全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(10): 1775−1782 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(31071405)和国家转基因生物新品种培育科技重大专项(2013ZX08009003)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 孔令让, E-mail: lkong@sdau.edu.cn
Received(收稿日期): 2013-03-07; Accepted(接受日期): 2013-05-24; Published online(网络出版日期): 2013-08-01.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20130801.1726.009.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.01775
小麦 NPR1-like基因的克隆及赤霉菌诱导下的表达分析
杨在东 马 信 吴世文 王宏伟 孙 鑫 冀宪领 李安飞 孔令让*
作物生物学国家重点实验室 / 山东农业大学农学院, 山东泰安 271018
摘 要: AtNPR1是拟南芥系统获得性抗病反应中的关键基因, 对拟南芥的广谱抗性起重要调控作用。从赤霉菌诱导
的小麦抗、感赤霉病近等基因系 RNA差异表达谱中获得 3个与 AtNPR1类似的 EST片段, 据此检索相应序列信息并
设计引物, 从小麦中克隆得到 3个 cDNA全长序列, 分别命名为 TaNPR1、TaNPR2和 TaNPR3, 其开放阅读框分别编
码 580、607 和 601 个氨基酸残基。序列分析表明, 这 3 个小麦 NPR1-like 蛋白都含有保守的 BTB/POZ、ANK 和
NPR1_like_C结构域及功能氨基酸, 但仅 TaNPR1具有 2个对 NPR1寡聚体形成十分必要的保守半胱氨酸残基。蛋白
质聚类分析表明, TaNPR1与 TaNPR2和 TaNPR3的同源性均较低, 其中 TaNPR1与 NPR1蛋白聚为一类, 而 TaNPR2
和 TaNPR3均与 NPR1同源蛋白聚为一类。实时荧光定量 PCR分析结果显示, TaNPR1、TaNPR2和 TaNPR3基因都可
被植物抗病相关信号分子水杨酸和茉莉酸甲酯诱导。与感病材料 Apogee 相比, 抗病近等基因系 Apogee73S2 中
TaNPR1和 TaNPR3能够更早地响应赤霉菌的诱导并显著上调表达; 而 TaNPR2在感、抗材料中对赤霉菌侵染的响应
都较为缓慢且变化不明显。这些结果表明, TaNPR1和 TaNPR3可能在小麦对赤霉菌的防御反应中起重要作用。
关键词: 小麦; NPR1-like基因; 赤霉病; 基因表达分析
Cloning of NPR1-like Genes and Their Response to Fusarium graminearum In-
fection in Wheat
YANG Zai-Dong, MA Xin, WU Shi-Wen, WANG Hong-Wei, SUN Xin, JI Xian-Ling, LI An-Fei, and KONG
Ling-Rang*
State Key Laboratory of Crop Biology / College of Agronomy, Shandong Agricultural University, Tai’an 271018, China
Abstract: NPR1 gene plays a key role for systemic acquired resistance (SAR) and provides broad-spectrum resistance in Arabi-
dopsis. Fusarium head blight (FHB), which is caused by Fusarium graminearum Schwabe, is a devastating disease of wheat
worldwide. Based on the analysis of the gene expression profiling, we cloned three NPR1-like genes from wheat FHB
near-isogenic lines induced by F. graminearum, and they were designated as TaNPR1, TaNPR2, and TaNPR3. The open reading
frames of the three genes encoded 580, 607, and 601 amino acid residues, respectively. The three wheat NPR1-like proteins had
conversed BTB/POZ, ANK, and NPR1_like_C domain as well as conversed amino acid residues with important functions. How-
ever, only TaNPR1 had two conversed cysteine residues that are essential for the NPR1 oligomer formation. Phylogenetic analysis
showed that TaNPR1 was involved in the NPR1 protein group, while TaNPR2 and TaNPR3 were close to NPR1 homologues.
Quantitative RT-PCR assay revealed that the three NPR1-like genes could be induced by defense related signal molecules, such as
salicylic acid and methyl jasmonate. TaNPR1 and TaNPR3 were induced earlier and up-regulated more significantly in response to
F. graminearum infection in the resistant line Apogee73S2 than in the susceptible line Apogee. However, the transcription of
TaNPR2 was not obviously changed in either the resistant or susceptible near-isogenic lines after inoculation with F. graminearum.
These results suggest that TaNPR1 and TaNPR3 may be involved in the defense response to F. graminearum.
