全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014, 40(12): 21182127 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由四川省科技支撑计划项目(2014NZ0105)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 唐茜, E-mail: tangqi2008@126.com
第一作者联系方式: E-mail: liucell@163.com
Received(收稿日期): 2014-04-17; Accepted(接受日期): 2014-09-16; Published online(网络出版日期): 2014-10-08.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20141008.0955.008.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2014.02118
古蔺牛皮茶种质资源遗传多态性
刘绍杰 1,2 迟 琳 2 谢文钢 1 韩 楠 1 陈应会 2 何 鑫 2 唐 茜 1,*
1四川农业大学园艺学院, 四川雅安 625014; 2重庆市经贸中等专业学校农林水利系, 重庆 402100
摘 要: 古蔺牛皮茶是四川省特有的茶树种质资源, 原产于四川省泸州市古蔺县古蔺镇枣林村椒子沟。为了更好地
保护和利用珍稀的茶树种质资源, 在椒子沟山区选取 7个居群共 76株典型的古蔺牛皮茶树, 采用实地调查记录、生
化成分及 ISSR分子标记检测等方法, 分析该种质资源的形态学特征、品质生化成分及遗传多态性。结果表明: (1)古
蔺牛皮茶树型为灌木或小乔木; 成熟叶片为绿色或深绿色, 主要为中叶, 叶形为椭圆或长椭圆; 新梢芽叶玉白、黄
绿、绿色或紫绿色。表明古蔺牛皮茶居群间表型特征多样化。(2)在 7个居群中鉴定出高茶多酚(春梢>27%, 夏梢>31%)
和儿茶素(春梢>150 mg g–1, 夏梢>190 mg g–1)的居群 2个, 游离氨基酸较高( >4.5%)的居群 2个; 7个居群的酚氨比值
在 3.84~16.95之间。表明古蔺牛皮茶在茶树育种和茶叶加工等方面具有较高的利用价值。(3) 15条 ISSR引物共扩增
出 135条谱带, 其中 122条为多态性条带, 多态性位点百分比为 90.4%。供试材料间的平均 Nei’s基因多态性指数(H)
和 Shannon’s信息指数(I)分别为 0.254和 0.392, 表明材料间的遗传多态性较低。
关键词: 古蔺牛皮茶; 种质资源; 遗传多态性; ISSR
Genetic Diversity of Gulin-niupicha [Camellia sinensis (L.) O. Kuntze] Germ-
plasm Resources
LIU Shao-Jie1,2, CHI Lin2, XIE Wen-Gang1, HAN Nan1, CHEN Ying-Hui2, HE Xin2, and TANG Qian1,*
1College of Horticulture, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China; 2Department of Agriculture, Forestry and Water Conservancy,
Chongqing Economic and Trade Vocational School, Chongqing 402100, China
Abstract: Gulin-niupicha (Camellia sinensis) is a tea landrace population specifically grown in Jiaozigou, Gulin County, Sichuan
Province, China. To protect and utilize Gulin-niupicha resources effectively, we investigated the morphologic characteristics, bio-
chemical components, and genetic diversity based on inter-simple sequence repeat (ISSR) markers by sampling 76 individuals
from seven populations of Gulin-niupicha germplasm. The results showed that: (1) there were various biological characteristics
among the seven populations. Importantly, a majority of Gulin-niupicha were shrubs or semi-arbor. Their mature leaves were me-
dium in size, elliptic or oblong in shape, and in green or dark green color; while the young shoots showed more colors varying
form whitish, yellow green, green or purple green. (2) In the seven populations, two had high contents of free amino acids (>4.5%)
and two had both high contents of tea polyphenols (>27% in spring shoots and >31% in summer shoots) and catechins (>150 mg
g–1 in spring shoots and >190 mg g–1 in summer shoots). The ratio of polyphenols-to-free amino acids ranged from 3.84 to 16.95
in the seven populations. The results of biochemical component measurements indicated that the Gulin-niupicha germplasm re-
sources are of great value in tea tree breeding and tea processing. (3) A total of 135 fragments were amplified in the 76 accessions
using 15 pairs of ISSR primers, in which 90.4% (122/135) were polymorphic bands. The genetic diversity of the Gulin-niupicha
germplasm revealed by ISSR markers was low, with the Nei’s gene diversity index of 0.254 and Shannon’s information index of
0.392.
