全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2015, 41(2): 259275 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由安徽省农业科学院科技创新团队项目(13C0202), 安徽省种子工程项目(14D0202)和安徽省农业科学院作物研究所自主课题
(13A0101)资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 张磊, E-mail: 13955165987@163.com, 佘茂云, E-mail: ahxiaoshe@126.com
第一作者联系方式: E-mail: guixiangyin@126.com
Received(收稿日期): 2014-07-02; Accepted(接受日期): 2014-09-30; Published online(网络出版日期): 2014-11-11.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20141111.1556.006.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2015.00259
大豆 TRK-HKT家族基因结构及逆境胁迫响应机制
殷桂香 张 磊* 佘茂云*
安徽省农业科学院作物研究所, 安徽合肥 230031
摘 要: 植物 TRK-HKT 家族基因广泛介导植物 Na+/K+运输, 参与植物耐逆境胁迫调控。本研究以 6 个大豆钾利用
效率差异品种为材料, 利用 in silico技术克隆到 4个大豆 TRK-HKT家族成员(GmHKT1;1、GmHKT1;2、GmHKT1;3
和 GmHKT1;4), 采用 qRT-PCR技术解析这些基因在低钾及逆境胁迫下的表达机制。结果表明, GmHKT1;2在大豆幼
苗根中对低钾胁迫的响应明显高于其他 3 个基因, 且钾高效大豆品种这种响应更明显; 同时 GmHKT1;2 对不同逆境
胁迫(低温、干旱、高盐和 ABA)也有较强的响应。蛋白结构分析表明, 仅 GmHKT1;2具有 4个 MPM结构域, 4个保
守的氨基酸残基空间上形成一个“漏斗样”结构, 充当 K+/Na+转运通道, 通过邻近的 ATP 结合结构域, 为 K+/Na+转运
提供能量。基因结构分析显示, 这些基因均含 3个外显子和 2个内含子, 不同基因间的第一个外显子和内含子片段大
小差异显著, 导致各基因的基因组 DNA (gDNA)大小各异。启动子分析揭示, 大豆 TRK-HKT家族成员包含参与种子
功能定位和各种激素及逆境胁迫应激反应的重要顺式作用元件; 进化上该家族基因位于第一进化分支, 含保守的
Ser–Gly–Gly–Gly基序。
关键词: 大豆; TRK-HKT家族; 分子鉴定; 逆境胁迫
Structural Characterization and Abiotic Stress Response of Soybean TRK-
HKT Family Genes
YIN Gui-Xiang, ZHANG Lei, and SHE Mao-Yun
Crop Institute, Anhui Academy of Agricultural Sciences, Hefei 230031, China
Abstract: Plant TRK-HKT family genes are involved in Na+/K+ transportation and regulation to abiotic stresses. We used six
soybean varieties with different potassium use efficiencies (PUE) as materials, cloned four soybean TRK-HKT family genes
(GmHKT1;1, GmHKT1;2, GmHKT1;3, and GmHKT1;4) via in silico, and explored the genes structure and expression under low
potassium treatment and abiotic stresses with qRT-PCR technique. The results showed that the expression level of GmHKT1;2 was
higher than those of the other three members in the roots of soybean seedlings under low potassium stress, which was more ob-
vious in the roots of the soybean varieties with high PUE. Meanwhile, GmHKT1;2 showed high response to various abiotic
stresses (chilling, drought, high salinity, and ABA). Protein structure prediction showed that only GmHKT1;2 contains four MPM
domains and a “funnel-like” structure of four conserved amino acid residues spatially, which acted as K+/Na+ transport channel
and provided energy for transportation, together with the adjacent ATP binding domain. Analysis on gene structure indicated that
there are three exons and two introns in all four members with a significant difference in the size of exon I and intron I, resulting
in the genomic DNA (gDNA) difference in length of the different GmHKT genes. Promoter analysis revealed that upstream pro-
moter elements of soybean TRK-HKT family genes contained important cis-acting regulatory elements involved in the functional
target to seed-specific expression, and response to hormone and diverse abiotic stresses. In evolution, soybean TRK-HKT family
genes belonged to clade I with conserved Ser–Gly–Gly–Gly motif.
Keywords: Soybean; TRK-HKT family; Molecular characterization; Abiotic stress
钾元素是高等植物中最丰富的无机矿质元素之 一, 参与植物体内诸如光合作用、植株向性生长、
260 作 物 学 报 第 41卷