Keywords: Triticum aestivum; NPR1-like genes; Fusarium head blight (FHB); Expression analysis
为了抵抗病原菌的侵染, 植物在长久的进化过 程中形成了一系列的防御机制, 其中系统获得抗性
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(systemic acquired resistance, SAR)是一种可诱导的
植物抗性反应 , 并能够提供持久的广谱性抗病作
用[1]。SAR反应的诱发需要水杨酸(salicylic acid, SA)
的积累 , 并且伴随着病程相关蛋白 (pathogenesis-
related protein)的协同表达[2]。NPR1 (nonexpressor of
pathogenesis related genes 1)基因是 SA介导的 SAR
反应中的核心调控元件[3-4], 该基因编码的蛋白包含
一个位于 N端 BTB/POZ (broad-complex, tramtrack,
and bric-a-brac/pox virus and zinc finger)结构域和一
个位于中间区域锚蛋白重复结构域 ANK (ankyin
repeat domain), 这 2 个结构域在蛋白质间的相互作
用中起重要作用[5-6]。在未受到病原菌侵袭时, NPR1
蛋白通过二硫键相互结合, 以多聚体的形式存在于
细胞质中。当感染病原菌后, SA的积累改变了细胞
中的氧化还原势, 导致 NPR1单体的释放。NPR1单
体进入细胞核后与 TGA-bZIP 转录因子结合, 进而
激活防御反应相关基因的表达, 最终引起 SAR 反
应[7-8]。研究表明, 依赖于茉莉酸(jasmonic acid, JA)
和乙烯(ethylene, ET)介导的诱导系统抗性(inducted
systemic resistance, ISR)反应同样也需要 NPR1的参
与[9]。因此, 作为必需的调控基因, NPR1 参与调控
SAR 与 ISR 反应并在整个抗病网络中发挥重要作
用。目前, 已从拟南芥[5]、水稻[10]、心叶烟[11]、中
间偃麦草[12]、棉花[13]、苹果[14]等多种植物中分离到
NPR1 基因及同源基因, 并对部分基因的功能进行
了不同程度的研究。在转基因水稻中过表达 AtNPR1
和水稻 NPR1 同源基因均明显提高对白叶枯病的抗
性[15]。苹果植株转 MpNPR1基因后提高了对苹果黑
星病菌和桧胶锈菌的抗性 [14]。在拟南芥中过表达
AtNPR1基因, 增强了对丁香假单胞菌和寄生霜霉菌
的抗性[16], 而将 NPR1 基因突变后, 突变植株更容
易受到这些病原菌的侵染[5]。
赤霉病是由禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)
引起的一种严重的小麦穗部病害, 除造成产量的降
低及经济损失外, 在侵染过程中还产生多种真菌毒
素, 严重危害人类和动物的健康[17]。尽管对赤霉病
的研究已经做了大量工作 , 但其抗病机制尚不明
确。Makandar等[18]把拟南芥 AtNPR1 基因转入小麦
品种 Bobwhite 中, 提高了转基因植株对赤霉菌的抗
性。目前, 在小麦上仅检索到一次 NPR1 同源基因
NPH2 (NPR1 homolog 2)的专利注册 (专利号 :
WO0070069), 而未见对小麦 NPR1的研究报道。在
拟南芥、水稻、玉米、短柄草等植物中均发现多个
NPR1 同源序列, 而且研究表明在拟南芥中, NPR1
的同源物 NPR3 和 NPR4 对 NPR1 介导的抗病反应
起到重要的调控作用[19]。小麦是异源六倍体, 基因
组庞大, 可能存在更多的 NPR1同源基因。因此, 克
隆并研究小麦 NPR1 及其同源基因, 对于揭示小麦
与赤霉菌的相互作用并探讨小麦赤霉病抗病机制具
有十分重要的意义。本研究从小麦中克隆了 3 个
NPR1-like基因 TaNPR1、TaNPR2和 TaNPR3的全长
cDNA 序列, 并进行序列分析和功能预测, 同时还
对 SA、茉莉酸甲酯(MeJA)及赤霉菌诱导下这 3个基
因的表达特性进行了研究。
1 材料与方法
1.1 试验材料
小麦抗、感赤霉病近等基因系 Apogee73S2 (抗)
和 Apogee (感)由美国明尼苏达大学 D. Garvin博士
提供。其创制过程是, 以抗赤霉病小麦品种苏麦 3
号为供体亲本, 感病材料 Apogee 为轮回亲本, 回交