Keywords: Gulin-niupicha (Camellia sinensis L.); Germplasm resources; Genetic diversity; ISSR
种质资源是在漫长的历史过程中, 由自然演化
和人工选择形成的一种重要的自然资源。它蕴藏着
各种性状的遗传基因, 是选育新品种和发展农业生
产的物质基础, 也是进行生物学研究的重要材料[1]。
第 12期 刘绍杰等: 古蔺牛皮茶种质资源遗传多态性 2119
我国西南地区的云贵川一带是茶树的发源地之一 ,
拥有丰富的野生、半野生和栽培的茶树种质资源[2]。
古蔺牛皮茶是四川省的一个重要地方茶树品种资源,
为有性系品种, 主要分布在古蔺县古蔺镇枣林村的
椒子沟, 1985年该品种被认定为四川省省级地方品
种。古蔺牛皮茶生长和栽培区域仅限于椒子沟及周
围的山区和丘陵地区, 其性状、品质特殊, 有独特的
农艺价值。目前有关古蔺牛皮茶的研究较少[3], 未见
对古蔺牛皮茶系统研究的报道; 同时, 该品种资源
也未得到良好的利用和推广, 加上该地区连年来干
旱少雨的气候条件和人为破坏, 导致古蔺牛皮茶群
体的生长区域不断缩小, 种质资源流失, 所以应对
古蔺牛皮茶种质资源的性状进行系统的鉴定和评价,
以加强对该资源的保护和利用。
本文通过调查古蔺牛皮茶群体的分布情况, 初
步分析了不同居群茶树的形态学特征、品质生化成
分及遗传多态性 , 旨在探究古蔺牛皮茶的资源现
状、农艺价值和遗传特征, 为开展古蔺牛皮茶种质
资源的收集、保存、评价和利用以及特异资源的发
掘和新品种的选育奠定基础。
1 材料与方法
1.1 茶树生长区域自然概况
古蔺县地处四川盆地南缘向贵州高原过度地
带。其四季分明、雨热同季、夏季炎热、冬无严寒,
气温差异大, 无霜期长, 年降雨量偏少, 湿度适中,
日照较充足, 常年多夏伏旱, 具有四川盆地南部高
温和贵州高原乍寒乍暖的气候特点。古蔺牛皮茶集
中分布于该县古蔺镇枣林村的椒子沟 (27°58′33″~
27°59′30″N, 105°46′39″~105°47′33″E, 海拔 900~1100 m
的山林中), 距离古蔺县城 5 km, 分布区域约 20 km2,
海拔 800~1200 m。茶树多为野生、半野生状态, 也
有少量人工栽培的茶树。
1.2 供试材料
从椒子沟集中分布的野生、半野生古蔺牛皮茶群
体中, 选定 7个数量较多、外部形态特征具有代表性
的居群共计 76株(表 1), 观测并记录其地理位置。以
当地栽培的四川中小叶群体品种为对照组(CK)。
表 1 古蔺牛皮茶种质资源来源情况
Table 1 Origin and sample number of Gulin-niupicha germplasm resources
群体
Population
海拔
Altitude (m)
纬度
Latitude
经度
Longitude
数量
Sample number
编号
Code
A 929 27°59′30″ 105°47′02″ 10 N1–N10
B 1100 27°59′21″ 105°47′24″ 8 N11–N18
C 1085 27°58′58″ 105°47′12″ 15 N19–N33
D 1181 27°58′42″ 105°46′48″ 11 N34–N44
E 1095 27°58′58″ 105°46′39″ 13 N45–N57
F 1150 27°58′33″ 105°47′16″ 10 N58–N67
G 1045 27°58′43″ 105°47′33″ 9 N68–N76
对照 CK 934 27°58′39″ 105°47′13″ 10 S1–S10
CK为当地栽培的四川中小叶群体品体。
CK are population of local small-medium sized leaf varieties cultivated in Sichuan Province.
1.3 形态学特征观察
于 2012年春季驻点观测, 根据 NY/T 1312-2007
农作物种质资源鉴定技术规程(茶树)[4]的方法 , 观
测古蔺牛皮茶树体、芽叶及成熟叶片的性状及特征,
并按相应方法和要求[1]记录于茶树种质资源数据采
集表。为方便后期的统计分析, 参照沈程文[5]的方法
量化处理形态学特征的质量指标(表 2)。
1.4 品质生化成分测定
于 2012 年春、夏两季及 2013 年春季采摘茶树
的标准一芽二叶制作生化样, 根据 NY/T 1312-2007
农作物种质资源鉴定技术规程(茶树)[4]制定的方法,
测定古蔺牛皮茶的品质生化成分, 测定指标包括茶
多酚[7]、游离氨基酸[8]和咖啡碱[9]。采用高效液相色
谱法(HPLC)测定儿茶素和茶氨酸[7]。
1.5 ISSR分析
于2012年春季取样 , 选取茶树新梢一芽一叶 ,
迅速用液氮处理, 并将其保存在–80℃冰箱中备用。
参照刘本英等[10]的方法提取茶树基因组 DNA。
参照刘本英等[10]的 ISSR反应体系, 20 μL反应
体系中含模板 DNA 30 ng, 10×缓冲液, Mg2+ 2.0