体内矿质元素代谢及渗透调控等生命活动过程, 影
响作物产量及品质[1]。植物体主要采用高、低两种
类型转运蛋白实现对 K+运输, 前者包括 TRK-HKT
家族蛋白、KT/HAK/KUP家族蛋白、KEA转运蛋白
及 CHX 转运蛋白(cation/H+ exchanger, CHX), 后者如
shaker类通道蛋白、双孔通道蛋白、环核苷酸门通道蛋
白(cyclic nucleotide-gated channels, CNGC)等[2-3], 其中
以植物 TRK-HKT 蛋白家族研究最为深入[4-9], 但在
大豆(Glycine max L.)中仅发现有限报道[10-11]。
利用异源表达系统及 K+运输缺陷型突变体, 先
后在植物中鉴定出许多与 K+运输有关的 TRK-HKT
家族蛋白[12]。小麦(Triticum aestivum L.) TaHKT2;1
是第一个利用此方法鉴定出的植物源 HKT蛋白, 表
现出 K+的高亲和性 , 命名为 “高亲和力 K+转运
体”(high-affinity potassium transporter, HKT) [13-14]。
然而, 植物 TRK-HKT 家族蛋白离子运输功能具有
双重性, 即低 Na+时充当 Na+和 K+协同转运体, 高
Na+时仅运输 Na+ [14-15]。早期研究认为 HKT蛋白运
输K+的能量不是来源于ATP水解[13], 但随后研究得
出相反的结论 , 且发现部分蛋白运输能量还依赖
Na+偶联产生的电化学梯度, 如 TaHKT1[14]。功能研
究发现 TRK-HKT 家族成员在 Na+-K+协同运输方式
上存在差异, 但目前有关这种转运方式差异的机制
并不明确 [16]。根据拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)
AtHKT1和水稻(Oryza sativa L.) OsHKT1蛋白结构
对比发现, 在第 1 个 P 环(PA)中存在甘氨酸(G)与丝
氨酸(S)突变, 认为这可能是导致二者转移K+效率差
异的原因[17-19]。
植物 TRK-HKT 家族基因广泛参与植物抗逆境
胁迫[20-22]。研究发现, 植物耐盐性与其芽中 Na+累积
量负相关, 特别在谷类作物如水稻、小麦中尤为明
显[23-24]。拟南芥及水稻的 TRK-HKT 家族成员对维
持细胞内 Na+及 Na+/K+动态平衡起主要作用, 调控
其耐盐性能[25-28]。OsHKT2;1功能缺失突变导致水稻
在低 K+条件下生长缓慢[28]。Chen等[10]研究发现, 外
源 NaCl 处理能诱导大豆根和叶中 GmHKT1 表达,
且过表达 GmHKT1 的转基因烟草根和芽中 Na+累积
减少而 K+含量上升, 耐盐性提高, 表明 GmHKT1具
有促进 Na+移出及协同 Na+-K+运输的双重作用。此
外, 植物体内高浓度的 Na+能抑制其对土壤中 K+的
吸收, 导致植物出现低钾症状, 严重时整个叶片坏
死脱落, 植株易倒伏[29-30]。因此, 提高植物耐盐胁迫
能力, 必须降低Na+提升K+含量, 提高K+/Na+比, 而
高亲和力的 K+转运蛋白(如 TRK-HKT 家族)在调控
植物体内 Na+/K+比方面具有明显优势[31]。
大豆属甜土作物, 对高盐等逆境胁迫敏感, 选
育耐盐大豆品种是大豆育种的一个重要方向[10]。目
前对大豆氮元素代谢研究较多, 而对钾元素研究相
对较少, 且发现大豆营养期缺钾容易出现根系老化
早衰直至死亡, 严重影响大豆产量[32]。尽管对植物
中参与 K+运输的 TRK-HKT 蛋白研究较多, 但对大
豆 TRK-HKT 家族蛋白研究较少, 仅有的几篇报道
都集中在对该家族个别成员的功能研究上[10-11], 缺
乏对大豆 TRK-HKT 家族成员系统的生物学特性分
析研究。本研究以大豆 TRK-HKT 家族为研究对象,
以 6个钾利用效率差异大豆品种为试验材料, 以期
通过对大豆 TRK-HKT 家族基因结构及逆境胁迫表
达机制分析, 获得对大豆 K+主动运输具有重要影响
的 HKT基因, 为利用转基因技术手段创制耐盐大豆
品种提供基因资源。
1 材料与方法
1.1 供试材料
根据权月伟等[33]、王伟等[34]及本实验室前期研
究结果(未发表), 选择吉林省农业科学院大豆研究
室馈赠的钾高效大豆品种冀豆 8号、中豆 32和九农
15和河北农业大学张彩英教授课题组馈赠的钾低效
大豆品种中黄 4号、中黄 13、GD8521, 用于 TRK-HKT
家族基因表达定量分析。
1.2 逆境胁迫处理
取饱满、无虫蛀和表皮无破损的大豆种子各 10
粒, 经 70%乙醇和 20%次氯酸钠溶液分别浸泡 1 min
和 15 min后, 无菌水洗 10次, 置无菌水浸润的滤纸
上, 室温暗培养至萌芽。将萌芽后的种子直接播种
于 Hoagland’s营养液(四水硝酸钙 945 mg L–1、硝酸
钾 506 mg L–1、硝酸铵 80 mg L–1、磷酸二氢钾 136 mg
L–1、硫酸镁 493 mg L–1、铁盐溶液 2.5 mL L–1、微量
元素液 5 mL L–1, pH 6.0, 其中 K+浓度约为 6 mmol
L–1)浸泡过的蛭石上 , 期间不断添加新的营养液保
持蛭石湿润状态, 27℃, 按 16 h光照及 8 h黑暗的光
周期培养至 V2期(vegetative stage 2), 进行各种胁迫
处理, 包括低钾胁迫(将Hoagland’s营养液中K+浓度
调整为 60 μmol L–1)、盐胁迫(160 mmol L–1)、ABA
(0.1 mmol L–1)、PEG-6000 (100 mmol L–1)、低温(0℃),
除低钾胁迫处理需调整 Hoagland’s溶液中 K+含量外,
其余皆直接用 Hoagland’s 溶液进行配制。处理时间
第 2期 殷桂香等: 大豆 TRK-HKT家族基因结构及逆境胁迫响应机制 261