4 代后自交得到基因型近于纯合的抗赤霉病近等基
因系 Apogee73S2。在回交和自交过程中 , 利用与
Fhb1紧密连锁的分子标记 Xgwm493和 Xgwm533对
目标基因逐代进行分子辅助筛选, 最后选育出抗、
感赤霉病近等基因系。
1.2 诱导处理及 cDNA合成
将 2 个近等基因系小麦幼苗在 4℃培养箱中春
化 3周, 然后转移到温室中, 每天光照 16 h, 平均温
度 28℃(昼)/16℃(夜)。以绿豆汤做培养基, 25℃振荡
培养禾谷镰刀菌, 使其产生孢子。用无菌水悬浮孢
子, 使菌液浓度为 1×106 mL−1。在开花期以单花接种
法接种禾谷镰刀菌(F. graminearum), 每小花接种 10
μL 菌液, 以无菌水处理作对照。接种后用透明塑料
袋套袋保湿, 在接种后 12、24、48和 72 h采集颖壳,
每个时间点分别取 10 穗。禾谷镰刀菌(F. gramin-
earum)由南京农业大学王秀娥教授提供。
以抗病系 Apogee73S2 为实验材料, 分别用 SA
和MeJA (均为 2 mmol L−1)浸泡萌发后 1周的小麦幼
苗根部, 于诱导处理 0 (对照)、1、2、4、8、12 和
24 h后取样(根上部)。
所有样品采集后立即用液氮处理并置−80℃保存。
采用TIANGEN RNA试剂盒提取上述实验材 料的总
RNA, 再利用 TransGen 试剂盒合成 cDNA 第一链。
第 10期 杨在东等: 小麦 NPR1-like基因的克隆及赤霉菌诱导下的表达分析 1777


1.3 TaNPR1、TaNPR2和 TaNPR3序列的获得
采集赤霉菌处理 72 h及对照处理的颖壳, 提取
其总 RNA 构建差异表达谱 , 从中获得 3 条小麦
NPR1及其同源基因的 EST片段, 然后查询 Triticeae
Full-Length CDS Database (http://trifldb.psc.riken.jp/
index.pl)得到其 cDNA 序列。根据 cDNA 序列设计
引物(表 1), 以接菌后 72 h 的 cDNA 为模板进行扩
增。PCR扩增体系为 20 μL, 含 10×Taq buffer (Mg2+)
2 μL、模板 2 μL、10 μmol L−1上下游引物各 0.5 μL、
2.5 mmol L−1 dNTPs 1.5 μL、5 U L−1Taq DNA聚合酶
0.3 μL、H2O 13.2 μL。扩增程序为 94℃ 5 min; 94℃
30 s, 60℃ 30 s, 72℃ 2 min, 36个循环; 72℃延伸 10
min。反应产物经 1%的琼脂糖凝胶电泳分离, 然后
进行目的带回收、克隆和测序。
1.4 序列分析和同源性比对
利用 NCBI的在线分析工具 ORF Finder预测基
因的开放阅读框 ; 用 ProtParam (http://expasy.org/
tools/protparam.html)在线分析氨基酸序列的理化性
质; 利用 SOPMA 对编码蛋白的二级结构进行预测;
利用在线工具 Pfam (http://pfam.sanger.ac.uk/)预测基
因编码蛋白的结构域; 用 DNAMAN 和 MEGA 4.0
软件进行相关蛋白序列的同源性比对 , 构建进
化树。
1.5 基因表达分析
根据 TaNPR1、TaNPR2和 TaNPR3基因的序列,
设计特异的荧光定量 PCR引物(表 1), 以 SA、MeJA
处理的幼苗 cDNA 及赤霉菌和无菌水处理的颖壳
cDNA为模板, 利用 Bio-Rad CFX96TM实时荧光定
量 PCR 仪检测目的基因表达模式。内参基因为
β-Actin [20], 其引物序列见表 1。按照 SYBR Primix Ex
Taq 试剂盒(TaKaRa)说明书配制 PCR 反应体系。反
应条件为 95℃ 30 s; 95℃ 10 s, 57℃ 15 s, 72℃ 20 s,
40 个循环。采用 2-ΔΔCT法对目的基因进行相对定量
表达分析。每个样品设 3 次重复, 每次处理有 3 次生
物学重复。用 DPS软件作差异显著性分析(LSD法)。
2 结果与分析
2.1 小麦 TaNPR1、TaNPR2 和 TaNPR3 基因的
克隆和分析
通过 RT-PCR 对 TaNPR1、TaNPR2 和 TaNPR3
的全长 cDNA进行扩增, PCR产物经 1%琼脂糖凝胶
电泳后分别得到 1775、1848和 1827 bp的目的带(图
1)。测序结果显示, TaNPR1开放阅读框长度为 1743