mmol L–1, 引物 0.2 μmol L–1, dNTPs 0.4 mmol L–1,
Taq DNA 聚合酶 1.5 U。采用美国百乐公司生产的
2120 作 物 学 报 第 40卷
表 2 古蔺牛皮茶种质资源表型性状编码
Table 2 Phenotypic traits and their coding for Gulin-niupicha germplasm resources
表型性状
Phenotypic trait
编码处理
Coding
树型 Tree type 1=灌木 Shrub; 2=小乔木 Semi-arbor; 3=乔木 Arbor
树姿 Tree posture 1=直立 Erect; 2=半开张 Semi-erect; 3=开张 Horizontal spread
芽叶色泽 Young shoot color 1=玉白色 Whitish; 2=黄绿色 Yellow green; 3=绿色 Green; 4=紫绿色 Purple green
芽叶茸毛 Young shoot pubescence 1=无 Absent; 2=少量 Sparse; 3=中等 Medium; 4=多 Dense; 5=特多 Extremely dense
叶片大小 Leaf size 1=小叶 Small; 2=中叶 Medium; 3=大叶 Large; 4=特大叶 Extremely large
形状 Leaf shape 1=椭圆形 Elliptic; 2=长椭圆形 Oblong; 3=披针形 Lanceolate
叶色 Leaf color 1=深绿色 Dark green; 2=绿色 Green; 3=黄绿色 Yellow green
MyCycler Tm Thermal型 PCR仪扩增 DNA, 扩增程
序为 94℃预变性 5 min; 94℃变性 1 min, 48~62℃退
火 30 s, 72℃延伸 2 min, 35 次循环; 72℃再延伸
10 min, 12℃保存。扩增产物在 1×TBE缓冲液中, 用
2%的琼脂糖凝胶电泳检测, 电压设定为 90 V, 电泳
3 h。经 EB溶液染色后, 用 SYNGENE (德国)凝胶成
像系统拍照记录。
从加拿大哥伦比亚大学 (University of British
Columbia Biotechnology, UBS)报道的 100条植物通
用 ISSR 引物[11]中挑选 72 条, 委托北京华大基因有
限公司合成。参考引物的 Tm值, 采用梯度 PCR确定
退火温度。以古蔺牛皮茶 N1为模板, 在 48~62℃间
设置 0.5℃为一个温度梯度进行扩增, 扩增产物经
1.5%琼脂糖凝胶电泳检测, 以扩增带型清楚杂带比
较少的温度作为该引物的退火温度。选择能扩增出
目的条带、多态性高、重复性好的引物作为资源扩
增的核心引物。
将核心引物的扩增结果中清晰的条带赋值为 1,
同一位置无带或难以分辨的弱带赋值为 0, 建立原
始数据矩阵。在同一扩增位点, 只要有至少一个材
料在该扩增位点计数为“0”, 则该扩增位点为多态性
条带, 每条多态性带可视为一个等位基因。
1.6 统计分析
用 SPSS Version19.0 软件统计分析形态学原始
数据, 利用 Duncan’s 多重比较法进行差异显著性检
验。参照罗晓莹等[12]的方法, 利用 POPGEN Version
1.32软件分析 ISSR标记试验数据。多态位点百分率
(PPL)、Nei’s基因多态性指数(H)、Shannon’s多态性
信息指数 (I)、各居群内基因遗传分化指数 (Gst)
(Gst=1–Hs/Ht)及居群内的遗传距离和相似系数等参
数均由 POPGEN Version 1.32软件获得。居群每代迁
移数 Nm=(1–Fst)/4Fst[13]。将 POPGEN Version 1.32软
件得出的居群遗传相似系数输入 NTsys 2.10e 软件,
得到居群的亲缘关系聚类图, 并测试形态学特征矩
阵和 ISSR分子标记数据矩阵的 Mantel相关性。
2 结果与分析
2.1 茶树居群的形态学性状
7 个供试的古蔺牛皮茶居群中, 树型大部分为灌
木, 其中居群 D和居群 G全部为灌木型, 而其他 5个
居群均含有小乔木或乔木型。每个居群的平均树高在
180.8~382.1 cm 之间, 均比四川中小叶群体茶树(平
均 172.4 cm)高。其中, 居群 B最高,为 382.0 cm; 居
群 D 最矮, 为 180.0 cm。古蔺牛皮茶居群的成熟叶
片特征呈多样化 ,叶片大小指数平均为 1.54 (居群
E)~2.50 (居群 A), 大部分为 2.0~2.5, 多为中叶种,
群体 E 的叶片大小指数平均为 1.54, 含有部分小叶
种茶树。叶形指数平均为 1.18~1.40, 表明多数茶树
的成熟叶片呈椭圆形,也有部分呈长椭圆形。其中，
居群 A、G 的叶形指数分别为 1.40、1.33, 含有较多
的长椭圆叶形的茶树, 还含有少量披针叶形的茶树。
叶色指标为 1.60~2.09, 多数茶树叶片呈绿色, 少部
分呈深绿色, 黄绿色的很少。各居群的芽叶性状差异