统一为 0、4、8、16 和 24 h。根据已有文献报道,
TRK-HKT 家族基因优先在根中表达 [14-18], 故本研
究中选择各个处理时间段幼苗的根, 液氮速冻后保
存于–80℃冰箱, 用于总 RNA提取。
1.3 大豆根总 RNA提取与 cDNA第 1链合成
采用 TRNzol Kit (北京天根生物技术有限公司),
按照说明书方法从大豆根中提取总 RNA。反转录前,
用 Dnase I (Sigma D5025)处理, 清除残留的痕量基
因组 DNA。根据 PrimeScript 1st Strand cDNA Syn-
thesis Kit (TaKaRa, 大连)操作说明, 合成 cDNA 第
一链。将合成的 cDNA 按 2×、10×、50×和 100×稀
释后扩增大豆 actin11 及 TRK-HKT 家族基因, 确定
反转录 cDNA 质量及各引物的扩增特异性。反应体
系为 20 μL, 包括 1.0 μL的各种稀释倍数的 cDNA模
板、10 μmol L–1各 0.8 μL上下游引物、10.0 μL 2×PCR
mix (北京天根生物技术有限公司)、7.4 μL ddH2O。
反应程序为 95℃ 3 min; 95℃ 30 s, 58℃ 30 s, 72℃
30 s, 30个循环; 最后 72℃延伸 10 min。2.5%琼脂糖
凝胶电泳检测 PCR结果。–20℃保存 cDNA, 用于后
续的大豆 TRK-HKT家族基因定量分析。
1.4 大豆 TRK-HKT 家族基因序列检索及定量
分析
将拟南芥 AtHKT1;1 (GenBank 登录号为 NP_
567354.1) 蛋 白 序 列 在 NCBI (http://www.ncbi.
nlm.nih.gov/)非冗余蛋白序列数据库(non-redundant
protein sequences)及 Phytozome v10 (http://www.
phytozome.net/)大豆全基因组序列数据库 (G. max
Williams 82. a2. v1)中进行 BlastP检索, 得到 4个高
度 相 似 的 大 豆 基 因 , 基 因 组 识 别 号 分 别 为
Glyma01g00530、Glyma06g42340、Glyma07g15590
和 Glyma12g16040。根据检索结果, 利用 IDT-DNA
软件(https://www.idtdna.com/PrimerQuest/)设计 qRT-
PCR (quantitative Real-time PCR)引物 , 引物 P1
(5′-ATTCTTGGCTGGTTTGATAG-3′)和 P2 (5′-ATTT
CAACGGCTACCATGCTAG-3′)用于扩增 Glyma01g
00530, 扩增片段大小为 195 bp; 引物 P3 (5′-TTTCT
GCTTCCACAGTTTC-3′)和 P4 (5′-ACCACCAACAA
ACATGAGAAGG-3′)用于扩增 Glyma06g42340, 扩
增片段大小为 98 bp; 引物 P5 (5′-TCTACCCTTCCA
GCATTT-3′)和 P6 (5′-TGGTATAACGGGGGTCCTTG
G-3′)用于扩增 Glyma07g15590, 扩增片段大小为
115 bp; 引物 P7 (5′-CCTGACTCGAACAAGATTAC-
3′)和 P8 (5′-TTAATCGAGGGCTTCTTTGTGG-3′)用
于扩增 Glyma12g16040, 扩增片段大小为 102 bp。以
大豆内源 actin11 基因(基因组识别号为 Glyma18g
290800)为内标基因, 设计引物 P9 (5′-CTACGAGCA
AGAACTGGAGAC-3′)和 P10 (5′-AGAACCTCTGG
ACATCTGAAAC-3′)扩增该内标基因 , 扩增片段大
小为 117 bp。将在低钾胁迫处理 6个大豆品种各个
时间段 Glyma01g00530 的表达量或逆境胁迫处理
0 h 的 Glyma06g42340 表达量设为 1, 分析大豆
TRK-HKT家族成员基因在低钾胁迫条件下 6个大豆
品种中的相对表达量, 以及 Glyma06g42340 在 4 种
逆境胁迫条件下 6 个大豆品种中的表达趋势。利用
ABI7500 PCR 扩增仪(Applied Biosystems, USA)进
行 qRT-PCR分析, 反应体系 20 μL, 包含 1.0 μL的
cDNA模板、10 μmol L–1各 0.4 μL上下游引物、10.0
μL 2×TransStart Green qPCR Supermix UDG (北京全
式金生物技术有限公司)、0.4 μL Passive Reference
Dye II, ddH2O补足至 20 μL。反应程序为 50℃ 2 min,
95℃ 10 min; 95℃ 5 s, 60℃ 34 s, 共 45 个循环;
95℃ 15 s, 60℃ 30 s, 95℃ 15 s, 用于熔解曲线绘
制。利用 2–ΔΔCT法计算基因的相对表达量, 设每个处
理 3个重复, 采用 DPS 7.05统计分析数据。
1.5 大豆 TRK-HKT家族蛋白生化特性分析
采用 BioEdit 软件 (http://www.mbio.ncsu.edu/
bioedit/bioedit.html)手工编辑比对大豆 TRK-HKT 家
族蛋白的功能域, 再利用 WebLogo (http://weblogo.
threeplusone.com/create.cgi)分析残基保守性。蛋白质
分子量及等电点预测软件为 Compute pI/MW (http://
web.expasy.org/compute_pi/); 蛋白跨膜区域预测软
件 为 TMHMM V2.0 (http://cbs.dtu.dk/services/
TMHMM-2.0/)和 SMART (http://smart.emblheidelberg.
de/); 蛋白保守域预测软件为Meme V4.9 (http://meme.
nbcr.net/meme/cgi-bin/meme.cgi); 蛋白高级结构预
测软件为 Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/
html/page.cgi?id=index); 基因启动子元件分析软件
为 PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/
webtools/plantcare/html/)。
1.6 植物 TRK-HKT家族基因检索及命名
根据拟南芥 AtHKT1;1 蛋白序列, 采用 BlastP
方法在 NCBI 及 Phytozome V10 中检索已录入或测
序物种的 HKT编码基因序列。鉴于部分序列测序结
果的不完整及可能的编码框预测错误, 本研究对检
索到的序列再次利用 Softberry 网站的 FGENESH/
FGENESH+ (http://www.softberry.com/)对序列编码
262 作 物 学 报 第 41卷

区进行 2次预测(序列名称及登录号见附表)。另外, 1
个来源于大肠杆菌的 HKT蛋白(Escherichia coli, 缩
写为 EcTrkA)用作聚类分析的 outgroup。
鉴于 TRK-HKT 家族基因存在多拷贝现象 [19],
为避免命名上混淆, 本研究在 Damien Platten 等[35]
命名规则基础上, 根据检索到的序列实际情况, 将
TRK-HKT 家族基因命名为 xxHKT#1;#2, xx 为 HKT
所属物种的种属名缩写, #1为 HKT 基因所在进化的
一级分支, #2为 HKT 基因序列分离的时间顺序。其
中#2有 3种情况: 1)具有原始命名的, 保留原始命名,
如水稻; 2)没有原始命名但物种基因组已测序, 根据
其所在染色体的序号依次命名, 如大豆; 3)没有原始
命名也无全基因组测序结果, 参考 GenBank 录入时
的名称命名, 如小麦族。
1.7 大豆 TRK-HKT 家族基因同源比对和聚类
分析
采用在线 ClustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/
clustalw2/index.html)进行序列同源比对 , 比对结果
经手工调整后 , 利用 Mega 6.0 软件的 Neighbor-
Joining法构建系统发育树, 并经 BootStrap检验, 参
数设置为 1000个 BootStrap, 其他参数为默认。
2 结果与分析
2.1 大豆 TRK-HKT 家族成员低钾胁迫条件响
应机制
鉴于拟南芥中仅 1个 HKT编码基因, 本研究以
拟南芥的 HKT蛋白序列为种子序列, 在 NCBI非冗
余蛋白序列数据库中检索大豆已录入的 HKT 蛋白
序列 , 共得到 10 个包含全长编码区序列 , 经与
Phytozome V10数据库中大豆品种 Williams 82全基
因组序列比对发现, 仅存在 4 个 HKT 编码基因, 分
别是 Glyma01g00530、Glyma06g42340、Glyma07g
15590和 Glyma12g16040, 根据方法 1.6的命名规则,
依次命名为 GmHKT1;1、GmHKT1;2、GmHKT1;3和
GmHKT1;4。进行 qRT-PCR 分析前, 采用常规 PCR
进行引物特异性检测及反转录 cDNA模板的质控(见
附图 1), 大豆 TRK-HKT 家族 4 个基因及内标基因
actin11的 PCR扩增产物中无非特异性条带出现, 仅
目标带随着模板稀释倍数递增而产率递减, 表明设
计的 qRT-PCR引物特异性强, 反转录的 cDNA完整
性好, 能满足 qRT-PCR分析要求。
为了解析大豆 TRK-HKT 家族基因对低钾胁迫
的表达响应, 采用 qRT-PCR 技术, 选用 6 个大豆品
种(钾高效和钾低效品种各 3个), 在 60 μmol L–1 K+
条件下的大豆 TRK-HKT 家族基因表达分析表明,
除个别处理时间下个别品种相对表达量有所不同外
(如 0 h的冀豆 8号、8 h的中豆 32、16 h的中黄 4
号和中黄 13等), 4个基因在低钾胁迫条件下的总体
相对表达量趋势为 G m H K T 1 ; 2 > G m H K T 1 ; 4 >
GmHKT1;1>GmHKT1;3 (图 1), 其中, 相差最大的结
果出现在 8 h的九农 15品种中, GmHKT1;2的表达量
约为 GmHKT1;3的 3.59倍。比较 GmHKT1;2与其他
3个基因的相对表达量表明, 除低钾胁迫 8 h中黄 13
的 GmHKT1;2与其他 3个基因相对表达量差异不显
著外 , 其余均达到显著或极显著水平 , 其中, 在低
钾处理 16 h的 GD8521 (钾低效大豆品种)及 24 h的