bp, 预测编码 580个氨基酸, 蛋白分子量为 63.6 kD,
理论等电点 pI 为 5.22, 而在小麦数据库 Triticeae
Full-Length CDS Database中比对到的 cDNA全长仅
能编码 473个氨基酸, 因此克隆得到的 TaNPR1为一
个新基因。TaNPR2与 TaNPR3的开放阅读框长度分
别为 1824 bp和 1806 bp, 编码 607个和 601个氨基
酸, 两者的蛋白分子量较为接近, 但等电点相差较
大, 分别为 5.27和 5.70 (表 2)。TaNPR1与 TaNPR2
和 TaNPR3的氨基酸序列相似度分别为 41%和 40%,
而将小麦 NPR1同源物 NPH2与 TaNPR1、TaNPR2、
TaNPR3 比较, 发现其与 TaNPR2 序列十分相似, 相
似度为 97%, 但与 TaNPR1、TaNPR3 相似度仅为
41%和 52%。对氨基酸的理化性质及蛋白二级结
构预测分析后发现(表 2), 3 个小麦 NPR1-like 蛋白
均为脂溶性的疏水蛋白 , 其二级结构中都包含 α
螺旋、延伸链、β 折叠和无规则卷曲。TaNPR1 和
TaNPR2均含有 69个碱性氨基酸, 而 TaNPR3在酸性
和碱性氨基酸数目上均高于 TaNPR1与 TaNPR2 (表
2)。

表 1 TaNPR1、TaNPR2和 TaNPR3克隆及表达分析所用引物
Table 1 Primers for TaNPR1, TaNPR2, and TaNPR3 isolation and qRT-PCR analysis
序列 Sequence (5′–3′) 引物
Primer 正向 Forward 反向 Reverse
用途
Purpose
TaNPR1 GGGGTACCAATGGAGGCCCCGAGCAG GGGGTACCAATTGGCCAGGGTGCTCATCT Gene cloning
TaNPR2 TGCTCTAGAGATGGAGCCGTCGTCGTCC TCCCCCGGGTACCTTCACTTCATCGCCGAGG Gene cloning
TaNPR3 GCTCTAGACATGGAGACGTCGACCGTCAC GCTCTAGATGTATCACCGCGACAGCCTC Gene cloning
TaNPR1-q GCAGTGGAGGCAAGAGTAGC GAACAGCGCGGGAAGTAAC qRT-PCR
TaNPR2-q CCCACCATCGTGTAAAACCG TCTCCGTCTTCGCAACCAG qRT-PCR
TaNPR3-q GCAGTGCCGAGGACCAGT TGGCGACACCGAGCACAT qRT-PCR
Actin-q CCGGCATTGTCCACATGAA CCAAAAGGAAAAGCTGAACCG Internal reference
1778 作 物 学 报 第 39卷



图 1 TaNPR1、TaNPR2 和 TaNPR3基因的 RT-PCR 扩增电泳图
Fig. 1 RT-PCR amplification of TaNPR1, TaNPR2, and TaNPR3
M1, M3: Trans2K DNA marker; M2: Trans2K plus DNA marker.

2.2 TaNPR1、TaNPR2和 TaNPR3的同源性比较
及进化分析
通过 Pfam (http://pfam.sanger.ac.uk/)以及 NCBI
的 BLASTP对 TaNPR1、TaNPR2和 TaNPR3的蛋白
结构域及序列相似性分析表明 TaNPR1、TaNPR2和
TaNPR3 均含有与 AtNPR1 类似的 BTB/POZ、ANK
和 NPR1_like_C 结构域(图 2)。TaNPR1 与拟南芥
AtNPR1蛋白的同源性最高, 为 46%, 而 TaNPR2和
TaNPR3 与 AtNPR1 的蛋白同源性则分别为 38%和
40%。对小麦、拟南芥、烟草、水稻的 NPR1及 NPR1
同源蛋白的氨基酸序列的多重比对分析发现 ,
TaNPR1、TaNPR2和 TaNPR3均含有保守的 npr1-1、
npr1-2、nim1-4 功能位点(图 3), 这些氨基酸残基对
于 NPR1功能的行使起重要作用。此外, TaNPR1还
具有对 NPR1 寡聚体形成所必需的 2 个保守半胱氨
酸残基, 分别为 Cys71 和 Cys211。不同物种 NPR1
及 NPR1 同源蛋白的进化树表明 , NPR1 蛋白与
NPR1 同源蛋白在进化上形成不同分支, TaNPR1 和