也很大, 芽叶色泽从玉白色到紫绿色不等, 平均芽色
指标在 2.0~3.0之间, 其中, 居群A最低(2.1), 颜色相
对偏浅, 而居群 D (2.9)最高, 颜色相对较深。
2.2 品质生化成分分析
2.2.1 2012 年春夏梢 茶树采收的对象是新梢,
因此新梢中主要生化品质成分的含量和配比决定茶
叶的先天品质。由表 4 可见, 7 个古蔺牛皮茶居群新
梢的茶多酚含量 , 春梢为 22.57%~30.17%, 夏梢为
26.82%~36.57%。其中居群 B (春梢为 30.17%, 夏梢
为 36.57%)、F (春梢为 28.97%, 夏梢为 33.45%)和 A
(春梢为 27.93%, 夏梢为 31.51%)春、夏梢的含量均显
著高于 CK (春梢为 25.60%, 夏梢为 29.42%), 居群 D
春、夏梢均最低(春梢为 22.57%, 夏梢为 26.82%), 且
第 12期 刘绍杰等: 古蔺牛皮茶种质资源遗传多态性 2121
显著低于 CK。儿茶素含量, 春梢为 126.52~157.15 mg
g–1, 夏梢为 135.27~194.60 mg g–1。其中居群 A (春梢
为 157.15 mg g–1, 夏梢为 194.60 mg g–1)、B (春梢为
155.19 mg g–1, 夏梢为 191.69 mg g–1)春、夏梢的含量
均显著高于 CK (148.07 mg g–1、184.09 mg g–1), 而居
群 C、F、G 和 D 的春、夏梢含量则显著低于 CK。
游离氨基酸含量春梢为 2.08%~4.84%, 夏梢为 1.86%~
3.97%, 除居群 B 和 E 显著低于 CK (春梢为 2.64%,
夏梢为 2.33%)外, 其余居群春、夏梢均高于 CK。其
中居群 D 春、夏梢均最高(春梢为 4.84%, 夏梢为
3.97%), 居群 C (春梢为 4.63%, 夏梢为 3.79%)次之。
咖啡碱含量春梢为 3.55%~4.81%, 夏梢为 3.32%~
5.22%, 除居群 D 和 E外, 其他 5 个居群春梢和夏梢
的含量均高于 CK。酚氨比春梢为 4.66~12.66, 夏梢
为 6.76~16.95, 其中居群 E 春、夏梢均最高, 居群 B
次之, 均显著高于 CK, 居群 D最低。
表 3 古蔺牛皮茶居群间 8个生物学表型性状统计分析
Table 3 Statistical analysis of eight phenotypic traits among different Gulin-niupicha populations
居群
Population
树型
Tree type
树姿
Tree posture
树高
Tree height (cm)
叶片大小
Leaf size
叶形
Leaf shape
叶色
Leaf color
芽颜色泽
Bud color
芽叶茸毛
Bud hair
A 1.20±0.42 a 1.20±0.42 a 198.35±90.90 a 2.50±0.53 cd 1.40±0.70 b 1.60±0.52 a 2.10±0.32 bc 2.40±1.26 a
B 1.38±0.52 a 2.00±0.76 b 382.11±127.01 d 2.38±0.52 cd 1.25±0.46 b 1.75±0.71 ab 2.63±0.74 c 2.88±0.64 a
C 1.13±0.35 a 1.80±0.68 ab 308.72±84.61 cd 1.93±0.59 abc 1.33±0.49 b 1.87±0.35 ab 2.47±0.52 c 2.47±1.13 a
D 1.00±0.00 a 1.55±0.69 ab 190.74±69.92 a 1.82±0.60 ab 1.18±0.40 b 2.09±0.30 b 2.91±0.83 d 2.82±0.98 a
E 1.15±0.55 a 1.85±0.72 ab 180.81±80.24 a 1.54±0.52 a 1.38±0.51 b 1.85±0.55 ab 2.38±0.51 bc 3.08±0.86 a
F 1.20±0.42 a 1.80±0.63 ab 213.50±107.82 ab 2.10±0.57 bcd 1.30±0.48 b 1.80±0.63 ab 2.50±0.85 c 2.30±0.48 a
G 1.00±0 a 1.56±0.73 ab 279.61±79.36 bc 2.00±0 abc 1.33±0.71 b 2.00±0 ab 2.33±0.71 bc 2.22±0.44 a
CK 1.00±0 b 2.00±0 b 172.42±36.63 ab 2.14±0.21 bcd 1.00±0 a 3.00±0 d 1.30±0.15 a 3.00±0 a
同列标以不同小写字母的值在处理间差异在 0.05的水平显著。
Values followed by different letters are significantly different at 0.05 probability level.