图 1 低钾胁迫条件下不同钾利用效率大豆品种的 TRK-HKT家族基因表达谱
Fig. 1 Expression profiling of soybean TRK-HKT family genes in different soybean accessions under low potassium stress
*和**分别表示显著性水平为 0.05和 0.01。I~VI: 大豆品种中黄 4号、中黄 13、GD8521、冀豆 8号、中豆 32和九农 15。
* Significant at P<0.05; ** Significant at P<0.01. I–VI: G. max accession Zhonghuang 4, Zhonghuang 13, GD8521, Jidou 8, Zhongdou 32,
and Jiunong 15, respectively.
第 2期 殷桂香等: 大豆 TRK-HKT家族基因结构及逆境胁迫响应机制 263


中黄 13 (钾低效大豆品种 )中 , GmHKT1;2 仅与
GmHKT1;3 的相对表达量差异显著, 而在钾高效品
种的部分处理时间段中, GmHKT1;2与其他 3个基因
的相对表达量差异均极显著, 如低钾胁迫 8 h和 16 h
的中豆 32和九农 15等(图 1), 表明 GmHKT1;2可能
在大豆 K+运输中起主要作用。
2.2 逆境胁迫下大豆 GmHKT1;2的表达
在培养液中分别添加 160 mmol L–1 NaCl、0.1
mmol L–1 ABA、100 mmol L–1 PEG-6000或将植株置
于 0℃, 模拟自然条件下的逆境胁迫, GmHKT1;2表
达表明, 除低温胁迫对 GmHKT1;2 诱导表达在钾利
用效率差异品种中不明显外(图 2-D), 其余 3个胁迫
处理在钾高效品种中诱导表达水平明显高于钾低效
品种。其中, 冀豆 8 号在 NaCl 胁迫处理 8 h 时,
GmHKT1;2 相对表达量最高, 约为处理前的 6.3 倍
(图 2-A), 而在 ABA 处理中, 最高相对表达量出现
在中豆 32处理 24 h, 约为处理前的 5.8倍(图 2-B)。
在模拟旱胁迫(PEG-6000)处理中, 中豆 32和九农 15
处理 16 h 时表达量最高, 约为处理前的 6.8 倍(图
2-C), 表明这 3个处理对钾高效大豆品种的 GmHKT1;
2 的胁迫诱导明显。在 4 个处理中 , 钾低效品种的
GmHKT1;2 的表达量也受到胁迫诱导 , 但表达量
较低 , 表明钾低效品种的 GmHKT1;2 对胁迫响应
迟缓。

图 2 大豆 GmHKT1;2基因在不同品种不同胁迫条件下的表达
Fig. 2 Expression profiling of soybean GmHKT1;2 under different abiotic stresses from different soybean accessions

2.3 大豆 TRK-HKT 家族成员基因结构及功能
域
大豆 TRK-HKT 家族基因的基因组 DNA (ge-
nomic DNA, gDNA)全长分析表明 , GmHKT1;1、
GmHKT1;2、GmHKT1;3 和 GmHKT1;4 的第 1 个外
显子和内含子分别占各基因 gDNA 全长的 26.89%/
61.37%、24.08%/59.49%、30.33%/43.43%和 26.06%/
51.18% (见附表), 其中 GmHKT1;2 编码蛋白最大
(645 个氨基酸), 4 个编码蛋白的分子量介于 56.23~
73.11 kD, 等电点(pI)相近, 介于 9.09~9.23。氨基酸
序列两两比对结果表明, GmHKT1;2 和 GmHKT1;4
一致性最高(85.7%), 其次是GmHKT1;1与GmHKT1;
3 (83.3%)。
基于 in silico技术, 对大豆 TRK-HKT家族 4个
成员进行氨基酸水平的 Blosum62 比对, 发现大豆
TRK-HKT 家族成员全部具有典型的 Ser–Gly–Gly–
Gly保守motif (每个氨基酸各位于 1个 P-loop中, 图
3 箭头)。为了明晰大豆 TRK-HKT 家族蛋白其他的
功能保守域, 利用 Meme V4.9共发现 3个保守的功
能 motif (图 3 中双向箭头)。其中, motif 1 位于
F223~Y259 (氨基酸位置参考GmHKT1;1, 下同), 包
含 K+选择性运输的保守 motif中的第 2个 G, motif 2
位于 Y409~I442, 而 motif 3位于 C466~K506, 包含
HKT 蛋白 ATP 结合结构域, 序列比对发现, 3 个
264 作 物 学 报 第 41卷