TaNPR2、TaNPR3同源性较低。TaNPR1、TaNPR2、
TaNPR3分别与大麦、短柄草、水稻、玉米的 NPR1、
NPR2 及 NPR3 蛋白聚为一类, 并与大麦的 NPR 蛋
白同源关系最近(图 4)。
2.3 TaNPR1、TaNPR2和 TaNPR3对信号分子的
响应
为了检测 TaNPR1、TaNPR2 和 TaNPR3 对抗病
信号分子的响应情况, 分别用 SA和MeJA对抗赤霉
病近等基因系 Apogee73S2 进行处理。SA 和 MeJA
处理后, TaNPR1表达量升高, 分别在处理 4 h和 8 h
后出现表达高峰 , 与各自对照相比均差异显著
(P<0.05)。与 TaNPR1相比, TaNPR2和 TaNPR3对 SA
和MeJA的响应更为迅速, 其表达量在处理 2 h后便
达到最高值, 随后出现降低趋势, 与对照相比表达
变化差异显著(P<0.05)(图 5)。因此, TaNPR1、TaNPR2
和 TaNPR3在 SA和 MeJA处理后均被诱导表达, 表
明上述基因可能参与了信号分子 SA和 JA介导的抗
病信号途径。

表 2 TaNPR1、TaNPR2和 TaNPR3蛋白的理化性质
Table 2 Physical and chemical parameters for TaNPR1, TaNPR2, and TaNPR3
蛋白
Protein
分子量
MW (kD)
等电点
pI
酸性氨基酸数
No. of NCR
碱性氨基酸数
No. of PCR
脂溶指数
AI
总平均疏水指数
GAH
α螺旋
AH (%)
β折叠
BT (%)
无规卷曲
RC (%)
延伸链
ES (%)
TaNPR1 63.6 5.22 88 69 91.69 −0.170 57.41 5.17 31.38 6.03
TaNPR2 66.1 5.27 84 69 87.31 −0.196 55.19 4.45 33.77 6.59
TaNPR3 66.5 5.70 92 78 93.21 −0.244 51.91 3.99 34.44 9.65
MW: molecular weight; pI: isoelectric point; No. of NCR: number of negatively charged residues; No. of PCR: number of positively
charged residues; AI: aliphatic index; GAH: grand average of hydropathicity; AH: alpha helix; BT: beta turn; RC: random coil; ES: extended
strand.


图 2 TaNPR1、TaNPR2和 TaNPR3的蛋白结构域
Fig. 2 Protein domains of TaNPR1, TaNPR2, and TaNPR3
第 10期 杨在东等: 小麦 NPR1-like基因的克隆及赤霉菌诱导下的表达分析 1779



图 3 小麦 TaNPR1、TaNPR2、TaNPR3与其他植物 NPR蛋白的氨基酸序列比对
Fig. 3 Alignment of amino acid sequences among TaNPR1, TaNPR2, TaNPR3, and NPR proteins
多重分析所用序列分别是 AtNPR1 (NP_176610)、AtNPR3 (NP_199324)、AtNPR4 (NP_193701)、NtNPR1 (AAM62410)、OsNPR1
(ABE11614)、OsNPR2 (ABE11615)和 OsNPR3 (ABE11618)。∇ 表示 npr1-1 (H)、npr1-2 (C)和 npr1-4 (R)处的氨基酸位点; ★表示 2个
保守的半胱氨酸残基位点。
The sequences used in multiple alignment analysis are AtNPR1 (NP_176610), AtNPR3 (NP_199324), AtNPR4 (NP_193701), NtNPR1
(AAM62410), OsNPR1 (ABE11614), OsNPR2 (ABE11615), and OsNPR3 (ABE11618). Symbol “∇” shows the positions of npr1-1 (H),
npr1-2 (C), and npr1-4 (R). Symbol “★” shows the two crucial Cys residues.