表 4 2012年古蔺牛皮茶群体春、夏梢主要生化成分
Table 4 Biochemical composition of Gulin-niupicha in spring and summer of 2012
居群
Population
季节
Season
茶多酚
Polyphenols
(%)
儿茶素
Total amount of catechin
(mg g–1)
游离氨基酸
Free amino acid
(%)
咖啡碱
Caffeine
(%)
酚氨比
TP/AA
春 Spring 27.93±0.52 c 157.15±4.12 a 3.88±0.08 c 3.99±0.08 c 7.20±0.24 e A
夏 Summer 31.51±0.87 c 194.60±8.52 a 3.62±0.07 c 4.86±0.02 c 8.70±0.30 d
春 Spring 30.17±0.62 a 155.19±3.79 a 2.48±0.04 h 4.81±0.11 a 12.17±0.07 b B
夏 Summer 36.57±0.57 a 191.69±1.80 a 2.16±0.06 g 5.22±0.04 a 16.93±0.65 a
春 Spring 25.12±0.41 ef 138.35±1.96 c 4.63±0.10 b 4.79±0.09 a 5.42±0.25 f C
夏 Summer 28.10±0.61 de 164.53±2.06 cd 3.79±0.07 b 4.51±0.02 d 7.41±0.03 e
春 Spring 22.57±0.57 g 128.70±3.99 de 4.84±0.03 a 3.32±0.05 f 4.66±0.11 g D
夏 Summer 26.82±1.52 e 135.27±1.12 f 3.97±0.07 a 4.03±0.05 g 6.76±0.33 e
春 Spring 26.34±0.39 d 131.23±3.00 d 2.08±0.03 i 3.55±0.07 e 12.66±0.22 a E
夏 Summer 31.52±1.44 c 178.26±4.77 b 1.86±0.03 h 3.83±0.02 h 16.95±0.75 a
春 Spring 28.97±0.21 b 126.52±4.03 de 3.56±0.05 d 4.28±0.05 b 8.14±0.05 d F
夏 Summer 33.45±1.30 b 158.79±4.24 d 3.13±0.11 d 4.96±0.05 b 10.69±0.81 c
春 Spring 24.38±0.22 f 139.22±2.64 c 2.94±0.08 f 4.03±0.06 c 8.29±0.15 d G
夏 Summer 28.79±1.37 d 171.03±2.42 c 2.61±0.06 e 4.56±0.06 d 11.03±0.64 c
春 Spring 25.60±0.37 de 148.07±2.51 b 2.64±0.03 g 3.77±0.08 d 9.70±0.17 c CK
夏 Summer 29.42±0.51 d 184.09±3.83 b 2.33±0.07 f 4.12±0.02 f 12.63±0.44 b
同列标以不同小写字母的值在处理间差异在 0.05的水平显著。
Values followed by different letters are significantly different at 0.05 probability level. AA: free amino acid; TP: tea polyphenols.
2122 作 物 学 报 第 40卷
2.2.2 2013 年春梢主要生化成分 不同居群春
梢的主要生化品质成分的含量也有较明显的差异
(表 5)。茶多酚含量为 19.04%~29.79%, 咖啡碱含量
3.36%~4.28%, 游离氨基酸总量 2.27%~4.96%, 儿茶
素总量为 104.73~175.01 mg g–1, 酚氨比为 3.84~
12.38。茶氨酸是茶叶氨基酸组分中最重要且含量最
高的氨基酸, 又是茶叶中的特征氨基酸, 其含量为
10.98~24.13 mg g–1, 多数居群间与对照也有一定差
异, 居群 D 比 E 和 CK 分别高 119.76%、80.21%。
与 2012年的测试结果相比, 茶多酚含量略降低, 咖
啡碱含量呈现一定差异, 游离氨基酸含量均出现不
同程度上升, 但居群 D和 C仍最高, 分别为 4.96%和
4.78%。表现出古蔺牛皮茶资源生化成分的多样性。
2.2.3 2013 年春梢儿茶素 茶叶中的儿茶素是
茶叶中多酚类物质的主体成分, 也是具有保健功效
的生理活性物质。儿茶素主要含 8 种组分物质, 从
表 6可知。8种儿茶素组分的含量各居群间与对照均
有较明显的差异, 其中最具保健功效的酯型儿茶素
(EGCG)的含量为 45.75~82.80 mg g–1, 居群 B、F、A
的含量均显著高于CK, 其余4个居群则显著低于CK。
表 5 2013年古蔺牛皮茶群体春梢主要生化成分
Table 5 Biochemical composition of Gulin-niupicha in spring of 2013
居群
Population
茶多酚
Polyphenols
(%)
游离氨基酸总量
Free amino acid
(%)
酚/氨
TP/AA
儿茶素总量
Total amount of
catechin
茶氨酸
Theanine
(mg g–1)
咖啡碱
Caffeine
(%)
A 29.79±0.29 a 4.17±0.08 b 7.62±0.09 e 175.01±0.95 a 17.48±0.80 c 3.78±0.04 c
B 29.56±0.63 a 2.55±0.02 e 12.38±0.17 a 167.80±4.60 b 12.34±0.25 f 3.94±0.07 b
C 25.19±0.19 c 4.78±0.04 a 5.27±0.03 f 140.37±3.30 c 20.51±0.66 b 4.28±0.02 a
D 19.04±0.42 f 4.96±0.11 a 3.84±0.02 h 104.73±3.34 g 24.13±0.34 a 3.58±0.07 d
E 24.11±0.13 d 2.27±0.02 e 10.64±0.08 b 121.76±2.80 e 10.98±0.55 g 3.36±0.04 f
F 26.51±0.45 b 3.43±0.08 c 7.72±0.26 d 139.83±4.04 c 15.49±0.32 d 3.62±0.06 d
G 23.31±0.43 e 3.37±0.08 c 6.92±0.22 e 131.73±1.23 d 16.26±0.47 d 3.57±0.07 de
CK 27.03±0.38 b 2.99±0.07 d 9.02±0.23 c 162.38±5.13 b 13.39±0.57 e 3.48±0.04 e
同列标以不同小写字母的值在处理间差异在 0.05的水平显著。
Values followed by different letters are significantly different at 0.05 probability level. AA: free amino acid; TP: tea polyphenols.