图 3 大豆 TRK-HKT家族成员序列比对
Fig. 3 Sequence alignment among the members of soybean TRK-HKT family
黑色及灰色背景示完全一致和部分一致的序列; 向下箭头表示 K+选择性运输保守的氨基酸; 半圆弧表示 ATP结合位点;
下画线表示 α螺旋区, 用 H#表示; 3个 motif和用双向箭头在序列上方表示; 8个跨膜区在序列上方用中括号表示,
并用 M1/2A/B/C/D标注(参考文献[17])。
Amino acids with high and partial identities are shown in black and grey background, respectively. Downward arrows represent conserved
amino acid residues responsible for K+ transportation. ATP binding motif is shown by semicircle. α-helices are underlined sequentially and
labeled as H#. Three motifs are shown by double-sided arrows. Eight transmembrane domains are shown as M1/2A/B/C/D in brackets over the
sequences according to reference [17].

motif 的氨基酸组成相似性较高。此外 , 利用在线
WebLogo对大豆 4个功能保守氨基酸残基前后各 10
个氨基酸分析表明, 在核心功能残基上下游存在许
多保守的极性氨基酸, 如丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、蛋
氨酸(M), 以及带电荷氨基酸, 如天冬氨酸(D)、谷氨
酸(E)、天冬酰胺(N)、精氨酸(R)及组氨酸(H)(图 4)。
植物 TRK-HKT 家族蛋白由 8 个跨膜区和 4 个
P-loop 构成, 彼此相间排列(见附图 2)。为了解析大
豆 TRK-HKT 家族成员蛋白跨膜区结构 , 利用
TMHMM V2.0和 SMART进行蛋白跨膜区结构预测
表明, 除GmHKT1;2具有 8个跨膜结构域外(图 5-A),
其余 3个成员包含 9~10 个跨膜区, 其中低复杂区
(low complexity region)在 4个大豆 HKT蛋白中都存
在。利用 TMHMM V2.0对 GmHKT1;2的跨膜区的 2
次预测表明 GmHKT1;2 具有典型植物 HKT 蛋白家
族的 8个跨膜区(图 5-B)。
为了进一步解析大豆 GmHKT1;2蛋白空间构象,
利用在线 Phyre2对大豆 GmHKT1;2蛋白进行高级结
构预测。以枯草杆菌(Bacillus subtilis) Ktrab 蛋白
(protein data bank, PDB登录号为 c4j7ck)的 3D结构
为模板, 构建大豆 GmHKT1;2 蛋白 3D 模型。该模
型覆盖大豆 GmHKT1;2 总氨基酸约 60%, 模型吻合
度为 100%。利用 PDB 中其他 3D 模板进行大豆
GmHKT1;2 模型构建时, 尽管氨基酸覆盖率提高到
74%, 但模型吻合度下降为 90%, 故选择 c4j7ck 为
模板进行大豆 GmHKT1;2 同源建模(图 6)。由图 6
可知, 大豆 GmHKT1;2 蛋白结构中无 β 折叠存在,
仅有许多 α 螺旋和无规则卷曲结构组成, 这与大豆
GmHKT1;2蛋白二级结构预测结果一致(图 3)。4个
保守氨基酸残基的空间构象形成一个“漏斗样”结构
(图 6中的黑点), 充当 K+/Na+运输通道, 并紧邻 ATP
结合结构域(图 6 箭头所示, 保守残基见图 3 半圆弧
第 2期 殷桂香等: 大豆 TRK-HKT家族基因结构及逆境胁迫响应机制 265



图 4 大豆 TRK-HKT家族蛋白 4个 P-loop结构域WebLogo分析
Fig. 4 WebLogo analysis of amino acids of four P-loops in
soybean TRK-HKT family
箭头所示为保守的功能域残基; 自上而下依次为 4个功能保守
域所在的 P-loop; 字母不同高度代表氨基酸残基出现的频度差
异程度; 横纵坐标分别表示氨基酸残基数和残基频度。
Arrows represent the conserved functional motif. Four conserved
functional amino acid residues in each P-loop are shown from top to
bottom. Height of letter displays relative frequency of each amino
acid residue. Abscissa and ordinate demonstrate the number of
amino acid residues and relative frequency of each amino acid
residue, respectively.
所示), 从而方便 K+/Na+转运和供能。
2.4 大豆 TRK-HKT家族成员启动子功能元件
HKT蛋白表达调控是启动子上游的顺式作用元
件与多种反式作用因子相互作用的结果。对大豆
HKT 基因起始密码子上游 2000 bp 区段 , 利用
PlantCARE 数据库, 进行顺式作用元件预测表明这
些顺式作用元件主要与激素 /环境胁迫响应及组织
特异表达有关, 且不同的大豆 HKT 基因启动子区域
所包含的顺式作用元件有所不同, 暗示这些基因表
达具有时空差异性(表 1)。胁迫相关元件(如 ABRE、
MBS、TC-rich repeats和 5 UTR Py-rich stretch)的存
在, 表明部分大豆 HKT 基因表达受到胁迫调控。大
豆 HKT 基因启动子上游区存在组织/器官特异表达
响应元件(如 RY-element 和 Skn-1_motif), 说明这些
基因具有组织特异表达特性。这些顺式作用元件或
单个或协同发挥作用, 共同调控并实现大豆 TRK-
HKT家族基因的时空表达。
2.5 大豆 TRK-HKT家族成员系统进化
为了构建大豆 TRK-HKT 家族成员的系统发育
树, 利用拟南芥 AtHKT1;1蛋白序列, 在 NCBI非冗

图 5 大豆 TRK-HKT家族蛋白跨膜结构域分析
Fig. 5 Bioinformatic prediction on transmembrane domains of soybean TRK-HKT family
A: 大豆 TRK-HKT家族蛋白跨膜结构域; STYKc: 丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸蛋白激酶区; 短粗横线为 low complexity region; 柱形为跨膜
区; 横坐标表示氨基酸位置; B: GmHKT1;2蛋白跨膜结构域; 箭头指向第 1个 P-loop, 横纵坐标分别表示氨基酸位置和预测分值。
A: Transmembrane domains of soybean TRK-HKT family; STYKc: Ser/Thr/Tyr protein kinase domain; Short horizontal thick lines and
columns represent low complexity region and transmembrane domains, respectively; Abscissa demonstrates the position of amino acids.
B: Transmembrane domain prediction of GmHKT1;2; Arrow points to the first P-loop. Abscissa and ordinate demonstrate the position of
amino acids and score of prediction, respectively.
266 作 物 学 报 第 41卷


图 6 大豆 GmHKT1;2蛋白 3D模式图
Fig. 6 3D homologous modeling of GmHKT1;2
A: 正面图; B: 反面图。黑点为 4个保守残基; 圆球为转运的离子; 箭头所示为 ATP结合位点; α螺旋和无规则卷曲分别用黑色及灰色
表示; N和 C分别代表 GmHKT1;2的 N端和 C端。
A: front view; B: back view. Four conserved residues and transported ions are shown as dots and sphere. Arrows point to ATP binding motif.
Random curls and α-helices are shown in grey and black color in ribbon, respectively. N and C: N and C terminus of GmHKT1;2 separately.