2.4 赤霉菌诱导的表达分析
qRT-PCR分析表明, 在未接菌时, TaNPR1表达
量较低, 而在接种赤霉菌后, 抗病材料 Apogee73S2
中 TaNPR1 被迅速诱导并在 12 h 出现表达高峰, 其
表达量约为 Apogee 中 TaNPR1 表达量的 2.58 倍
(P<0.05), 随后呈现出下降趋势; 与其相比, TaNPR1
在感病材料 Apogee中表达量虽然也逐渐升高, 但直
到 48 h 才达到最高值。TaNPR2 对赤霉菌的侵染响
应较为缓慢, 并且在整个胁迫过程中抗、感材料表
达量变化未出现显著差异(P<0.05)。TaNPR3 在赤霉
菌诱导处理后 24 h内表达量逐渐升高, 并在 24 h达
到顶峰, 此后的 24 h到 72 h表达量虽有所下降, 但
仍显著高于对照(P<0.05), 而且 TaNPR3在接菌后 48
h内的表达量在抗病材料 Apogee73S2中显著高于在
感病材料 Apogee中(P<0.05)(图 6)。
3 讨论
首先在拟南芥中通过图位克隆获得 NPR1 基
因[5], 随后在多种植物中都发现NPR1基因及同源基
因[16]。作为植物抵抗病原菌胁迫过程中的一个核心
1780 作 物 学 报 第 39卷


元件, NPR1介导的抗性可能在单子叶及双子叶植物
中也十分保守 [15]。本研究从小麦中分离得到 3 个
NPR1-like 基因的全长 cDNA 序列, 序列分析表明,
TaNPR1、TaNPR2及 TaNPR3具有 BTB/POZ和 ANK
功能域, 这 2个功能域在 NPR1蛋白中高度保守, 并
且参与蛋白质间的相互作用。其中, 突变 ANK结构
域中的 npr1-1和靠近 N端的 npr1-2氨基酸位点, 会
造成 NPR1 不能与 TGA 转录因子结合, 导致 PR 基
因诱导失败并使植物更容易感病[23]。在 C 端突变
nim1-4位点并不影响NPR1与TGA转录因子的结合,
却也会造成 SAR 反应不能被正常诱导 [15], 推测
nim1-4突变可能影响 NPR1与其他 SAR信号蛋白的
结合。多重序列比对结果显示, TaNPR1、TaNPR2及
TaNPR3 在 npr1-1、npr1-2 和 nim1-4 氨基酸位点


图 4 不同物种间 NPR1及 NPR1 同源蛋白的进化树
Fig. 4 Phylogenetic tree of NPR1 and NPR1 homologues from different species
括号中为该蛋白的 GenBank登录号; 进化树分支上数字为 Bootstrap值。
GenBank accession number is shown in the parenthesis after protein name. The number above each branch represents bootstrap value.


图 5 SA和 MeJA诱导下 TaNPR1 (A)、TaNPR2 (B)和 TaNPR3 (C)的表达
Fig. 5 Expression of TaNPR1(A), TaNPR2(B), and TaNPR3(C) induced by SA and MeJA
第 10期 杨在东等: 小麦 NPR1-like基因的克隆及赤霉菌诱导下的表达分析 1781



图 6 赤霉菌诱导下 TaNPR1 (A)、TaNPR2 (B)和 TaNPR3 (C)的表达
Fig. 6 Expression of TaNPR1 (A), TaNPR2 (B), and TaNPR3 (C) induced by F. graminearum

十分保守。在正常状态下, NPR1能够通过二硫键形
成寡聚体存在于细胞质中, 而保守的半胱氨酸残基
对于二硫键的形成十分必要。在拟南芥中, 半胱氨
酸残基 Cys82和 Cys216对于 NPR1寡聚体的形成至
关重要[8]。而在水稻中也存在这 2个保守的半胱氨酸,
分别位于第 83和第 211位[24]。本研究对 TaNPR1、
TaNPR2 和 TaNPR3 氨基酸序列分析发现, TaNPR1
同样存在 2 个保守的半胱氨酸活性位点 , 分别为
Cys71 和 Cys211。但 TaNPR2 与 TaNPR3 仅在第一
个半胱氨酸位点处保守, 另一个位点被 L 代替, 在
拟南芥、水稻的 NPR1同源物 AtNPR3、AtNPR4和
OsNPR2、OsNPR3中也同样如此。表明 NPR1同源
基因虽然在该活性位点与 NPR1 存在差异, 但在不
同物种中仍十分保守。此外, 3个小麦 NPR1-like蛋
白还具有 NPR1 蛋白家族代表性的 NPR1_like_C 结
构域。综合以上结果可以看出, TaNPR1、TaNPR2及
TaNPR3 在结构上的保守性对行使抗病功能具有十
分重要意义, 但其在小麦抗病反应中所起到的具体
作用尚需进一步验证。
进化树分析显示, 小麦 TaNPR1、TaNPR2 和
TaNPR3分别与单子叶植物的 NPR1、NPR2及 NPR3
进化关系较近, 其中与大麦的 NPR 蛋白关系最近,
推测在进化过程中, TaNPR1、TaNPR2和 TaNPR3可
能分别与大麦 HvNPR1、HvNPR2 和 HvNPR3 存在
直向同源关系。TaNPR1 与 TaNPR2、TaNPR3 在进
化树中分属不同分支, 同源关系较远。TaNPR1 与
AtNPR1 及其他物种的 NPR1 蛋白关系较近 , 而
TaNPR2 和 TaNPR3 则与包括 AtNPR3、AtNPR4 在
内的 NPR1同源蛋白的进化关系较近, 表明 TaNPR2
和 TaNPR3可能为 TaNPR1的旁系同源物。尽管 SA