表 6 不同居群古蔺牛皮茶春梢儿茶素组分分析(2013年)
Table 6 Analysis of catechin components about the tea plants in spring of 2013
居群
Population
表没食子儿茶素
EGC
(mg g–1)
儿茶素
C
(mg g–1)
表儿茶素
EC
(m g g–1)
表没食子儿茶
素没食子酸酯
EGCG
(mg g–1)
没食子儿茶素
没食子酸酯
GCG
(mg g–1)
表儿茶素没
食子酸酯
ECG
(mg g–1)
儿茶素总量
Total amount catechin
(mg g–1)
A 16.23±0.05 a 4.31±0.16 a 8.18±0.10 a 69.54±0.54 c 36.22±0.28 a 20.20±0.14 d 175.01±0.95 a
B 11.74±0.04 c 2.29±0.10 e 6.12±0.05 c 82.80±1.05 a 27.08±0.11 e 28.01±0.12 a 167.80±4.60 b
C 10.85±0.12 d 2.54±0.06 d 5.25±0.04 f 63.07±0.33 e 27.64±0.07 d 19.89±0.14 e 140.37±3.30 c
D 6.71±0.04 f 1.60±0.11 g 5.24±0.03 f 45.75±0.06 h 18.27±0.07 i 18.36±0.09 g 104.73±3.34 g
E 8.22±0.08 e 4.11±0.08 b 4.97±0.06 h 50.13±0.38 g 24.05±0.20 g 20.82±0.08 c 121.76±2.80 e
F 10.70±1.50 d 1.93±0.04 f 5.44±0.06 e 74.75±0.18 b 22.94±0.13 h 16.30±0.03 h 139.83±4.04 c
G 11.04±0.18 cd 1.92±0.06 f 5.62±0.08 d 60.98±0.16 f 29.34±0.04 c 14.29±0.15 i 131.73±1.23 d
CK 14.24±0.03 b 2.24±0.04 e 7.10±0.04 b 67.72±0.29 d 31.84±0.19 b 21.46±0.15 b 162.38±5.13 b
同列标以不同小写字母的值在处理间差异在 0.05的水平显著。
Values followed by different letters are significantly different at 0.05 probability level. EGC: epigallocatechin; C: catechin; EC: epi-
catechin; EGCG: epigallocatechin gallate; GCG: gallocatechin gallate; ECG: epicatechin gallate.
2.3.2 古蔺牛皮茶居群遗传多态性和遗传结构
从表 8 可知, 古蔺牛皮茶 7 个居群的平均多态
性为 64.66%, Nei’s 基因多态性 (H)指标为 0.254,
Shannon’s遗传信息指数(I)为 0.392。各居群内, Nei’s
基因多态性(H)系数平均为 0.203, Shannon’s 遗传信
息指数(I)平均为 0.307。在 7个居群中, 居群 C的遗
传多态性最高, H值为 0.218, I值为 0.333; 而居群 B
的遗传多态性最低, H值为 0.186, I值为 0.163。从遗
传结构来看, 古蔺牛皮茶居群的基因遗传分化指数
(Gst)为 0.198, 表明有 19.8%的遗传变异存在于 7 个
居群间, 80.2%的变异存在于居群内; 也说明古蔺牛
皮茶居群内遗传变异较高 , 居群间的遗传变异较
低。基于居群间遗传分化系数计算的每代迁移数(即
基因流 Nm)为 2.022。
第 12期 刘绍杰等: 古蔺牛皮茶种质资源遗传多态性 2123
表 7 15对 ISSR引物对 76株古蔺牛皮茶扩增的多态性
Table 7 Polymorphism detected with 15 ISSR primers in 76 Gulin-niupicha individuals
引物
Primer
引物序列
Primer sequence
扩增条带
Total bands
多态性条带
Polymorphic bands
多态性百分比
Percentage
(%)
退火温度
Annealing temp.
(℃)
产物大小
Product size
(bp)
R1 (AG)8YA 12 11 91.7 56.5 400–1800
R2 (CTC)6 8 6 75.0 57.5 300–3000
R13 (GGAGA)3 8 7 87.5 49.0 450–1800
R4 (GACA)4T 12 12 100.0 51.5 250–3000
R5 (CTGA)4G 10 8 80.0 50.0 300–3000
R6 (GA)8CTT 10 9 90.0 58.0 200–2000
R7 (CTGA)4 10 10 100.0 54.0 300–3000
R8 (GGGTG)3 8 7 87.5 59.5 300–1500
R9 (AG)8YC 11 11 100.0 54.0 220–4000
R10 (CT)8RC 6 5 83.3 54.5 250–2800
R11 (GA)8YC 11 9 81.8 51.5 200–2000
R12 DBD(AC)7 6 5 83.3 51.5 200–1600
R13 (TC)8AGT 6 6 100.0 51.5 200–1500
R14 (AG)8CTT 8 7 87.5 57.5 200–3000
R15 (AG)8CTA 9 9 100.0 57.5 200–2500
总计 Mean 135 122 90.4
平均 Total 9 8.1 90.4
表 8 不同古蔺牛皮茶群体中的 ISSR遗传多态性
Table 8 Genetic diversity of Gulin-niupicha distributed among different populations detected by ISSR
群体
Population
Nei’s多态性
指数 H
Shannon’s
指数 I
遗传分化
指数 Gst
每代迁移数
Nm
等位基因数
Na
有效等位
基因数 Ne
多态位点数
NPL
多态位点比率
PPL (%)
A 0.200 0.307 1.644 1.334 87 64.44
B 0.186 0.263 1.570 1.301 77 57.04
C 0.218 0.333 1.689 1.365 93 68.89
D 0.202 0.314 0.307 1.323 95 70.37
E 0.212 0.323 1.674 1.356 91 67.41
F 0.214 0.326 1.682 1.356 92 68.15
G 0.187 0.282 1.563 1.316 76 56.30
平均 Mean 0.203 0.307 1.447 1.334 64.66
总计 Total 0.254 0.392 0.198 2.022 1.867 1.417 64.66
H: Nei’s gene diversity; I: Shannon’s information index; Gst: coefficient of gene differentiation; Nm: estimate of gene flow from Gst; Na:
observed number of alleles; Ne: effective number of alleles; NPL: number of polymorphic loci; PPL: percentage of polymorphic loci.