表 1 大豆 TRK-HKT家族基因各种顺式作用元件数目
Table 1 Functional motif numbers of cis-regulatory elements identified in soybean TRK-HKT family genes
基因 Gene 功能基序
Functional motif GmHKT1;1 GmHKT1;2 GmHKT1;3 GmHKT1;4
乙烯响应元件 ERE 4
热激响应元件 HSE 2 2 1
旱胁迫响应元件 MBS 2 2
种子特异性表达元件 RY-element 1
胚乳特异表达元件 Skn-1_motif 4 1 4 2
水杨酸响应元件 TCA-element 1 1
芽特异表达及光响应元件 as-2-box 1
光周期调控元件 circadian 2 3 1
高转录活性元件 5 UTR Py-rich stretch 8 4 1
茉莉酸响应元件 CGTCA-motif 2 1 6 4
赤霉素响应元件 TATC-box 2 2 2
防御及胁迫响应元件 TC-rich repeats 1 2
增强子 TA-rich region 4
ABA响应元件 ABRE 1
ERE: ethylene-responsive element; HSE: cis-acting element involved in heat stress responsiveness; MBS: MYB binding site involved
in drought-inducibility; RY-element: cis-acting regulatory element involved in seed-specific regulation; Skn-1_motif: cis-acting regulatory
element required for endosperm expression; TCA-element: cis-acting element involved in salicylic acid responsiveness; as-2-box: involved in
shoot-specific expression and light responsiveness; circadian: cis-acting regulatory element involved in circadian control; 5 UTR Py-rich
stretch: cis-acting element conferring high transcription levels; CGTCA-motif: cis-acting regulatory element involved in the MeJA-
responsiveness; TATC-box: cis-acting element involved in gibberellin-responsiveness; TC-rich repeats: cis-acting element involved in de-
fense and stress responsiveness; TA-rich region: enhancer; ABRE: cis-acting element involved in the abscisic acid responsiveness. Arabic
numbers in table represent the number of each functional element available.

余蛋白序列数据库进行 BlastP 检索, 共得到 111 个
序列, 覆盖了 17 个物种。随后, 在 Phytozome V10
数据库中 , 利用 BlastP 检索全基因组已测序植物
HKT 蛋白序列 , 将 2 种检索结果比对 , 并通过
FGENESH/FGENESH+进行序列编码区的 2次确认。
根据序列检索结果, 发现部分物种 TRK-HKT 家族
基因存在选择性拼接现象 , 为了降低序列冗余度 ,
提高聚类分析的可靠性, 在聚类分析时仅选择最长
的序列, 最终得到 62 个 HKT蛋白序列(包括进化树
构建中 outgroup的大肠杆菌 TrkA蛋白)(见附表 1)。
对基因组已测序物种的 TRK-HKT 家族成员基因的
结构分析表明, 这些基因均包含 3 个外显子和 2 个
第 2期 殷桂香等: 大豆 TRK-HKT家族基因结构及逆境胁迫响应机制 267


内含子。对各个外显子及内含子所占基因的 gDNA
全长比例的统计分析发现, 第 1 个外显子及内含子
片段大小占基因总长度约 70% (见附表 1), 且这 2个
片段在所有检索到的植物 TRK-HKT 家族中差异显
著(P=0.032和 P=0.019)。
为了解析大豆 TRK-HKT 家族成员系统进化关
系, 对检索到的 61个植物源HKT蛋白序列进行聚类
分析 , 构建无根进化树 , 其中来自大肠杆菌的
EcTrkA 用作 outgroup (图 7)。结果表明 , 植物
TRK-HKT家族成员共形成 2个主分支, 根据其进化
顺序分为 8 个亚家族, 其中第一分支较大, 包含 45
个 HKT蛋白, 由所有的双子叶植物和部分单子叶植
物的 HKT蛋白构成, 共分为 6个亚家族(I、IV、V、
VI、VII 和 VIII), 而第二分支主要包含单子叶植物
的 16个 HKT蛋白, 组成 2个亚家族(II和 III)。从图
7 可看出, 来源于同一物种的不同 HKT 蛋白家族成
员分布在不同的分支或亚家族, 特别是单子叶植物
的 HKT蛋白, 表明这些蛋白的早期编码基因复制发
生在物种分化之前。大豆 TRK-HKT 家族成员进化
上较为保守, 主要位于第一分支的亚家族 VIII, 进
一步细分为 2 个小亚群 , 即 GmHKT1;1 和
GmHKT1;3 为一个小亚群 , 而 GmHKT1;2 和
GmHKT1;4为另一个小亚群, 2个小亚群内部可能存
在功能相关性。此外, 大豆 TRK-HKT家族基因在进
化上与 VvHKT1;1、 VvHKT1;2、 SlHKT1;1 及
StHKT1;1 进化关系较近 , 而与豆科植物苜蓿
MtHKT1;1 进化关系较远, 后者与 SlHKT1;2 进化关
系较近(亚家族 VII)。

图 7 61个来自不同植物的 TRK-HKT家族成员系统发育树
Fig. 7 Phylogenetic tree among the deduced amino acid sequences of 61 members of plant TRK-HKT family
分支节点数值表示该进化分支在 BootStrap检验后的置信度; 系统发育树有 2个分支包含 8个亚家族(I~VIII); 来自大肠杆菌的 TrkA
用作 outgroup; 圆点表示大豆 TRK-HKT家族的 4个成员。各基因命名及登录号见附表。
Numbers on the main branches indicate BootStrap percentages for 1000 replicates. Two major clades (1–2) with a black arc consisting of
eight subgroups in nodes (I–VIII) identified in the TRK-HKT family are highlighted. TrkA from E. coli was used as outgroup for phylogentic
analysis. Four members of soybean TRK-HKT family are shown by dots in node. Refer to supplemental Table for the nomenclature and
accession numbers of plant TRK-HKT family genes.
268 作 物 学 报 第 41卷