诱导的 SAR 反应需要调控因子 NPR1 的参与, 但
NPR1并不直接与 SA结合。最近在拟南芥中的研究
表明, NPR1的同源物 NPR3和 NPR4是水杨酸的受
体, 能够与其结合并作为泛素 E3连接酶 Cullin 3的
转接蛋白 (adaptor)介导 NPR1 降解 [19]。在拟南芥
npr3/npr4 双突变体中虽然累积了较多的 NPR1, 但
对 SAR反应并不敏感[19]。这表明 NPR3和 NPR4在生
物学功能上与 NPR1 不同, 可以通过与 SA 的结合对
NPR1 介导的抗病反应起到十分重要的调控作用。目
前水杨酸介导的小麦抗病网络并不明确, 而在小麦中
TaNPR1、TaNPR2、TaNPR3是否分别行使与 AtNPR1、
AtNPR3和 AtNPR4类似的功能, 有待深入研究。
一般认为, SA介导的 SAR反应主要对活体营养
型病菌起作用, 而 JA/ET 介导的抗病信号途径对抵
抗腐生型真菌的侵染起重要作用[25]。引发小麦赤霉
病的禾谷镰刀菌是一种半腐生型真菌, 因而小麦赤
霉病抗病机制可能更加复杂。本研究通过荧光定量
PCR分析了 SA、MeJA处理及赤霉菌诱导下 3个小
麦 NPR1-like基因的表达情况, 发现 SA、MeJA均能
明显诱导 TaNPR1及其同源基因 TaNPR2和 TaNPR3
的表达。在接种赤霉菌后, 虽然抗、感近等基因系
中 TaNPR1和 TaNPR3都能响应赤霉菌的诱导而上调
表达, 但在抗病材料 Apogee73S2中这 2个基因在接
种后的响应更为迅速、表达量更高。与 TaNPR1 和
TaNPR3相比, TaNPR2在赤霉菌诱导后, 感、抗材料
中均未出现显著差异。因此推测抗病材料 Apogee
73S2中, TaNPR1和 TaNPR3对赤霉菌侵染前期的快
速响应可能对赤霉病抗性起重要作用, 而 TaNPR2
无显著作用。本研究中 TaNPR1、TaNPR2及 TaNPR3
基因的克隆, 为进一步研究 NPR1-like 基因在小麦
赤霉病抗病反应中的作用以及构建小麦水杨酸、茉
莉酸路径调控网络奠定了基础。
1782 作 物 学 报 第 39卷


4 结论
从小麦抗赤霉病近等基因系中克隆获得 3 个与
拟南芥 AtNPR1结构类似的 NPR1-like基因, 分别命
名为 TaNPR1、TaNPR2 和 TaNPR3, 其编码的 3 个
NPR1-like蛋白中, TaNPR1的同源性与AtNPR1最高,
而 TaNPR2、TaNPR3与 AtNPR3、AtNPR4同源关系
较近。TaNPR1和 TaNPR3不但能被 SA和 MeJA所
诱导, 还能快速响应赤霉菌的侵染而明显上调表达;
而 TaNPR2虽然也能响应 SA和 MeJA的诱导, 但对
赤霉菌的侵染并无显著响应。因此 , TaNPR1 和
TaNPR3可能参与了小麦赤霉病的抗病防御过程。
References
[1] Durrant W E, Dong X N. Systemic acquired resistance. Annu Rev
Phytopathol, 2004, 42: 185–209
[2] Dong X N. NPR1, all things considered. Curr Opin Plant Biol,
2004, 7: 547–552
[3] Gaffney T, Friedrich L, Vernooij B, Negrotto D, Nye G, Uknes S,
Ward E, Kessmann H, Ryals J. Requirement of salicylic acid for
the induction of systemic acquired resistance. Science, 1993, 261:
754–756
[4] Mukhtar M S, Nishimura M T, Dangl J. NPR1 in plant defense:
it’s not over’til it’s turned over. Cell, 2009, 137: 804–806
[5] Cao H, Glazebrook J, Clarke J D, Volko S, Dong X N. The
Arabidopsis NPR1 gene that controls systemic acquired resis-
tance encodes a novel protein containing ankyrin repeats. Cell,
1997, 88: 57–63
[6] Aravind L, Koonin E V．Fold prediction and evolutionary
analysis of the POZ domain: structural and evolutionary rela-
tionship with the potassium channel telramefization domain. J
Mol Biol, 1999, 285: 1353–1361
[7] Kinkema M, Fan W H, Dong X N. Nuclear localization of NPR1
is required for activation of PR gene expression. Plant Cell, 2000,
12: 2339–2350
[8] Mou Z L, Fan W H, Dong X N. Inducers of plant systemic ac-
quired resistance regulate NPR1 function through Redox changes.
