋白
(BSA )为标准样品。
1. 3. 4　糖含量　用苯酚2硫酸法测定〔7〕。
1. 3. 5　单糖组成　①水解: 称取粗多糖 10 m g , 加入 6 mL 1 mo löL 硫酸溶液后于 100℃
封管水解 5 h, 水解液冷却后用饱和的Ba (OH ) 2溶液中和, 然后离心去除沉淀, 上清液浓
缩后备用。②纸层析: 层析滤纸 12 cm ×25 cm , 溶剂系统为正丁醇2吡啶2水 (8∶4∶3)。分
别将浓缩后的水解液及各种标准单糖用毛细管点样, 上行层析 10 h。层析毕, 于烘箱中烘
干展层剂, 均匀喷洒苯胺2二苯胺2三氯乙酸显色剂, 然后置 100℃ 烘 10 m in 显色〔10〕。③薄
层层析: 薄层 (5 cm ×20 cm ) , 先喷 0102 mo löL 醋酸钠溶液, 然后置 100℃烘箱中活化
1 h, 冷却后置干燥器中备用。水解液依次点 5 个样, 展层剂同纸层析, 待展层剂距顶端 1
cm 时取出, 烘干展层剂后, 用玻璃板遮住中间 3 个样品而仅将两侧样品显色, 显色剂同
上。刮取中间对应位置的硅胶并以 1 mL 蒸馏水提取后, 加苯酚2硫酸比色〔11〕。
2　结果与讨论
211　云南溪菜多糖的 3 个组分
由溪菜藻体结构及破碎方法可知本实验提取的为胞外多糖 (EPS)。30 g 溪菜提取可
得 1141 g 粗多糖, 得率为 417%。溪菜的热水提取物, 经D EA E2纤维素柱层析分离为中性
多糖 (水洗组分) 1 种 (P 1) 及酸性多糖 2 种 (015 mo löL N aC l 及 2 mo löL N aC l 溶液洗脱
物, 依次为 P 2 和 P 3)。P 1、P 2、P 3 3 个组分干燥后的重量为 515 m g、2015 m g、115 m g, 其重
量比为 316∶1316∶1。P 1、P 2 及 P 3 均比粗多糖更易溶于水。其中 P 1、P 3 为纯白色, P 2 为红
褐色。
图 1　P2 的 Sephadex G-200 柱层析
F ig11　Gel2filtration ch rom atography of
P2 on Sephadex G2200Sephdex G2100 洗脱结果显示 P 2 大部分组分分子量大于 10 万 (洗脱体积小于外水体积) , 仅有 1 个小峰的洗脱体积大 于 V 0, 其 分 子 量 应 小 于 10 万。Sephdex G2200 洗脱图 (图 1) 显示 P 2 至少含有 7 种分子量不同的组分, 其中高峰部分洗脱液呈明显的红褐色 (透明) ,为胶体溶液。干燥后呈白色粉末状, 易溶于水。212　溪菜多糖的理化性质
碘实验显示粗多糖中含有淀粉。从
标准曲线上计算出其含量为 01084%。经D EA E2纤维素柱层析分离后, P 1、P 2、P 3 均与碘
试剂不反应。
粗多糖的盐酸水解液加入BaC l2 溶液后立即产生明显的白色BaSO 4沉淀, 证明云南
溪菜多糖中有较多共价结合的硫酸基存在, 而硫酸基对于多糖的理化性质及生物活性都
有重要影响。多种硫酸酯多糖具有独特的医药保健功能, 如治疗肿瘤、肝炎, 降血脂、血糖,
921　第 2 期　　　　　　　　　　　　邵 华等: 云南溪菜多糖的分离纯化及其性质研究
促进蛋白质和核酸的生物合成等。常见的例如肝素 (H eparin) , 具有阻止血液凝固的特性,
可作为输血时的血液抗凝剂及用于防止血栓形成。更具意义的是, 1958 年, Gerber 首次报
道了硫酸酯多糖具有抗病毒活性, 它对具有包膜的病毒能产生强大的抑制作用, 因此, 硫
酸酯多糖的抗爱滋病病毒作用日益受到各国药理学家及病毒学家的重视, 并在临床上取
得了一定的疗效。陈春英等〔12〕报道, 经硫酸酯化的箬叶多糖比酯化前具更高的抑制H IV
(爱滋病病毒) 的作用, 可作为抗爱滋病的药物, 而若将硫酸基去掉, 则其部分生物活性丧
失; 此外, 从海藻中提取的天然硫酸酯多糖也具有一定的抗爱滋病病毒的作用。云南溪菜
多糖潜在的药用功能, 目前正在进一步的研究之中。
电泳中用甲苯胺蓝及考马斯亮蓝染色均得到一条较为均匀的由阴极延伸到阳极的
带, 证明粗多糖中含有糖类及蛋白质, 且其组成不均一。茚三酮反应显示粗多糖及P 2 组分
均含有蛋白质。用L ow ry 法测得蛋白质含量为 13154% , 苯酚2硫酸法测得糖含量为
78% , 其余为灰分及水分。
P 2C 遇茚三酮不变色, 其理化性质及结构尚有待进一步研究。
213　云南溪菜多糖的单糖组成
粗多糖经酸水解并中和后离心, 上清液置水浴上浓缩后以甲醇溶解并点样进行纸层
析。结果可见有一个明显的灰色斑点, 其颜色及R f 值与D 2甘露糖相同; 另有较浅的一个
绿色斑点及一个紫灰色斑点, 其颜色及R f 值分别与D 2核糖及L 2鼠李糖相同, 说明粗多糖
由大量D 2甘露糖、少量D 2核糖及L 2鼠李糖构成, 不含葡萄糖。以甘露糖的R f 值为 1, 则它
们的相对R f 值之比为D 2甘露糖÷D 2核糖÷L 2鼠李糖= 1100÷1114÷1129。硅胶薄层层析测
得三者的含量比为 4÷115÷1。在云南溪菜多糖的组成中发现D 2核糖, 这在有报道的藻类多
糖的研究中尚属首次, 该戊糖的存在对于多糖的结构及性质有何影响, 尚需进一步探讨。
致谢　本文中云南溪菜部分营养成分测定由湖北省农科院测试中心协助进行, 谨致谢意。
参　考　文　献
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