2.3.3 古蔺牛皮茶居群亲缘关系聚类分析 利用
UPGMA (unweighted pair-group method with arith-
metic means)法, 得出聚类树状图(图 1)。在遗传相似
系数为 0.956时, 可以将 7个居群分成 3个组, 居群
A、居群 B 和居群 D 组成第 I 组, 居群 C 和居群 E
组成第 II组, 居群 F和居群 G组成第 III组。7个居
群体之间, 居群 A 和居群 B 的遗传相似系数最大,
为 0.981; 居群 E和居群 G的遗传相似系数最小, 为
0.879; 表明居群 A和居群 B之间亲缘关系最近, 而
居群 E和居群 G亲缘关系最远。
图 1 基于 ISSR分子标记和 Jaccard遗传相似性系数的
亲缘关系 UPGMA聚类图
Fig. 1 UPGMA dendrogram of seven Gulin-niupicha
populations based on ISSR
2124 作 物 学 报 第 40卷
2.4 形态学特征与遗传距离的相关性分析
利用 Mantel 测试方法对形态学特征矩阵和
ISSR 分子标记数据矩阵作相关性分析。显示, 在形
态学特征和遗传距离之间不存在相关性, 其 Mantel
相关系数 r=0.03。
表 9 不同古蔺牛皮茶居群间的遗传相似系数
Table 9 Genetic similarity coefficient between populations of
Gulin-niupicha
居群
Population
A B C D E F G
A 1
B 0.981 1
C 0.953 0.959 1
D 0.949 0.966 0.980 1
E 0.921 0.935 0.962 0.959 1
F 0.920 0.919 0.920 0.919 0.897 1
G 0.918 0.921 0.906 0.919 0.879 0.980 1
3 讨论
3.1 古蔺牛皮茶形态学特征与品质生化成分
古蔺牛皮茶在树型、树姿、成熟叶片和新梢形
状上都表现出多样性, 很多地区茶树地方种质资源
都表现出这一特征。王春梅等[14]在研究崇州枇杷茶
野生大茶树种质资源时, 发现居群内变异类型较多,
不同类型茶树间差异显著, 树体、芽叶和成熟新梢
等生物学特征均表现出多样性; 蒋会兵等[15]对云南
10 个地区的 830 份茶树种质资源分析发现, 云南茶
树种质资源具有丰富的表型遗传多态性。茶树在漫
长的历史过程中, 经历了古地质气候的变迁, 形成
了自己独特的生长发育规律和遗传特性。了解这些
特征、特性,可为种质资源的鉴定和评介提供依据,
同时在茶树栽培和育种中综合运用各项技术 ,以实
现茶叶的优质、高产、高效[16]。本研究对古蔺牛皮
茶的形态学性状的初步探索, 积累了一些数据, 对
该资源的鉴定、评价与利用具有一定的指导意义。
但是, 需对其进行长期深入的研究, 才能充分掌握
其特征特性和开发利用价值。
茶叶生化成分组成及其含量是茶叶色、香、味形成
的物质基础, 也是茶叶品质鉴定的重要指标之一[17-18]。
前人通过生化成分测定, 已鉴定出众多品质优异的
茶树资源材料[19-21]。古蔺牛皮茶群体中新梢品质生
化成分呈现出特异和多样的特点, 7个供试居群中, B
和 A 居群的茶多酚含量较高(春梢>27%, 夏梢>31%),
且儿茶素含量也高(春梢>150 mg g–1, 夏梢>190 mg
g–1); 居群 D和 C的春茶游离氨基酸总量高于 4.5%。
酚氨比值是鉴定茶叶适制性的重要依据, 一般认为,
酚氨比值小于 8适宜制绿茶; 酚氨比值在 8~15之间,
红绿茶兼制; 大于 15 则适制红茶[22]。7 个居群的春
茶比值值均在 3.84~16.95 之间, 表明古蔺牛皮茶可
以用来选育优质绿茶、红茶品种或红绿兼制品种。
然而 ,茶树的生长发育和代谢受诸多环境因素的影
响, 内质生化成分也会随地理、气候、发育阶段不
同而改变。因此, 对古蔺牛皮茶深入研究才能挖掘群
体中有价值的种质资源, 而对现有古蔺牛皮茶资源
进行有效的保护是深入研究和开发利用的前提。
3.2 古蔺牛皮茶居群的遗传多态性和遗传结构
本研究用 15对 ISSR引物对 76份古蔺牛皮茶材
料的遗传多态性进行分析 ,多态性位点百分比为
90.4%, 高于季鹏章等[23]利用 ISSR 研究云南古树茶