Cell, 2003, 113: 935–944
[9] Pieterse C M J, Van Wees S C M, Van Pelt J A, Knoester M,
Laan R, Gerrits H, Weisbeek P J, de Van Loon L C. A novel sig-
naling pathway controlling induced systemic resistance in
Arabidopsis. Plant Cell, 1998, 10: 1571–1580
[10] Chern M, Fitzgerald H A, Canlas P E, Navarre D A, Ronald P C.
Overexpression of a rice NPR1 homolog leads to constitutive ac-
tivation of defense response and hypersensitivity to light. Mol
Plant-Microbe Interact, 2005, 18: 511–520
[11] Zhang L, Zhang Y, Shi J, Zhang L, Guo X Q. Molecular cloning
and characterization of a novel NPR1 gene from Nicotiana gluti-
nosa. Acta Phytopathol Sin, 2009, 39: 482–490
[12] Tang Y-M(唐益苗), Zhang Z-Y(张增艳), Xin Z-Y(辛志勇).
Isolation and characterization of NPR1 homolog gene TiNH1 in
Thinopyrum intermedium. Sci Agric Sin (中国农业科学), 2007,
40(6): 1101–1107 (in Chinese with English abstract)
[13] Zhang Y, Wang X, Cheng C, Gao Q, Liu J, Guo X. Molecular
cloning and characterization of GhNPR1, a gene implicated in
pathogen responses from cotton (Gossypium hirsutum L.). Biosci
Rep, 2008, 28: 7–14
[14] Malnoy M, Jin Q, Borejsza-Wysocka E E, He S Y, Aldwinckle H
S. Overexpression of the apple MpNPR1 gene confers increased
disease resistance in Malus × domestica. Mol Plant-Microbe In-
teract, 2007, 20: 1568–1580
[15] Chern M S, Fitzgerald H A, Yadav R C, Canlas P E, Dong X N,
Ronald P C. Evidence for a disease-resistance pathway in rice
similar to the NPR1-mediated signaling pathway in Arabidopsis.
Plant J, 2001, 27: 101–113
[16] Cao H, Li X, Dong X N. Generation of broad-spectrum disease
resistance by overexpression of an essential regulatory gene in
systemic acquired resistance. Proc Natl Acad Sci USA, 1998, 95:
6531–6536
[17] Desjardins A E, Hohn T M. Mycotoxins in plant pathogenesis.
Mol Plant-Microbe Interact, 1997, 10: 147–152
[18] Makandar R, Essig J S, Schapaugh M A, Trick H N, Shah J. Ge-
netically engineered resistance to Fusarium head blight in wheat
by expression of Arabidopsis NPR1. Mol Plant-Microbe Interact,
2006, 19: 123–129
[19] Fu Z Q, Yan S P, Saleh A, Wang W, Ruble J, Oka N, Mohan R,
Spoel S H, Tada Y, Zheng N, Dong X N. NPR3 and NPR4 are
receptors for the immune signal salicylic acid in plants. Nature,
2012, 486: 228–233
[20] Jia H Y, Cho S, Muehlbauer G J. Transcriptome analysis of a
wheat near-isogenic line pair carrying Fusarium head blight re-
sistant and susceptible alleles. Mol Plant-Microbe Interact, 2009,
22: 1366–1378
[21] Glazebrook J, Rogers E E, Ausubel F M. Isolation of Arabidopsis
mutants with enhanced disease susceptibility by direct screening.
Genetics, 1996, 143: 973–982
[22] Wastemack C, Parthier B. Jasmonate signaled plant gene expres-
sion. Trends Plant Sci, 1997, 2: 302–307
[23] Zhang Y, Fan W H, Kinkema M, LI X, Dong X N. Interaction of
NPR1 with basic leucine zipper protein transcription factors that
bind sequences required for salicylic acid induction of the PR-1
gene. Proc Natl Acad Sci USA, 1999, 96: 6523–6528
[24] Yuan Y X, Zhong S H, Li Q, Zhu Z R, Lou Y G, Wang L Y,
Wang J J, Wang M Y, Li Q L, Yang D L, He Z H. Functional
analysis of rice NPR1-like genes reveals that OsNPR1/NH1 is the
rice orthologue conferring disease resistance with enhanced her-
bivore susceptibility. Plant Biotechnol J, 2007, 5: 313–324
[25] Glazebrook J. Contrasting mechanisms of defense against
biotrophic and necrotrophic pathogens. Annu Rev Phytopathol,
2005, 43: 205–227