3 讨论
HKTs 蛋白属膜整合蛋白 (integral membrane
proteins, IMPs)的一种, 参与植物对各种阳离子转运,
协调植物对各种逆境胁迫的耐受性[22]。然而, 由于
植物 TRK-HKT 家族成员较多, 其参与植物对逆境
胁迫调控可能涉及一个负责的调控网络。因此, 对
植物 TRK-HKT 家族基因功能研究, 首先应对其结
构、表达和进化等方面进行深入研究。
3.1 大豆 TRK-HKT家族基因结构保守性
典型的 HKT 蛋白由 8 个跨膜区(transmembrane
domain)和 4 个 P-loop 构成, 即 4 个串联的 MPM
(transmembrane-pore-transmembrane)结构[17]。本研究
通过对大豆 TRK-HKT 家族成员蛋白跨膜区结构预
测, 发现仅 GmHKT1;2符合这一典型结构(图 5-A和
B), 表明 GmHKT1;2可能对大豆 K+转运具有更高的
亲和性。
对大豆 TRK-HKT 家族 4 个 P-loop 氨基酸组成
分析发现, 在 4个 P-loop中以极性氨基酸居多, 如 S
和 T等, 同时也发现带负电氨基酸残基的存在(如 D
及 E)。根据 Mäser等[19]利用 ConSurf软件对这些位
点的分析, 认为植物 TRK-HKT 家族蛋白 P-loop 区
极性氨基酸(如 S和 T)具有辅助阳离子运输作用, 而
紧接着第 3个 P-loop的 G下游保守的 E可能起阻止
阴离子渗入的作用。进一步对大豆 TRK-HKT 家族
第 3个 P-loop和 motif 3的氨基酸组成分析, 发现在
保守 G残基上游的第 3和第 2位为保守的带正电残
基 RH motif (图 3), 在 motif 3中有 2个保守的 GR
motif (图 3 中半圆弧所示)。Kato 等[36]及 Cao 等[37]
研究认为, 前者(即 RH motif)在离子选择性透过方
面有重要作用, 而后者(即 GR motif)则充当 ATP 结
合位点, 推测大豆 TRK-HKT家族成员可能通过这 2
个保守功能域协同作用, 参与和维持 K+的转运和能
量供应。
进化分析表明, 大豆 TRK-HKT 家族基因十分
保守, 全部 4 个成员同属第一分支的第 VIII 亚家族
(图 7), 除具有第 1 分支保守的 4 个残基外, 本研究
也发现 V65T、M73L、F217S、F/Y228L和 I/L357C 5
个位点与 2个进化分支具有较高连锁性(见附图 3虚
线箭头所示), 表明这 5 个位点可能也与 2 个进化分
支的功能连锁, 但确切功能未知, 下一步可通过定
点突变技术研究这些保守位点功能。相比较而言 ,
单子叶植物 TRK-HKT 家族基因进化较为活跃, 分
属 2个进化分支, 暗示 TRK-HKT家族基因复制发生
在单子叶和双子叶植物分化之前 , 伴随基因复制 ,
功能也发生改变。进一步分析发现, 来源于同一单
子叶植物的 HKT基因位于不同的亚群, 表现为同一
单子叶植物的 HKT彼此分离, 而与其他单子叶植物
的同类基因共为一支, 如粗山羊草的 AetHKT2;2 与
AetHKT2;1 发生进化分离, 而与 HvHKT2;2 共为一
个分支, 且 AetHKT2;2 与 AetHKT2;1 分属不同的亚
家族, 表明单子叶植物内部的基因复制也发生在单
子叶物种分化之前。Waters 等 [22]研究发现 , 尽管
OsHKT2;1具有 Ser–Gly–Gly–Gly保守的motif, 但进
化上属于第二分支, 可能存在其他保守的氨基酸残
基决定了 OsHKT2;1 对运输离子的选择性, 暗示后
续对上述 5个进化保守残基功能研究的必要性。
3.2 大豆 TRK-HKT家族基因功能多样性
植物 TRK-HKT 基因进化不同预示着功能差
别 [38]。研究表明, 第 1分支的 HKT蛋白成员具有清
除芽木质部 Na+功能[39], 而大豆 TRK-HKT家族 4个
成员全部聚类在第 1 分支, 推测其可能在减少大豆
芽木质部 Na+累积方面具有重要作用。然而, 第一分
支的 HKT 家族成员的离子转运功能可能要更复杂,
如对盐水芹(Thelungiella salsuginea) HKT的 2个成
员蛋白结构研究发现, 位于 PB 和 M2B 的 D207 和
D238对盐水芹 HKT的 K+转运能力至关重要[40], 在
拟南芥及其他植物中 , 这 2个位点均为天冬酰胺
(Asn), 而在大豆中, 则分别被 S225 及 N256 (图 3)
替换, 表明大豆 TRK-HKT 家族成员具有更加复杂
的离子转运特性。进化上, 大豆 TRK-HKT家族成员
与 SlHKT1;1进化关系较近(同属第 VIII亚家族), 而
与 SlHKT1;2关系较远(分属第 VII、VIII亚家族, 图
7)。对 SlHKT1;2 和 SlHKT1;1 离子转运功能研究发
现, SlHKT1;1 对 Na+具有更高的转运能力[41], 推测
大豆 TRK-HKT 家族蛋白对 Na+转运可能具有较高
亲和力。
真核生物基因功能的发挥通常受其上游启动子
元件调控。对大豆 TRK-HKT 家族基因启动子功能
元件预测表明, 大豆 TRK-HKT基因对各种激素、逆
境胁迫都有响应, 但针对各种响应元件, 不同的成
员中差别较大, 表现为有或无、多与少的区别, 表明
大豆 TRK-HKT 各成员对不同信号响应存在差别,
即存在功能上的趋异分化。对番茄栽培种(Solanum
lycopersicum)和野生近缘种(S. pennellii)的 HKT1;2
功能对比研究发现, SlHKT1;2具有“排 Na+”功能, 耐
盐性较强, 而 SpHKT1;2 具有“容 Na+”功能, 耐盐性
第 2期 殷桂香等: 大豆 TRK-HKT家族基因结构及逆境胁迫响应机制 269