10个居群的多态性位点百分比(56.5%~90.9%), 略低
于宁静等[24]研究的湘西“黄金茶”群体和李丹等[25]研
究的江华苦茶的多态性位点百分比(分别为 91.22%
和 95.40%), 远低于刘本英等[26]研究云南茶树资源
的多态性(98.9%)。表明古蔺牛皮茶基因组 DNA 具
有一般的多态性, 也反映出古蔺牛皮茶群体一定的
遗传变异程度。76 份古蔺牛皮茶材料的平均 Nei’s
基因多样性指数(H)为 0.254, 平均 Shannon’s信息指
数(I)为 0.392, 比姚明哲等 [27]研究我国茶树无性系
品种多样性指数(H为 0.23; I为 0.38)略高, 这是由于
我国选育茶树品种时, 同一地区的大部分育成品种
都源于遗传背景比较相似的地方群体或亲缘关系比
较近的亲本 , 导致遗传基础相对单一; 同时 , 良种
的繁育主要采用无性繁殖技术, 也会导致无性系茶
树遗传多样性较低。宁静等[24]研究的湘西“黄金茶”
地方群体的多态性指数(H 为 0.30, I 为 0.45)和李丹
等[25]研究的江华苦茶的多态性指数(H 为 0.38; I 为
0.56)都比古蔺牛皮茶居群高, 尤其是后者, 表明古
蔺牛皮茶的在基因上多态性并不是很高。作为一个
地方特有的茶树居群, 古蔺牛皮茶处于野生、半野
生和栽培状态, 茶树的来源和生长发育已受到一定
的人为影响, 比如茶农对具有优良农艺性状茶树会
进行保护和培育, 而对农艺性状较差的茶树则较少
关注, 这种人工选择会导致古蔺牛皮茶居群遗传背
景变窄, 从而降低居群的遗传多态性 [28], 这可能是
古蔺牛皮茶对比湘西“黄金茶”群体和江华苦茶群体
表现出较低基因多态性的原因之一。
植物居群的遗传结构是由一系列的作用形成的,
第 12期 刘绍杰等: 古蔺牛皮茶种质资源遗传多态性 2125
包括物种的长期进化(如分布的变化, 栖息地的分裂
和种群隔离)、突变、繁殖体系以及基因流动和选择
等[29]。表型变异是基因型和环境共同作用的结果, 丰
富的表型变异蕴藏着一定的遗传变异[30]。本研究中古
蔺牛皮茶居群间的遗传分化系数(Gst)是 0.198, 这与
杨阳等[31]利用 EST-SSR 标记研究黄金茶群体遗传多
样性及遗传分化分析结果相似。而对应的群体每代迁
移数即基因流动估值(Nm)为 2.022, 表现出中度的基
因流动性。Wright [32]认为, 如果居群间基因流指数
Nm>1, 基因流便能发挥均质化作用, 可有效防止不
同地区亚居群间遗传分化的产生; 反之如果 Nm<1, 则
表示各亚居群间基因流受阻, 居群走向遗传分化。本
研究中古蔺牛皮茶各居群间的基因流指数大于 1, 说
明整个群体内遗传分化较低。不同区域居群之间的分
化程度比较低, 也表明地理位置对其选择压力不大。
3.3 遗传距离与形态学特征的相关性
本研究中, 古蔺牛皮茶基于 ISSR标记的遗传距
离与形态学特征之间未表现出相关性。类似的结果
在一些野生植物居群中也出现过, Lopes等[33]在研究
葡萄牙野生杨梅居群的遗传多态性时, 发现形态学
性状和分子遗传特征之间不存在相关性 (r=0.09),
Tantasawat等[34]在研究一年生豇豆时也发现类似的
结果。造成这种结果的原因是多方面的 , Pirkhezri
等 [35]认为, 生物表现出来的外形特征可能是由多对
等位基因共同决定的, 这些等位基因都会表现出相
同或者相似的某一性状, 而这些等位基因和表型性
状之间并不存在必然的相关性。此外, 本试验选择
的 ISSR引物本身存在一定局限性, 不可能将所有的
决定表型性状的等位基因都扩增出来, 茶树生长的
特殊环境也会对茶树生长发育产生影响, 从而影响
茶树性状特征的表现。
4 结论
古蔺牛皮茶在形态学特征和品质生化成分上呈
现出多态性, 但居群的平均Nei’s基因多样性指数(H)
为 0.254, 平均 Shannon’s信息指数(I)为 0.392, 表明
遗传多态性较低。7 个居群的 UPGMA 遗传相似性
聚类显示, 在相似系数为 0.956 处可将之分为 3 个
组。居群间的遗传分化系数(Gst)是 0.198, 证明古蔺
牛皮茶居群的遗传多样性主要分布在自然居群内。
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