较弱[42], 说明同一基因存在进化上的功能分化。大
豆与其野生种 HKT基因是否也存在这种现象, 值得
深入探究。尽管水稻中的 HKT基因存在 7个同源基
因(本研究中 blastP 结果是 9 个, 其中有 2 个选择性
拼接的结果), 但只有 OsHKT1;4 和 OsHKT1;5 参与
水稻的耐盐胁迫调控, 且 2个基因对清除植株不同
部位冗余 Na+具有功能分工, 即 OsHKT1;5清除根中
大部分冗余 Na+, 而 OsHKT1;4则主要清除植株地上
部分冗余的 Na+, 是对 OsHKT1;5功能的进一步完善
和补充[43]。然而大豆 TRK-HKT 家族基因是否也存
在这种功能分工, 目前还没有精确组织定位的实验
证据。研究认为, 室内试验中发现的不同 HKT蛋白
间的功能差别可能是对自然条件下各基因功能差别
的一个真实反映[44]。同时, 在对番茄 SlHKT1;1 和
SlHKT1;2 的功能研究时也发现, 启动子差异是导致
二者功能差异的原因所在[41]。因此, 可以构建由大
豆 TRK-HKT家族各基因启动子与 GUS基因的融合
载体, 实现融合基因在大豆各组织中表达, 并人工
模拟自然界的各种逆境条件处理受体材料 , 通过
GUS 基因的定性和定量表达, 解析大豆 TRK-HKT
家族各基因功能组织定位, 及对各种胁迫应激响应
机制等。
3.3 大豆 TRK-HKT 家族基因表达与逆境胁迫
相关性
作物生长过程易受各种自然条件的胁迫影响 ,
如干旱、低温、高盐等胁迫。通过实验手段, 模拟
作物在自然生长条件下经历的各种逆境胁迫, 有助
于深入理解作物是如何调节自身的生理及表型变化
以适应这些胁迫[12]。本研究利用实验室模拟自然条
件下 5 种胁迫处理, 通过 qRT-PCR 方法, 初步得出
大豆 TRK-HKT 家族基因表达受到低钾胁迫诱导,
但相比其他 3个基因, GmHKT1;2受低钾胁迫诱导明
显, 同时, 在供试的 6个大豆品种中, GmHKT1;2对
各种逆境胁迫也表现出明显的诱导表达效应, 推测
它可能是大豆各种逆境胁迫条件响应最活跃的一个
基因。尽管有研究发现另外的大豆 HKT基因对逆境
胁迫具有积极的响应表达[11], 推测可能是所选材料
的差异以及 qRT-PCR分析时所选植株的营养生长阶
段(文献[11]所用的是 V1 期, 而本研究所用的是 V2
期)的不同所致, 且此现象已在很多物种的基因表达
研究中得以证实[45-47], 同时这也是 mRNA 差别显示
技术(mRNA differential display)筛选植物目标性状
关联基因重要依据之一[48]。因此, 本研究中筛选到
的大豆逆境胁迫条件下活跃表达的GmHKT1;2基因,
有可能参与大豆逆境胁迫调控过程, 对该基因的深
入研究将有助于进一步揭示大豆耐逆境胁迫分子机
制, 为大豆耐逆境胁迫分子育种提供新的基因资源。
4 结论
根据 NCBI及 Phytozome v10数据库, 筛选到 4
个 大 豆 TRK-HKT 家 族 基 因 , 分 别 命 名 为
GmHKT1;1、GmHKT1;2、GmHKT1;3和 GmHKT1;4。
该家族基因受低钾胁迫诱导表达, 其中 GmHKT1;2
对逆境胁迫如 NaCl、ABA和 PEG-6000表达响应明
显。GmHKT1;2蛋白存在 4个串联的 MPM结构和 3
个 motif, 每个 P-loop中各包括一个保守的功能氨基
酸残基, 且 4个保守的残基形成“漏斗样”结构, 并毗
邻 ATP结合结构域, 共同促进 K+/Na+转运。该家族
各基因间内含子及外显子大小差异较大, 从而引起
各基因 gDNA 长度不同。该家族成员包含参与组织
表达定位和各种应激反应的重要顺式作用元件。该
家族基因在进化上十分保守, 主要位于第一进化分
支第 VIII 亚家族, 除 4 个保守的功能残基外, 还具
有 5个保守的、与该进化分支密切相关的位点。
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272 作 物 学 报 第 41卷


第 2期 殷桂香等: 大豆 TRK-HKT家族基因结构及逆境胁迫响应机制 273



274 作 物 学 报 第 41卷


第 2期 殷桂香等: 大豆 TRK-HKT家族基因结构及逆境胁迫响应机制 275



附图 1 大豆 TRK-HKT家族基因 qRT-PCR引物特异性检测及合成的 cDNA质控分析
Supplemental fig. 1 Quality check for qRT-PCR primer specificity in soybean TRK-HKT family genes and quality control for
transcripted cDNA
M: DNA marker I (北京天根生物技术有限公司); 用于每个基因扩增的模板 cDNA稀释倍数依次为: 2×、10×、50×、100× (从左至右)。
M: DNA marker I (Beijing Tiangen Co. Ltd.); Diluted cDNAs for each gene amplification are 2×, 10×, 50×, and 100× shown from left to right.

附图 2 典型的 HKT蛋白 MPM(transmembrane-pore-transmembrane)结构[17]
Supplemental fig. 2 Schematic of classic MPM (transmembrane-pore-transmembrane) domain of HKT proteins[17]
PA/B/C/D表示 4个 P-loop; M1/2A/B/C/D表示 8个跨膜区。N和 C表示蛋白的 N和 C端。
PA/B/C/D represent four P-loop; M1/2A/B/C/D denote eight transmembrane domains. N and C: N and C terminus of HKT proteins separately.

附图 3 植物 TRK-HKT家族蛋白 P-loop结构比对分析
Supplemental fig. 3 Sequence alignment of P-loop of plant TRK-HKT family proteins
PA、PB、PC和 PD表示 4个 P-loop。实线箭头表示与 2个分支密切相关的氨基酸残基, 虚线箭头表示与 2个分支可能密切相关的保守
残基。*表示完全一致的氨基酸, : 表示高度相似的氨基酸, ·表示部分相似的氨基酸。横线为 2个分支的分界线。大豆 TRK-HKT家族
成员用粗的进化分支表示。
PA, PB, PC, and PD represent 4 P-loops. Solid and dotted arrows display confirmed and putative amino acids relevant to functional difference in
evolution, respectively. *, :, and . denote those amino acid residues with high identity, high similarity, and partial similarity separately. The
two clades were separated by a horizontal line. The bold braches represent the members of soybean TRK-HKT family.